Name: a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

De auteurs bedanken Yoko Ishida (Juntendo University) voor AAV vectorproductie en Kisara Hoshino (Juntendo University) voor technische assistentie. Deze studie werd ondersteund door JSPS KAKENHI (JP20K07231 tot K.Y.; JP21H03529 naar T.F.; JP20K07743 naar M.K.; JP21H02592 naar H.H.) en Wetenschappelijk onderzoek naar innovatief gebied "Resonantie Bio" (JP18H04743 tot H.H.). Deze studie werd ook ondersteund door het Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 tot T.F. en H.H.), Moonshot R&D van het Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 tot H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) van JST (JPMJFR204D tot H.H.), Grants-in-Aid van het Research Institute for Diseases of Old Age aan de Juntendo University School of Medicine (X2016 tot K.Y.; X2001 tot H.H.), en het Private School Branding Project.

Alle experimenten werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Juntendo University (Approval No. 2021245, 2021246) en uitgevoerd in overeenstemming met de Fundamental Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments door de Science Council of Japan (2006). Hier werden mannelijke C57BL/6J-muizen geïnjecteerd met AAV-vector met verbeterd groen fluorescerend eiwit (EGFP) gen en parvalbumine (PV)/myristoylation-EGFP-low-density lipoproteïne receptor C-terminale bacteriële kunstmatige chro...

<ol>
	<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+light+microscopy/electron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method,+ScaleSF.">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601 (2022).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy.">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li><li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre/lox+system.">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).</li><li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites.">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li><li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons:+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system.">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex.">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li><li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat:+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors.">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).</li><li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum.">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons.">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331 (2016).</li></ol>

Kritieke stappen binnen het protocol Er zijn een paar kritieke stappen in het protocol die met de grootste voorzichtigheid moeten worden uitgevoerd om zinvolle resultaten te verkrijgen. Uniforme fixatie van monsters is noodzakelijk voor 3D-beeldvorming in grootschalige weefsels. De objectieflens, het monster en de onderdompelingsvloeistof moeten overeenkomende RI hebben. RI-mismatch tussen hen zal leiden tot zeer verstoorde beeldvorming van EGFP-expresserende cellen in de gewiste hersenplakken (<stron...

Weefselopruimingsmethoden hebben de diepte-onafhankelijke beeldvorming van biologische en klinische monsters met lichtmicroscopie verbeterd, waardoor structurele informatie over intacte weefsels kan worden geëxtraheerd 1,2. Optische clearingtechnieken kunnen mogelijk ook versnellen en de kosten voor histologische analyse verlagen. Momenteel zijn er drie belangrijke clearingbenaderingen beschikbaar: hydrofiele, hydrofobe en hydrogel-gebaseerde methoden 1,2. Hydrofiele benaderingen overtreffen in het behoud van fluorescentiesignalen en weefselintegriteit en zijn minder toxisch in vergelijking met de andere twee benaderingen 3,4.
Een hydrofiele clearingmethode, ScaleS, heeft een onderscheidende positie met zijn behoud van structurele en moleculaire integriteit en krachtige clearingcapaciteit (clearing-preservation spectrum)5. In een eerdere studie ontwikkelden we een snel en isometrisch clearingprotocol, ScaleSF, voor weefselplakken (~ 1 mm dikte) door de clearingprocedure van ScaleS6 te wijzigen. Dit clearingprotocol vereist sequentiële incubaties van hersenplakken in drie oplossingen gedurende 10,5-14,5 uur. De methode is voorzien van een hoog clearing-preserveringsspectrum, dat zelfs compatibel is met elektronenmicroscopie (EM) -analyse (aanvullende figuur 1), waardoor multischaal hoge resolutie driedimensionale (3D) beeldvorming met nauwkeurige signaalreconstructiemogelijk is 6. ScaleSF zou dus effectief moeten zijn, vooral in de hersenen, waar neuronale cellen uitbundige processen van enorme lengte uitwerken en gespecialiseerde fijne subcellulaire structuren regelen voor het verzenden en ontvangen van informatie. Het extraheren van structurele informatie met schalen van circuit- tot subcellulaire niveaus op neuronale cellen is heel nuttig voor een beter begrip van hersenfuncties.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol om neuronale structuren te visualiseren met schalen van het mesoscopische / circuit tot microscopisch / subcellulair niveau met behulp van ScaleSF. Het protocol omvat weefselvoorbereiding, weefselzuivering, behandeling van gewiste weefsels en confocale laserscanmicroscopie (CLSM) beeldvorming van gewiste weefsels. Ons protocol richt zich op het ondervragen van neuronale structuren van circuit- tot subcellulaire componentschalen. Voor een gedetailleerde procedure voor de bereiding van de oplossingen en stereotaxische injectie van adeno-geassocieerde virus (AAV) vectoren in muizenhersenen, zie respectievelijk Miyawaki et al. 20167 en Okamoto et al. 20218.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16x multi-immersion objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TaKaRa Bio</td>
			<td>L03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13407-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06286-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-cyclodextrin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essential</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>ver. 9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27575-31</td>
			<td>10x PBS(&#8211;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31233-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating tissue slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales

