Name: a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

ويشكر المؤلفان يوكو إيشيدا (جامعة جونتيندو) على إنتاج نواقل فيروس AAV وكيسارا هوشينو (جامعة جونتيندو) على المساعدة التقنية. تم دعم هذه الدراسة من قبل JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 إلى T.F. ؛ JP20K07743 إلى M.K. ؛ JP21H02592 إلى H.H.) والبحث العلمي في مجال الابتكار "الرنين الحيوي" (JP18H04743 إلى H.H.). تم دعم هذه الدراسة أيضا من قبل الوكالة اليابانية للبحث والتطوير الطبي (AMED) (JP21dm0207112 إلى T.F. و H.H.) ، و Moonshot R & D من الوكالة اليابانية للعلوم والتكنولوجيا (JST) (JPMJMS2024 إلى H.H.) ، والبحوث الموجهة نحو الانصهار للعلوم والتكنولوجيا المدمرة (FOREST) من JST (JPMJFR204D إلى H.H.) ، والمنح المقدمة من معهد أبحاث أمراض الشيخوخة في كلية الطب بجامعة جونتيندو (X2016 إلى K.Y. ؛ X2001 إلى H.H.)، ومشروع العلامة التجارية للمدارس الخاصة.

تمت الموافقة على جميع التجارب من قبل اللجان المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات في جامعة جونتيندو (الموافقة رقم 2021245 ، 2021246) وتم إجراؤها وفقا للمبادئ التوجيهية الأساسية للسير السليم للتجارب على الحيوانات من قبل مجلس العلوم الياباني (2006). هنا ، تم استخدام الفئران الذكور C57BL / 6J التي تم حقنها ب...

<ol>
	<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+light+microscopy/electron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method,+ScaleSF.">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601 (2022).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy.">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li><li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre/lox+system.">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).</li><li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites.">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li><li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons:+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system.">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex.">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li><li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat:+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors.">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).</li><li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum.">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons.">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331 (2016).</li></ol>

الخطوات الحاسمة في إطار البروتوكول هناك بعض الخطوات الحاسمة في البروتوكول التي ينبغي إجراؤها بأقصى درجات الحذر للحصول على نتائج ذات مغزى. التثبيت الموحد للعينات أمر حتمي للتصوير 3D داخل الأنسجة واسعة النطاق. يجب أن تحتوي العدسة الموضوعية والعينة وسيولة الغمر على مثيل محجوز مطا...

وقد حسنت طرق إزالة الأنسجة التصوير المستقل عن العمق للعينات البيولوجية والسريرية باستخدام المجهر الضوئي، مما يسمح باستخراج المعلومات الهيكلية عن الأنسجة السليمة 1,2. يمكن لتقنيات المقاصة البصرية أيضا تسريع وتقليل تكلفة التحليل النسيجي. حاليا ، تتوفر ثلاثة طرق رئيسية للتطهير: الطرق المحبة للماء ، الكارهة للماء ، والهيدروجيل القائم على 1,2. النهج المحبة للماء تفوق في الحفاظ على إشارات التألق وسلامة الأنسجة وهي أقل سمية مقارنة بالنهجين الآخرين 3,4.
وتحتل طريقة المقاصة المحبة للماء، ScaleS، موقعا مميزا من خلال الحفاظ على السلامة الهيكلية والجزيئية فضلا عن قدرتها القوية على التطهير (طيف التطهير والحفظ)5. في دراسة سابقة ، طورنا بروتوكول تطهير سريع ومتساوي القياس ، Scal eSF ، لشرائح الأنسجة (سمك ~ 1 مم) عن طريق تعديل إجراء المقاصة في ScaleS6. يتطلب بروتوكول التطهير هذا حضانة متسلسلة لشرائح الدماغ في ثلاثة حلول لمدة 10.5-14.5 ساعة. تتميز هذه الطريقة بطيف عالي التطهير والحفظ ، وهو متوافق حتى مع تحليل المجهر الإلكتروني (EM) (الشكل التكميلي 1) ، مما يسمح بالتصوير ثلاثي الأبعاد (3D) عالي الدقة متعدد النطاقات مع إعادة بناء إشارة دقيقة6. وبالتالي ، يجب أن يكون ScaleSF فعالا خاصة في الدماغ ، حيث تقوم الخلايا العصبية بوضع عمليات وفيرة ذات طول هائل ، وترتيب هياكل تحت الخلايا الدقيقة المتخصصة لنقل المعلومات واستقبالها. استخراج المعلومات الهيكلية مع المقاييس من الدائرة إلى المستويات دون الخلوية على الخلايا العصبية مفيد جدا نحو فهم أفضل لوظائف الدماغ.
هنا ، نقدم بروتوكولا مفصلا لتصور الهياكل العصبية بمقاييس من الميزوسكوبيك / الدائرة إلى المستوى المجهري / دون الخلوي باستخدام ScaleSF. ويشمل البروتوكول إعداد الأنسجة، وتوضيح الأنسجة، والتعامل مع الأنسجة التي تم تطهيرها، والتصوير المجهري بالليزر البؤري (CLSM) للأنسجة التي تم تطهيرها. يركز بروتوكولنا على استجواب الهياكل العصبية من الدائرة إلى مقاييس المكونات دون الخلوية. للحصول على إجراء مفصل لإعداد المحاليل والحقن المجسمة لناقلات الفيروسات المرتبطة بالغدية (AAV) في أدمغة الفئران ، راجع Miyawaki et al. 20167 و Okamoto et al. 20218 ، على التوالي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16x multi-immersion objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TaKaRa Bio</td>
			<td>L03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13407-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06286-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-cyclodextrin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essential</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>ver. 9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27575-31</td>
			<td>10x PBS(&#8211;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31233-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating tissue slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales

