Name: a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

Forfatterne takker Yoko Ishida (Juntendo University) for AAV vektorproduktion og Kisara Hoshino (Juntendo University) for teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af JSPS KAKENHI (JP20K07231 til K.Y.; JP21H03529 til T.F.; JP20K07743 til M.K.; JP21H02592 til H.H.) og videnskabelig forskning om innovativt område "Resonans Bio" (JP18H04743 til H.H.). Denne undersøgelse blev også støttet af Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 til T.F. og H.H.), Moonshot R&D fra Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 til H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) fra JST (JPMJFR204D til H.H.), Grants-in-Aid fra Research Institute for Diseases of Old Age ved Juntendo University School of Medicine (X2016 til K.Y.; X2001 til H.H.) og Privatskolens brandingprojekt.

Alle forsøgene blev godkendt af de institutionelle dyrepleje- og brugsudvalg ved Juntendo University (godkendelse nr. 2021245, 2021246) og udført i overensstemmelse med grundlæggende retningslinjer for korrekt udførelse af dyreforsøg af Japans videnskabsråd (2006). Her blev mandlige C57BL /6J-mus injiceret med AAV-vektor, der bærer forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) gen og parvalbumin (PV) / myristoylation-EGFP-lipoproteinreceptor med lav densitet C-terminal bakterielt kunstigt kromosom (BAC) transgene...

<ol>
	<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+light+microscopy/electron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method,+ScaleSF.">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601 (2022).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy.">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li><li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre/lox+system.">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).</li><li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites.">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li><li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons:+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system.">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex.">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li><li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat:+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors.">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).</li><li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum.">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons.">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331 (2016).</li></ol>

Kritiske trin i protokollen Der er et par kritiske trin i protokollen, der skal udføres med største forsigtighed for at opnå meningsfulde resultater. Ensartet fiksering af prøver er afgørende for 3D-billeddannelse i store væv. Objektivlinsen, prøven og nedsænkningsvæsken skal have matchende RI. RI-mismatch blandt dem vil føre til stærkt forstyrret billeddannelse af EGFP-ekspressive celler i de ryddede hjerneskiver (figur 3). Justeringen af objektivlinsen til nedsænkningsv?...

Vævsrydningsmetoder har forbedret dybdeuafhængig billeddannelse af biologiske og kliniske prøver med lysmikroskopi, hvilket giver mulighed for ekstraktion af strukturelle oplysninger om intakt væv 1,2. Optiske clearingteknikker kan også potentielt fremskynde og reducere omkostningerne til histologisk analyse. I øjeblikket er der tre store clearingmetoder til rådighed: hydrofile, hydrofobe og hydrogelbaserede metoder 1,2. Hydrofile tilgange overgår i at bevare fluorescenssignaler og vævsintegritet og er mindre giftige sammenlignet med de to andre tilgange 3,4.
En hydrofil clearingmetode, ScaleS, har en karakteristisk position med sin bevarelse af strukturel og molekylær integritet samt potent clearingkapacitet (clearing-preservation spectrum)5. I en tidligere undersøgelse udviklede vi en hurtig og isometrisk clearingprotokol, ScaleSF, for vævsskiver (~ 1 mm tykkelse) ved at ændre clearingproceduren for ScaleS6. Denne clearingprotokol kræver sekventielle inkubationer af hjerneskiver i tre opløsninger i 10,5-14,5 timer. Metoden er udstyret med et højt clearingbevarende spektrum, som er kompatibelt selv med elektronmikroskopi (EM) analyse (supplerende figur 1), hvilket giver mulighed for multi-skala høj opløsning tredimensionel (3D) billeddannelse med nøjagtig signalrekonstruktion6. Således bør ScaleSF være effektiv især i hjernen, hvor neuronale celler udarbejder sprudlende processer af enorm længde og arrangerer specialiserede fine subcellulære strukturer til transmission og modtagelse af information. Ekstraktion af strukturel information med skalaer fra kredsløb til subcellulære niveauer på neuronale celler er ret nyttig til bedre forståelse af hjernefunktioner.
Her giver vi en detaljeret protokol til at visualisere neuronale strukturer med skalaer fra det meskopiske / kredsløb til mikroskopisk / subcellulært niveau ved hjælp af ScaleSF. Protokollen omfatter vævsforberedelse, vævsafklaring, håndtering af ryddet væv og konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) billeddannelse af ryddet væv. Vores protokol fokuserer på at forhøre neuronale strukturer fra kredsløb til subcellulære komponentskalaer. For en detaljeret procedure til fremstilling af opløsninger og stereotaxisk injektion af adeno-associerede virus (AAV) vektorer i musehjerner henvises til henholdsvis Miyawaki et al. 20167 og Okamoto et al. 20218.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16x multi-immersion objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TaKaRa Bio</td>
			<td>L03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13407-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06286-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-cyclodextrin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essential</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>ver. 9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27575-31</td>
			<td>10x PBS(&#8211;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31233-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating tissue slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales

En detaljeret protokol er tilvejebragt her for at visualisere neuronale strukturer fra mesoskopiske til mikroskopiske niveauer i hjernevæv. Neuronale strukturer, der spænder fra neurale kredsløb til subcellulære neuronale strukturer, visualiseres i musehjerneskiver optisk ryddet med ScaleSF. Denne clearingmetode er en modificeret version af ScaleS og er en hydrofil vævsrensningsmetode til vævsskiver, der opnår potent rydningsevne samt et højt niveau af bevarelse af fluorescenssignaler og strukturel integritet. Et tilpasseligt tredimensionelt (3D) -printet billedbehandlingskammer er designet til pålidelig montering af ryddet hjernevæv. Musehjerner injiceret med en adeno-associeret virusvektor, der bærer forbedret grønt fluorescerende proteingen, blev fikseret med 4% paraformaldehyd og skåret i skiver med 1 mm tykkelse med en vibrerende vævsskiver. Hjerneskiverne blev ryddet ved at følge clearingprotokollen, som inkluderer sekventielle inkubationer i tre opløsninger, nemlig ScaleS0-opløsning, phosphatbuffer saltvand (–) og ScaleS4-opløsning i alt 10,5-14,5 timer. De rensede hjerneskiver blev monteret på billeddannelseskammeret og indlejret i 1,5% agarosegel opløst i ScaleS4D25(0)-opløsning. 3D-billedoptagelsen af skiverne blev udført ved hjælp af et konfokalt laserscanningsmikroskop udstyret med en multi-immersion objektiv linse med lang arbejdsafstand. Begyndende med mesoskopisk neuronal billeddannelse lykkedes det os at visualisere fine subcellulære neuronale strukturer, såsom dendritiske rygsøjler og axonale boutoner, i de optisk ryddede hjerneskiver. Denne protokol ville lette forståelsen af neuronale strukturer fra kredsløb til subcellulære komponentskalaer.

Optisk rydning af en musehjerneskive med en tykkelse på 1 mm blev opnået ved hjælp af denne protokol. Figur 1B viser transmissionsbilleder af en musehjerneskive før og efter rydningsbehandlingen. Vævsrensningsmetoden gjorde en 1 mm tyk musehjerneskive gennemsigtig. En lille udvidelse i endelige størrelser af hjerneskiver blev fundet efter inkubationen i clearingopløsningen i 12 timer (lineær ekspansion: 102,5% ± 1,3%). Bevarelsen af fluorescens og vævets strukturelle integritet blev vurderet m...

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Protokollen giver en detaljeret metode til neuronal billeddannelse i hjerneskive ved hjælp af en vævsrensningsmetode, ScaleSF. Protokollen omfatter hjernevævsforberedelse, vævsafklaring, håndtering af ryddede skiver og konfokal laserscanning mikroskopi billeddannelse af neuronale strukturer fra mesoskopiske til mikroskopiske niveauer.

En vævsrensningsmetode til neuronal billeddannelse fra mesoskopisk til mikroskopisk skala