Een gedetailleerd protocol wordt hier verstrekt om neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus in hersenweefsels te visualiseren. Neuronale structuren, variërend van neurale circuits tot subcellulaire neuronale structuren, worden gevisualiseerd in hersensneden van muizen die optisch zijn gewist met ScaleSF. Deze clearingmethode is een aangepaste versie van ScaleS en is een hydrofiele weefselzuiveringsmethode voor weefselplakken die krachtige clearingcapaciteit bereikt, evenals een hoog niveau van behoud van fluorescentiesignalen en structurele integriteit. Een aanpasbare driedimensionale (3D) geprinte beeldkamer is ontworpen voor betrouwbare montage van vrijgemaakte hersenweefsels. Muizenhersenen geïnjecteerd met een adeno-geassocieerde virusvector met verbeterd groen fluorescerend eiwitgen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en in plakjes van 1 mm dikte gesneden met een trillende weefselsnijder. De hersenschijfjes werden gewist door het clearingprotocol te volgen, dat sequentiële incubaties in drie oplossingen omvat, namelijk ScaleS0-oplossing, fosfaatbufferzoutoplossing (–) en ScaleS4-oplossing, voor een totaal van 10,5-14,5 uur. De gewiste hersenplakken werden op de beeldkamer gemonteerd en ingebed in 1,5% agarose-gel opgelost in ScaleS4D25(0)-oplossing. De 3D-beeldacquisitie van de plakjes werd uitgevoerd met behulp van een confocale laserscanmicroscoop uitgerust met een multi-immersie objectieflens van een lange werkafstand. Beginnend met mesoscopische neuronale beeldvorming, slaagden we erin om fijne subcellulaire neuronale structuren, zoals dendritische stekels en axonale boutons, in de optisch geklaarde hersenplakken te visualiseren. Dit protocol zou het begrip van neuronale structuren van circuit- tot subcellulaire componentschalen vergemakkelijken.

Optische clearing van een muis hersenschijf van 1 mm dikte werd bereikt met behulp van dit protocol. Figuur 1B geeft transmissiebeelden weer van een muizenhersenschijf voor en na de clearingbehandeling. De weefselopruimingsmethode maakte een 1 mm dik muizenhersenschijfje transparant. Een lichte uitbreiding van de uiteindelijke grootte van hersenschijfjes werd gevonden na de incubatie in de clearingoplossing gedurende 12 uur (lineaire expansie: 102,5% ± 1,3%). Het behoud van fluorescentie en structurele...

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Het protocol biedt een gedetailleerde methode van neuronale beeldvorming in hersensegmenten met behulp van een weefselzuiveringsmethode, ScaleSF. Het protocol omvat hersenweefselvoorbereiding, weefselverheldering, behandeling van gewiste plakjes en confocale laserscanmicroscopie beeldvorming van neuronale structuren van mesoscopische tot microscopische niveaus.

Een weefselzuiveringsmethode voor neuronale beeldvorming van mesoscopische tot microscopische schalen