يتم توفير بروتوكول مفصل هنا لتصور الهياكل العصبية من المستويات المسكوبية إلى المجهرية في أنسجة المخ. يتم تصور الهياكل العصبية التي تتراوح من الدوائر العصبية إلى الهياكل العصبية دون الخلوية في شرائح دماغ الفئران التي تم تطهيرها بصريا باستخدام ScaleSF. طريقة التطهير هذه هي نسخة معدلة من ScaleS وهي طريقة إزالة الأنسجة المحبة للماء لشرائح الأنسجة التي تحقق قدرة تطهير قوية بالإضافة إلى مستوى عال من الحفاظ على إشارات التألق والسلامة الهيكلية. تم تصميم غرفة تصوير ثلاثية الأبعاد (3D) مطبوعة قابلة للتخصيص للتركيب الموثوق به لأنسجة المخ التي تم تطهيرها. تم إصلاح أدمغة الفئران التي تم حقنها بناقل فيروس مرتبط بالغدي يحمل جين بروتين فلورسنت أخضر محسن بنسبة 4٪ بارافورمالديهايد ومقطعة إلى شرائح بسماكة 1 مم باستخدام قطاعة أنسجة مهتزة. تم تطهير شرائح الدماغ باتباع بروتوكول المقاصة، والذي يتضمن حضانات متسلسلة في ثلاثة حلول، وهي محلول Sca l eS0، ومحلول ملحي عازل للفوسفات (–)، ومحلول ScaleS4، بإجمالي 10.5-14.5 ساعة. تم تركيب شرائح الدماغ التي تم تطهيرها على غرفة التصوير وتضمينها في هلام الأغاروز بنسبة 1.5٪ المذاب في محلول ScaleS4D25 (0). تم الحصول على صورة 3D للشرائح باستخدام مجهر مسح ليزر متحد البؤرة مجهز بعدسة موضوعية متعددة الغمر لمسافة عمل طويلة. بدءا من التصوير العصبي المنظاري ، نجحنا في تصور الهياكل العصبية الدقيقة تحت الخلوية ، مثل العمود الفقري التغصني والبوتونات المحورية ، في شرائح الدماغ التي تم تطهيرها بصريا. هذا البروتوكول من شأنه أن يسهل فهم الهياكل العصبية من الدائرة إلى مقاييس المكونات دون الخلوية.

تم تحقيق التطهير البصري لشريحة دماغ الماوس بسماكة 1 مم باستخدام هذا البروتوكول. يمثل الشكل 1B صور انتقال شريحة دماغ الفأر قبل وبعد العلاج المقاصة. جعلت طريقة تطهير الأنسجة شريحة دماغ فأر بسماكة 1 مم شفافة. تم العثور على توسع طفيف في الأحجام النهائية لشرائح الدماغ بعد الحضانة في محل?...

