Name: a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00
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Les auteurs remercient Yoko Ishida (Université Juntendo) pour la production de vecteurs AAV et Kisara Hoshino (Université Juntendo) pour l’assistance technique. Cette étude a été soutenue par JSPS KAKENHI (JP20K07231 à K.Y.; JP21H03529 à T.F.; JP20K07743 à M.K.; JP21H02592 à H.H.) et la recherche scientifique sur le domaine innovant « Resonance Bio » (JP18H04743 à H.H.). Cette étude a également été soutenue par l’Agence japonaise pour la recherche et le développement médicaux (AMED) (JP21dm0207112 à T.F. et H.H.), Moonshot R&D de l’Agence japonaise de la science et de la technologie (JST) (JPMJMS2024 à H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) de JST (JPMJFR204D à H.H.), Subventions d’aide de l’Institut de recherche sur les maladies de la vieillesse de la Faculté de médecine de l’Université Juntendo (X2016 à K.Y.; X2001 à H.H.), et le projet de marque des écoles privées.

Toutes les expériences ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Juntendo (approbation n° 2021245, 2021246) et réalisées conformément aux Directives fondamentales pour la bonne conduite des expériences sur les animaux par le Conseil scientifique du Japon (2006). Ici, des souris mâles C57BL/6J injectées avec un vecteur AAV porteur du gène de la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) et de la parvalbumine (PV)/myristoylation-EGFP-réc...

<ol>
	<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+light+microscopy/electron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method,+ScaleSF.">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601 (2022).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy.">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li><li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre/lox+system.">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).</li><li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites.">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li><li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons:+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system.">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex.">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li><li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat:+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors.">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).</li><li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum.">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons.">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331 (2016).</li></ol>

Étapes critiques du protocole Il y a quelques étapes critiques dans le protocole qui doivent être menées avec la plus grande prudence pour obtenir des résultats significatifs. La fixation uniforme des échantillons est impérative pour l’imagerie 3D dans les tissus à grande échelle. La lentille de l’objectif, l’échantillon et le fluide d’immersion doivent avoir une IR correspondante. L’inadéquation de l’IR entre eux conduira à une imagerie très perturbée des cellules exprimant ...

Les méthodes de nettoyage des tissus ont amélioré l’imagerie indépendante de la profondeur des échantillons biologiques et cliniques avec la microscopie optique, permettant l’extraction d’informations structurelles sur des tissus intacts 1,2. Les techniques de nettoyage optique pourraient également accélérer et réduire le coût de l’analyse histologique. À l’heure actuelle, trois grandes approches de défrichage sont disponibles : les méthodeshydrophiles, hydrophobes et à base d’hydrogel 1,2. Les approches hydrophiles surpassent en préservant les signaux de fluorescence et l’intégrité des tissus et sont moins toxiques que les deux autres approches 3,4.
Une méthode de nettoyage hydrophile, ScaleS, occupe une position distinctive avec sa préservation de l’intégrité structurelle et moléculaire ainsi que sa puissante capacité de nettoyage (spectre de clairance-préservation)5. Dans une étude précédente, nous avons développé un protocole de nettoyage rapide et isométrique, ScaleSF, pour les tranches de tissu (~1 mm d’épaisseur) en modifiant la procédure de nettoyage de ScaleS6. Ce protocole de nettoyage nécessite des incubations séquentielles de tranches de cerveau dans trois solutions pendant 10,5 à 14,5 h. La méthode est dotée d’un spectre de conservation de clairance élevé, compatible même avec l’analyse par microscopie électronique (EM) (figure supplémentaire 1), permettant une imagerie tridimensionnelle (3D) haute résolution à plusieurs échelles avec une reconstruction précise du signal6. Ainsi, ScaleSF devrait être efficace en particulier dans le cerveau, où les cellules neuronales élaborent des processus exubérants d’une longueur énorme et organisent des structures subcellulaires fines spécialisées pour transmettre et recevoir des informations. L’extraction d’informations structurelles avec des échelles allant du circuit aux niveaux subcellulaires sur les cellules neuronales est très utile pour mieux comprendre les fonctions cérébrales.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour visualiser les structures neuronales avec des échelles allant du niveau mésoscopique / circuit au niveau microscopique / subcellulaire en utilisant ScaleSF. Le protocole comprend la préparation des tissus, la clarification des tissus, la manipulation des tissus nettoyés et l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser (CLSM) des tissus nettoyés. Notre protocole se concentre sur l’interrogation des structures neuronales des circuits aux échelles des composants subcellulaires. Pour une procédure détaillée de préparation des solutions et d’injection stéréotaxique de vecteurs du virus adéno-associé (AAV) dans le cerveau des souris, se référer à Miyawaki et al. 20167 et Okamoto et al. 20218, respectivement.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16x multi-immersion objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TaKaRa Bio</td>
			<td>L03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13407-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06286-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-cyclodextrin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essential</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>ver. 9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27575-31</td>
			<td>10x PBS(&#8211;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31233-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating tissue slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales