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Ons protocol zou het onderzoek van neuronale structuren van circuit- tot componentschalen vergemakkelijken, wat essentieel is voor een beter begrip van hersenfuncties. Onze clearingtechniek, ScaleSF, oefent krachtige clearingcapaciteit uit, evenals een hoog niveau van weefselbehoud dat nodig is voor gelijktijdige visualisatie van zowel grootschalige als kleinschalige structuren. Ons protocol is vooral effectief in de hersenen, waar neuronale cellen uitgebreide processen vertonen, enorme verbindingen en gespecialiseerde fijne subcellulaire structuren regelen.Voordat u met het experiment begint, bereidt u Sca/eS-oplossingen zoals weergegeven in deze tabel en bedekt u de monsters met folie. Begin de procedure door acht milliliter elk van ScaleS0- en ScaleS4-oplossingen toe te voegen aan twee afzonderlijke putten van een celkweekplaat met zes putten en verwarm de plaat voor tot 37 graden Celsius in een incubator. Breng de hersenschijfjes over naar de voorverwarmde ScaleS0-oplossing met een spatel en incubeer de plakjes gedurende twee uur bij 37 graden Celsius in een schuddende incubator met 90 RPM.Breng vervolgens de gepermeabiliseerde hersenplakken over in acht milliliter PBS minus in een celkweekplaat met zes putten en was gedurende 15 minuten door in een orbitale shaker op 40 tot 60 RPM te houden. Herhaal deze stap twee keer. Breng vervolgens de hersenschijfjes over in acht milliliter voorverwarmde ScaleS4-oplossing en incubeer gedurende acht tot 12 uur bij 90 RPM bij 37 graden Celsius.Voor de voorbereiding van de kamer 3D-print het kamerframe en de microscooptrapadapters. Bevestig het kamerframe aan een afdekplaat met behulp van een drukgevoelige lijm. Bereid 1,5% agarose in scaleS4D25(0)oplossing.Meng de oplossing en zet deze in de magnetron totdat de agarose volledig is opgelost. Laat de oplossing vervolgens afkoelen tot 37 graden Celsius. Monteer de vrijgemaakte hersenschijf op de onderste deklip van de beeldvormende kamer met een spatel.Verwijder de overtollige oplossing uit de opgeruimde plak met behulp van een schone tissue. Voeg de ScaleS4-gel toe aan de hersenschijf met behulp van een micropipette om de beeldvormende kamer te vullen. Leg er nog een deklip op met een tang gevolgd door een stuk tissuepapier en een glazen schuif.Breng de beeldkamer over naar een koelkast op vier graden Celsius. Plaats metalen gewichten op de glasplaat en laat ze 30 minuten staan. Verwijder na de incubatie het materiaal uit de beeldkamer en veeg overtollige gel af.Plaats de beeldkamer in een glazen petrischaaltje van 60 millimeter en bevestig de rand van de beeldkamer op meerdere punten aan de schaal met een drukgevoelige lijm. Giet de ScaleS4-oplossing in de schaal en schud zachtjes gedurende een uur bij 40 tot 60 RPM bij 20 tot 25 graden Celsius. Vervang door een verse oplossing en verwijder luchtbellen op het geloppervlak door het oppervlak voorzichtig te schrapen met een pipetpunt.Monteer de beeldkamer op een microscooptrap. Bereid een confocale laserscanmicroscoop voor die is uitgerust met een multi-immersie objectieflens van 2,5 millimeter werkafstand, 16x vergroting en 0,60 numeriek diafragma. Schakel alle relevante beeldverwerkingsapparatuur in, zoals het werkstation, de microscoop, de scanner, lasers, de kwiklamp en start een beeldbewerkingssoftware.Stel de correctiekraag van de multi-immersie objectieflens in op 1,47. Dompel de objectieflens onder in de oplossing en laat deze de plak langzaam benaderen. Verwijder alle luchtbellen die vastzitten op de punt van de objectieflens.Zoek regio's van belang in gewiste weefsels met behulp van epifluorescentie. Als u parameters voor het verkrijgen van afbeeldingen wilt instellen, bepaalt u eerst de bitdiepte voor beeldacquisitie naarmate de grootte van de afbeelding toeneemt met de bit. Stel vervolgens de detectiegolflengte in op basis van het emissiespectrum.Stel de XY-resolutie, scansnelheid en pinhole-grootte in. Pas ook het laservermogen, de versterking van de detectorversterker en de offset aan totdat een geschikt beeld is verkregen. Bepaal de tegelgrootte op basis van de grootte van de ROI en zorg ervoor dat de volledige lengte en breedte van de ROI worden vastgelegd.Navigeer door het weefsel in alle vlakken en stel de start- en eindpunten van de stapel in. Stel de Z-stapgrootte in, afhankelijk van de gewenste Z-resolutie. Verzamel de beelden en verwerk ze met behulp van beeldanalysesoftware.Met behulp van dit protocol werd optische clearing van een muishersenschijf van een millimeter dikte bereikt. EGFP-expressie in de hersenschors van PV-FGL-muizen toonde aan dat de fluorescentie en structurele integriteit van de weefsels behouden bleef. Refractieve index mismatch geïnduceerde aberraties veroorzaakten een merkbaar verlies van beeldhelderheid en resolutie van EGFP-positieve neuronen.Deze neuronen werden duidelijk gevisualiseerd met de confocale laserscanmicroscoop toen de correctiekraag werd aangepast aan deze ScaleS4-oplossing. 3D-reconstructie van EGFP-gelabelde neuronen in de primaire somatosensorische cortex van de muis werd gedaan in een hersenschijf van één millimeter dik. Individuele dendritische prieeltjes versierd met dendritische stekels werden gezien bij een hogere vergroting.Axon terminale prieelvorming en axonale boutons werden ook waargenomen in de plakjes. Reflectieve indexmatching tussen beeldvloeistof en objectlens is van cruciaal belang voor 3D-beeldvorming in gewiste weefsels. Onze techniek zou de integratie van neuronstructuur van circuit- tot componentschalen vergemakkelijken, inzicht geven in neuronmechanismen, informatie over verwerking in de hersenen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Labeling van neuronen van de knaagdieren en niet-menselijke primaten Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Geautomatiseerde Sholl Analyse van Gedigitaliseerde Neuronale morfologie op meerdere schalen

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Cryopreservatie van Corticale Tissue Blocks voor de generatie van hoogverrijkt Neuronale culturen

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-resolution Imaging van Neuronal Dense-core Blaasjes

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Langdurige incubatie van Acute neuronaal weefsel voor elektrofysiologie en calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Rewiring Neuronal Circuits: een nieuwe methode voor snelle neuritische verlenging en functionele neuronale verbinding

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Een hydrofobe weefselopruimingsmethode voor rattenhersenweefsel

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Volwassen Drosophila melanogaster voorbereiden op whole brain imaging tijdens gedrags- en stimulireacties

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

ROS Live Cell Imaging tijdens neuronale ontwikkeling

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Immunostaining van Whole-Mount Retinas met de CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...