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

يوفر البروتوكول طريقة مفصلة للتصوير العصبي في شريحة الدماغ باستخدام طريقة مسح الأنسجة ، ScaleSF. ويشمل البروتوكول إعداد أنسجة المخ، وتوضيح الأنسجة، والتعامل مع الشرائح التي تم تطهيرها، والتصوير المجهري بالليزر البؤري للهياكل العصبية من المستويات المجهرية إلى المجهرية.

طريقة تطهير الأنسجة للتصوير العصبي من المقاييس المتوسطة إلى المجهرية

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

من شأن بروتوكولنا أن يسهل التحقيق في الهياكل العصبية من الدائرة إلى مقاييس المكونات وهو أمر ضروري لفهم وظائف الدماغ بشكل أفضل. تمارس تقنية التطهير الخاصة بنا ، ScaleSF ، قدرة تطهير قوية ، بالإضافة إلى مستوى عال من الحفاظ على الأنسجة المطلوبة للتصور المتزامن لكل من الهياكل الكبيرة والصغيرة. بروتوكولنا فعال بشكل خاص في الدماغ حيث تظهر الخلايا العصبية عمليات معقدة وروابط هائلة وترتب هياكل تحت الخلايا الدقيقة المتخصصة.قبل البدء في التجربة ، قم بإعداد حلول Sca / eS كما هو موضح في هذا الجدول وقم بتغطية العينات برقائق معدنية. ابدأ الإجراء بإضافة ثمانية ملليلترات لكل من حلول ScaleS0 و ScaleS4 إلى بئرين منفصلين من صفيحة زراعة خلايا البئر الستة وقم بتسخين الصفيحة مسبقا إلى 37 درجة مئوية في حاضنة. انقل شرائح الدماغ إلى محلول ScaleS0 المسخن مسبقا باستخدام ملعقة واحتضن الشرائح لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في حاضنة تهتز عند 90 دورة في الدقيقة.بعد ذلك ، انقل شرائح الدماغ المتخلل في ثمانية ملليلترات من PBS ناقص في صفيحة زراعة خلايا من ستة آبار واغسلها لمدة 15 دقيقة عن طريق الاحتفاظ بها في اهتزاز مداري عند 40 إلى 60 دورة في الدقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين. بعد ذلك ، انقل شرائح الدماغ في ثمانية ملليلترات من محلول ScaleS4 المسخن مسبقا واحتضنها لمدة ثماني إلى 12 ساعة عند 90 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية.لإعداد الغرفة ، 3D طباعة إطار الغرفة ومحولات مرحلة المجهر. قم بتوصيل إطار الغرفة بغطاء باستخدام مادة لاصقة حساسة للضغط. تحضير 1.5٪ من الأغاروز في محلول ScaleS4D25 (0).اخلطي المحلول وضعيه في الميكروويف حتى يذوب الأغاروز بالكامل. ثم اترك المحلول يبرد إلى 37 درجة مئوية. قم بتركيب شريحة الدماغ التي تم تطهيرها على الغطاء السفلي لغرفة التصوير باستخدام ملعقة.قم بإزالة المحلول الزائد من الشريحة التي تم تطهيرها باستخدام منديل نظيف. أضف جل ScaleS4 إلى شريحة الدماغ باستخدام ماصة دقيقة لملء غرفة التصوير. ضع غطاء آخر في الأعلى باستخدام ملقط متبوعا بقطعة من المناديل الورقية وشريحة زجاجية.انقل غرفة التصوير إلى الثلاجة عند أربع درجات مئوية. ضع أوزانا معدنية على الشريحة الزجاجية واتركها لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة المادة من غرفة التصوير وامسح الجل الزائد.ضع غرفة التصوير في طبق بتري زجاجي بحجم 60 ملم وقم بتوصيل حافة غرفة التصوير في نقاط متعددة بالطبق باستخدام مادة لاصقة حساسة للضغط. صب محلول ScaleS4 في الطبق ورجه بلطف لمدة ساعة واحدة عند 40 إلى 60 دورة في الدقيقة عند 20 إلى 25 درجة مئوية. استبدله بمحلول منعش وأزل فقاعات الهواء على سطح الجل عن طريق كشط السطح بلطف باستخدام طرف ماصة.قم بتركيب غرفة التصوير على مرحلة المجهر. قم بإعداد مجهر مسح بالليزر البؤري مجهز بعدسة موضوعية متعددة الغمر بمسافة عمل 2.5 ملم وتكبير 16x وفتحة رقمية 0.60. قم بتشغيل جميع معدات التصوير ذات الصلة ، مثل محطة العمل والمجهر والماسح الضوئي والليزر ومصباح الزئبق وتشغيل برنامج تصوير.