Un protocole détaillé est fourni ici pour visualiser les structures neuronales des niveaux mésoscopiques aux niveaux microscopiques dans les tissus cérébraux. Les structures neuronales allant des circuits neuronaux aux structures neuronales subcellulaires sont visualisées dans des tranches de cerveau de souris optiquement nettoyées avec ScaleSF. Cette méthode de nettoyage est une version modifiée de ScaleS et est une méthode de nettoyage des tissus hydrophiles pour les tranches de tissu qui permet d’obtenir une capacité de nettoyage puissante ainsi qu’un haut niveau de préservation des signaux de fluorescence et de l’intégrité structurelle. Une chambre d’imagerie tridimensionnelle (3D) personnalisable est conçue pour un montage fiable des tissus cérébraux nettoyés. Les cerveaux de souris injectés avec un vecteur viral adéno-associé porteur d’un gène de protéine fluorescente verte amélioré ont été fixés avec 4% de paraformaldéhyde et coupés en tranches de 1 mm d’épaisseur avec une trancheuse de tissu vibrante. Les tranches de cerveau ont été éliminées en suivant le protocole de nettoyage, qui comprend des incubations séquentielles dans trois solutions, à savoir la solution ScaleS0, la solution saline tampon phosphate (–) et la solution ScaleS4, pour un total de 10,5 à 14,5 h. Les tranches de cerveau nettoyées ont été montées sur la chambre d’imagerie et incorporées dans du gel d’agarose à 1,5% dissous dans la solution ScaleS4D25(0). L’acquisition d’images 3D des tranches a été réalisée à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal équipé d’une lentille d’objectif multi-immersion d’une longue distance de travail. En commençant par l’imagerie neuronale mésoscopique, nous avons réussi à visualiser de fines structures neuronales subcellulaires, telles que les épines dendritiques et les boutons axonaux, dans les tranches de cerveau optiquement dégagées. Ce protocole faciliterait la compréhension des structures neuronales des circuits aux échelles des composants subcellulaires.

Le nettoyage optique d’une tranche de cerveau de souris de 1 mm d’épaisseur a été réalisé à l’aide de ce protocole. La figure 1B représente les images de transmission d’une tranche de cerveau de souris avant et après le traitement de nettoyage. La méthode de nettoyage des tissus a rendu transparente une tranche de cerveau de souris de 1 mm d’épaisseur. Une légère expansion de la taille finale des tranches de cerveau a été constatée après l’incubation dans la solution de claira...

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A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Le protocole fournit une méthode détaillée d’imagerie neuronale dans une tranche de cerveau à l’aide d’une méthode de nettoyage destissus, Sca l eSF. Le protocole comprend la préparation des tissus cérébraux, la clarification des tissus, la manipulation des tranches nettoyées et l’imagerie par microscopie confocale à balayage laser des structures neuronales, des niveaux mésoscopiques aux niveaux microscopiques.

Une méthode de nettoyage des tissus pour l’imagerie neuronale des échelles mésoscopiques aux échelles microscopiques