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Vores protokol ville lette undersøgelsen af neuronale strukturer fra kredsløb til komponentskalaer, hvilket er afgørende for bedre forståelse af hjernefunktioner. Vores clearingteknik, ScaleSF udøver potent clearing kapacitet, samt et højt niveau af vævsbevarelse, der er nødvendig for samtidig visualisering af både store og små skala strukturer. Vores protokol er især effektiv i hjernen, hvor neuronale celler udviser udførlige processer, enorme forbindelser og arrangerer specialiserede fine subcellulære strukturer.Før forsøget påbegyndes, skal du forberede Sca/eS-opløsninger som vist i denne tabel og dække prøverne med folie. Start proceduren ved at tilsætte otte milliliter hver af ScaleS0- og ScaleS4-opløsningerne til to separate brønde af en seks-brøndcellekulturplade og forvarm pladen til 37 grader Celsius i en inkubator. Overfør hjerneskiverne til den forvarmede ScaleS0-opløsning med en spatel, og inkuber skiverne i to timer ved 37 grader Celsius i en rystende inkubator ved 90 o / min.Overfør derefter de permeabiliserede hjerneskiver i otte milliliter PBS minus i en seks brøndcellekulturplade og vask i 15 minutter ved at holde i en orbitalryster ved 40 til 60 o / min. Gentag dette trin to gange. Overfør derefter hjerneskiverne i otte milliliter forvarmet ScaleS4-opløsning og inkuberes i otte til 12 timer ved 90 o / min ved 37 grader Celsius.Til kammerforberedelse 3D-print kammerrammen og mikroskopstadieadaptere. Fastgør kammerrammen til en dækslip ved hjælp af et trykfølsomt klæbemiddel. Der fremstilles 1,5 % agarose i ScaleS4D25(0)-opløsning.Bland opløsningen og mikrobølge den, indtil agarosen er helt opløst. Lad derefter opløsningen afkøle til 37 grader Celsius. Monter den ryddede hjerneskive på billedkammerets bunddæksler med en spatel.Fjern overskydende opløsning fra den ryddede skive ved hjælp af et rent væv. Tilsæt ScaleS4-gelen til hjerneskiven ved hjælp af en mikropipette til at fylde billedkammeret. Læg en anden dækslip ovenpå med tang efterfulgt af et stykke silkepapir og et glasglas.Overfør billedkammeret til et køleskab ved fire grader Celsius. Placer metalvægte på glasglasset og lad dem stå i 30 minutter. Efter inkubationen fjernes materialet fra billedkammeret og tørres overskydende gel af.Anbring billedkammeret i en 60 millimeter glass petriskål, og fastgør kanten af billedkammeret flere steder til skålen med et trykfølsomt klæbemiddel. Hæld ScaleS4-opløsningen i fadet og ryst forsigtigt i en time ved 40 til 60 o / min ved 20 til 25 grader Celsius. Udskift med frisk opløsning og fjern luftbobler på geloverfladen ved forsigtigt at skrabe overfladen ved hjælp af en pipettespids.Monter billedkammeret på et mikroskoptrin. Forbered et konfokalt laserscanningsmikroskop udstyret med en multi-immersion objektiv linse på 2,5 millimeter arbejdsafstand, 16x forstørrelse og 0,60 numerisk blænde. Tænd for alt relevant billedbehandlingsudstyr, såsom arbejdsstation, mikroskop, scanner, lasere, kviksølvlampe, og start en billedbehandlingssoftware.Indstil korrektionskraven på objektivlinsen med multi-nedsænkning til 1,47. Nedsænk objektivlinsen i opløsningen, og lad den nærme sig skiven langsomt. Fjern alle luftbobler, der er fanget på spidsen af objektivlinsen.Find regioner af interesse i ryddet væv ved hjælp af epifluorescens. For at indstille billedoptagelsesparametre skal du først bestemme bitdybden for billedoptagelse, når billedets størrelse øges med biten. Indstil derefter detektionsbølgelængden i henhold til emissionsspektret.Indstil XY-opløsning, scanningshastighed og pinhole-størrelse. Juster også lasereffekten, detektorforstærkerens forstærkning og forskydning, indtil der opnås et passende billede. Bestem flisestørrelsen baseret på størrelsen af ROI, og sørg for, at hele længden og bredden af ROI fanges.Naviger gennem vævet i alle planer, og indstil stakkens start og slutpunkter. Indstil Z-trinstørrelsen i henhold til den ønskede Z-opløsning. Saml billederne og behandl dem ved hjælp af billedanalysesoftware.Ved hjælp af denne protokol blev optisk rydning af en musehjerneskive med en millimeter tykkelse opnået. EGFP-ekspression i hjernebarken hos PV-FGL-mus viste, at vævets fluorescens og strukturelle integritet blev bevaret. Brydningsindeks mismatch induceret aberrationer forårsagede et mærkbart tab af billedets lysstyrke og opløsning af EGFP positive neuroner.Disse neuroner blev tydeligt visualiseret med det konfokale laserscanningsmikroskop, da korrektionskraven blev justeret til at matche denne ScaleS4-opløsning. 3D-rekonstruktion af EGFP-mærkede neuroner i musens primære somatosensoriske cortex blev udført i en en millimeter tyk hjerneskive. Individuelle dendritiske arbors dekoreret med dendritiske rygsøjler blev set ved højere forstørrelse.Axon terminal arborization og axonal boutons blev også observeret i skiverne. Reflekterende indeksmatchning mellem billedvæske og objektlinse er afgørende for 3D-billeddannelse i ryddet væv. Vores teknik ville lette integrationen af neuronstruktur fra kredsløb til komponentskalaer, hvilket giver indsigt i neuronmekanismer, information om behandling i hjernen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-opløsning Imaging af neuronale Dense-core blærer

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Langvarig Inkubation af akut neuronalt væv for Elektrofysiologi og Calcium-billeddannelse

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Rewiring Neuronal Circuits: En Ny Metode til Hurtig Neuritforlængelse og Funktionel Neuronal Forbindelse

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

En hydrofobisk vævsclearingmetode til rottehjernevæv

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Forberedelse voksen Drosophila melanogaster til hele hjernen Imaging under adfærd og Stimuli Svar

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

ROS Live Cell Imaging Under Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Immunostaining af helmonteringskinner med KLARHED Vævsclearingmetoden

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...