اضبط طوق التصحيح للعدسة الموضوعية متعددة الغمر على 1.47. اغمر العدسة الموضوعية في المحلول واتركها تقترب من الشريحة ببطء. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء المحاصرة على طرف العدسة الموضوعية.ابحث عن المناطق ذات الأهمية في الأنسجة التي تم تطهيرها باستخدام التألق اللاإرادي. لتعيين معلمات اكتساب الصورة، أولا، حدد عمق البت للحصول على الصورة مع زيادة حجم الصورة مع البت. ثم اضبط الطول الموجي للكشف وفقا لطيف الانبعاثات.اضبط دقة XY وسرعة المسح الضوئي وحجم الثقب. اضبط أيضا طاقة الليزر ، وكسب مضخم الصوت الكاشف ، والإزاحة حتى يتم الحصول على صورة مناسبة. حدد حجم البلاط استنادا إلى حجم عائد الاستثمار، مما يضمن التقاط كامل طول وعرض عائد الاستثمار.انتقل عبر الأنسجة في جميع المستويات واضبط نقاط البداية والنهاية للمكدس. اضبط حجم الخطوة Z، وفقا لدقة Z المطلوبة. جمع الصور ومعالجتها باستخدام برنامج تحليل الصور.باستخدام هذا البروتوكول ، تم تحقيق تطهير بصري لشريحة دماغ الفأر بسماكة ملليمتر واحد. أظهر تعبير EGFP في القشرة الدماغية للفئران PV-FGL أنه تم الحفاظ على التألق والسلامة الهيكلية للأنسجة. تسبب عدم تطابق معامل الانكسار الناجم عن الانحرافات في فقدان ملحوظ لسطوع الصورة ودقة الخلايا العصبية الإيجابية EGFP.تم تصور هذه الخلايا العصبية بوضوح باستخدام المجهر الضوئي بالليزر البؤري عندما تم ضبط طوق التصحيح ليتناسب مع حل ScaleS4 هذا. تمت إعادة بناء 3D للخلايا العصبية المسماة EGFP في القشرة الحسية الجسدية الأولية للفأر في شريحة دماغية بسماكة ملليمتر واحد. شوهدت العرش الشجيرية الفردية المزينة بأشواك تغصنية في تكبير أعلى.كما لوحظت في الشرائح تشجير المحطة الطرفية للمحور المحوري والبوتونات المحورية. تعد مطابقة المؤشر العاكس بين سائل التصوير وعدسة الكائن أمرا بالغ الأهمية للتصوير 3D في الأنسجة التي تم تطهيرها. من شأن تقنيتنا أن تسهل دمج بنية الخلايا العصبية من الدائرة إلى مقاييس المكونات ، مما يوفر رؤى حول آليات الخلايا العصبية ، ومعلومات المعالجة في الدماغ.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

الآلي Sholl تحليل الصرف متعلق بالخلايا العصبية رقمية على مستويات متعددة

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

الحفظ بالتبريد من كتل الأنسجة القشرية للجيل الثقافات متعلق بالخلايا العصبية التخصيب

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

فائقة الدقة التصوير من الخلايا العصبية الحويصلات كثيفة الأساسية

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

الحضانة لفترات طويلة الحادة العصبية الأنسجة للالكهربية والكالسيوم التصوير

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

ريويرينغ الخلايا العصبية: طريقة جديدة للتوسع نيوريت سريع والوظيفي اتصال الخلايا العصبية

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

طريقة إزالة الأنسجة الكارهة للماء لأنسجة دماغ الفئران

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

إعداد الكبار Drosophila melanogaster لتصوير الدماغ كله أثناء السلوك والمحفزات الاستجابات

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

ROS تصوير الخلايا الحية أثناء تطوير الخلايا العصبية

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

الاحتواء المناعي لشبكية العين الكاملة مع طريقة إزالة الأنسجة الوضوح

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...