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Notre protocole faciliterait l’étude des structures neuronales, du circuit à l’échelle des composants, ce qui est essentiel pour une meilleure compréhension des fonctions cérébrales. Notre technique de nettoyage, ScaleSF, exerce une puissante capacité de nettoyage, ainsi qu’un haut niveau de préservation des tissus requis pour la visualisation simultanée de structures à grande et à petite échelle. Notre protocole est particulièrement efficace dans le cerveau où les cellules neuronales présentent des processus élaborés, des liens énormes et organisent des structures subcellulaires fines spécialisées.Avant de commencer l’expérience, préparez les solutions Sca/eS comme indiqué dans ce tableau et couvrez les échantillons avec du papier d’aluminium. Commencez la procédure en ajoutant huit millilitres de solutions ScaleS0 et ScaleS4 à deux puits distincts d’une plaque de culture cellulaire de six puits et préchauffez la plaque à 37 degrés Celsius dans un incubateur. Transférer les tranches de cerveau dans la solution ScaleS0 préchauffée avec une spatule et incuber les tranches pendant deux heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur à agitation à 90 RPM.Ensuite, transférez les tranches de cerveau perméabilisées dans huit millilitres de PBS moins dans une plaque de culture cellulaire de six puits et lavez-les pendant 15 minutes en les maintenant dans un agitateur orbital à 40 à 60 tr / min. Répétez cette étape deux fois. Ensuite, transférez les tranches de cerveau dans huit millilitres de solution ScaleS4 préchauffée et incubez pendant huit à 12 heures à 90 tr / min à 37 degrés Celsius.Pour la préparation de la chambre, imprimez en 3D le cadre de la chambre et les adaptateurs d’étage de microscope. Fixez le cadre de la chambre à un couvercle à l’aide d’un adhésif sensible à la pression. Préparer 1,5 % d’agarose dans la solution ScaleS4D25(0).Mélanger la solution et la mettre au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute. Laissez ensuite refroidir la solution à 37 degrés Celsius. Montez la tranche de cerveau dégagée sur le couvercle inférieur de la chambre d’imagerie à l’aide d’une spatule.Retirez l’excès de solution de la tranche nettoyée à l’aide d’un mouchoir propre. Ajoutez le gel ScaleS4 à la tranche de cerveau à l’aide d’une micropipette pour remplir la chambre d’imagerie. Placez un autre couvercle sur le dessus avec des pinces suivies d’un morceau de papier de soie et d’une glissière en verre.Transférer la chambre d’imagerie dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Placez des poids métalliques sur la glissière en verre et laissez-les pendant 30 minutes. Après l’incubation, retirez le matériau de la chambre d’imagerie et essuyez l’excès de gel.Placez la chambre d’imagerie dans une boîte de Petri en verre de 60 millimètres et fixez le bord de la chambre d’imagerie en plusieurs points à la boîte avec un adhésif sensible à la pression. Versez la solution ScaleS4 dans le plat et secouez doucement pendant une heure à 40 à 60 RPM à 20 à 25 degrés Celsius. Remplacer par une solution fraîche et éliminer les bulles d’air sur la surface du gel en grattant doucement la surface à l’aide d’une pointe de pipette.Montez la chambre d’imagerie sur une scène de microscope. Préparez un microscope confocal à balayage laser équipé d’une lentille d’objectif multi-immersion de 2,5 millimètres de distance de travail, d’un grossissement 16x et d’une ouverture numérique de 0,60. Allumez tous les équipements d’imagerie pertinents, tels que le poste de travail, le microscope, le scanner, les lasers, la lampe au mercure et lancez un logiciel d’imagerie.Réglez le collier de correction de l’objectif multi-immersion sur 1,47. Immergez la lentille de l’objectif dans la solution et laissez-la s’approcher lentement de la tranche. Retirez toutes les bulles d’air piégées sur la pointe de l’objectif.Trouvez des régions d’intérêt dans les tissus nettoyés en utilisant l’épifluorescence. Pour définir les paramètres d’acquisition d’image, déterminez d’abord la profondeur de bits pour l’acquisition d’image à mesure que la taille de l’image augmente avec le bit. Réglez ensuite la longueur d’onde de détection en fonction du spectre d’émission.Définissez la résolution XY, la vitesse de numérisation et la taille du sténopé. Ajustez également la puissance du laser, le gain de l’amplificateur du détecteur et le décalage jusqu’à ce qu’une image appropriée soit obtenue. Déterminez la taille du carrelage en fonction de la taille du retour sur investissement, en veillant à ce que toute la longueur et la largeur du retour sur investissement soient capturées.Naviguez dans le tissu dans tous les plans et définissez le début et les extrémités de la pile. Définissez la taille de l’étape Z, en fonction de la résolution Z souhaitée. Collectez les images et traitez-les à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.En utilisant ce protocole, le nettoyage optique d’une tranche de cerveau de souris d’un millimètre d’épaisseur a été réalisé. L’expression de l’EGFP dans le cortex cérébral des souris PV-FGL a montré que la fluorescence et l’intégrité structurelle des tissus étaient préservées. Les aberrations induites par l’inadéquation de l’indice de réfraction ont provoqué une perte notable de luminosité de l’image et de résolution des neurones EGFP positifs.Ces neurones ont été clairement visualisés avec le microscope à balayage laser confocal lorsque le collier de correction a été ajusté pour correspondre à cette solution ScaleS4. La reconstruction 3D des neurones marqués EGFP dans le cortex somatosensoriel primaire de la souris a été réalisée dans une tranche de cerveau d’un millimètre d’épaisseur. Des tonnelles dendritiques individuelles décorées d’épines dendritiques ont été observées à un grossissement plus élevé.Une arborisation terminale axonale et des boutons axonal ont également été observés dans les tranches. L’appariement de l’indice réfléchissant entre le fluide d’imagerie et la lentille objet est essentiel pour l’imagerie 3D dans les tissus nettoyés. Notre technique faciliterait l’intégration de la structure des neurones du circuit aux échelles des composants, en fournissant des informations sur les mécanismes des neurones, des informations de traitement dans le cerveau.

Research

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