Name: a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00
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Die Autoren danken Yoko Ishida (Juntendo University) für die AAV-Vektorproduktion und Kisara Hoshino (Juntendo University) für die technische Unterstützung. Diese Studie wurde unterstützt von JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 bis T.F.; JP20K07743 bis M.K.; JP21H02592 bis H.H.) und wissenschaftliche Forschung zum innovativen Bereich "Resonance Bio" (JP18H04743 bis H.H.). Diese Studie wurde auch von der Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 to T.F. and H.H.), Moonshot R&D von der Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 to H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) von JST (JPMJFR204D to H.H.), Grants-in-Aid des Research Institute for Diseases of Old Age an der Juntendo University School of Medicine (X2016 to K.Y.; X2001 to H.H.), und das Private School Branding Project.

Alle Experimente wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees der Juntendo University genehmigt (Approval No. 2021245, 2021246) und in Übereinstimmung mit den Fundamental Guidelines for Proper Conduct of Animal Experiments des Science Council of Japan (2006) durchgeführt. Hier wurden männliche C57BL/6J-Mäuse, denen AAV-Vektor injiziert wurde, das das Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) -Gen und Parvalbumin (PV) / Myristoylation-EGFP-Low-Density-Lipoproteinrezeptor C-terminale bakterielle künstli...

<ol>
	<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+light+microscopy/electron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method,+ScaleSF.">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601 (2022).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy.">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li><li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre/lox+system.">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).</li><li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites.">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li><li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons:+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system.">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex.">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li><li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat:+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors.">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).</li><li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum.">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons.">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331 (2016).</li></ol>

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls Es gibt ein paar kritische Schritte im Protokoll, die mit äußerster Vorsicht durchgeführt werden sollten, um aussagekräftige Ergebnisse zu erzielen. Eine gleichmäßige Fixierung der Proben ist für die 3D-Bildgebung in großflächigen Geweben unerlässlich. Die Objektivlinse, die Probe und die Tauchflüssigkeit sollten über eine passende RI verfügen. RI-Mismatch zwischen ihnen führt zu einer stark gestörten Bildgebung von EGFP-exprimierenden Zellen ...

Gewebereinigungsmethoden haben die tiefenunabhängige Bildgebung biologischer und klinischer Proben mit Lichtmikroskopie verbessert, so dass strukturelle Informationen über intaktes Gewebe extrahiert werdenkönnen 1,2. Optische Clearing-Techniken könnten möglicherweise auch die Kosten für die histologische Analyse beschleunigen und senken. Derzeit stehen drei Hauptclearing-Ansätze zur Verfügung: hydrophile, hydrophobe und hydrogelbasierte Methoden 1,2. Hydrophile Ansätze übertreffen die Fluoreszenzsignale und die Gewebeintegrität und sind im Vergleich zu den beiden anderen Ansätzen weniger toxisch 3,4.
Eine hydrophile Clearingmethode, ScaleS, nimmt mit ihrer Erhaltung der strukturellen und molekularen Integrität sowie der starken Clearingfähigkeit (Clearing-Konservierungsspektrum) eine herausragende Position ein5. In einer früheren Studie haben wir ein schnelles und isometrisches Clearing-Protokoll, Sca l eSF, für Gewebeschnitte (~ 1 mm Dicke) entwickelt, indem wir das Clearingverfahrenvon ScaleS6 modifiziert haben. Dieses Clearing-Protokoll erfordert sequentielle Inkubationen von Gehirnschnitten in drei Lösungen für 10,5-14,5 h. Die Methode zeichnet sich durch ein hohes Clearing-Konservierungsspektrum aus, das sogar mit der elektronenmikroskopischen (EM) Analyse kompatibel ist (Ergänzende Abbildung 1), was eine hochauflösende dreidimensionale (3D) Multiskalen-Bildgebung mit genauer Signalrekonstruktionermöglicht 6. Daher sollte ScaleSF vor allem im Gehirn wirksam sein, wo neuronale Zellen überschwängliche Prozesse von enormer Länge ausarbeiten und spezialisierte feine subzelluläre Strukturen zum Senden und Empfangen von Informationen anordnen. Die Extraktion struktureller Informationen mit Skalen von Schaltkreis- bis subzellulären Ebenen auf neuronalen Zellen ist sehr nützlich, um die Gehirnfunktionen besser zu verstehen.
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung neuronaler Strukturen mit Skalen von der mesoskopischen / Schaltung bis zur mikroskopischen / subzellulären Ebene mit ScaleSF zur Verfügung. Das Protokoll umfasst die Gewebepräparation, die Gewebeklärung, die Handhabung von gereinigtem Gewebe und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) der Bildgebung von gereinigtem Gewebe. Unser Protokoll konzentriert sich auf die Abfrage neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis hin zu subzellulären Komponentenskalen. Ein detailliertes Verfahren zur Herstellung der Lösungen und zur stereotaktischen Injektion von Adeno-assoziierten Virusvektoren (AAV) in das Gehirn von Mäusen finden Sie in Miyawaki et al. 2016 7 bzw. Okamoto et al.2021 8.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>16x multi-immersion objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TaKaRa Bio</td>
			<td>L03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13407-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06286-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-cyclodextrin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essential</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>ver. 9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27575-31</td>
			<td>10x PBS(&#8211;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31233-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating tissue slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales

Hier wird ein detailliertes Protokoll bereitgestellt, um neuronale Strukturen von mesoskopischen bis hin zu mikroskopischen Ebenen im Hirngewebe sichtbar zu machen. Neuronale Strukturen, die von neuronalen Schaltkreisen bis hin zu subzellulären neuronalen Strukturen reichen, werden in Maus-Gehirnschnitten visualisiert, die mit ScaleSF optisch gelöscht wurden. Diese Clearing-Methode ist eine modifizierte Version von ScaleS und ist eine hydrophile Gewebereinigungsmethode für Gewebeschnitte, die eine starke Clearing-Fähigkeit sowie ein hohes Maß an Erhaltung von Fluoreszenzsignalen und struktureller Integrität erreicht. Eine anpassbare dreidimensionale (3D)-gedruckte Bildgebungskammer wurde für die zuverlässige Montage von gereinigtem Hirngewebe entwickelt. Mäusegehirne, denen ein Adeno-assoziierter Virusvektor injiziert wurde, der ein verbessertes grün fluoreszierendes Proteingen trägt, wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit einem vibrierenden Gewebeschneider in Scheiben von 1 mm Dicke geschnitten. Die Gehirnschnitte wurden unter Befolgung des Clearing-Protokolls gereinigt, das sequentielle Inkubationen in drei Lösungen, nämlich Sca l eS0-Lösung, Phosphatpufferkochsalzlösung (–) und ScaleS4-Lösung, für insgesamt 10,5-14,5 h umfasst. Die gereinigten Hirnschnitte wurden auf die Bildgebungskammer montiert und in 1,5%iges Agarosegel eingebettet, gelöst in ScaleS4D25(0)-Lösung. Die 3D-Bildaufnahme der Scheiben erfolgte mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem Multi-Immersionsobjektiv mit großem Arbeitsabstand ausgestattet war. Beginnend mit der mesoskopischen neuronalen Bildgebung ist es uns gelungen, feine subzelluläre neuronale Strukturen, wie dendritische Stacheln und axonale Boutons, in den optisch gereinigten Hirnschnitten sichtbar zu machen. Dieses Protokoll würde das Verständnis neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis hin zu subzellulären Komponentenskalen erleichtern.

Die optische Klärung einer Maus-Hirnscheibe von 1 mm Dicke wurde mit diesem Protokoll erreicht. Abbildung 1B zeigt Transmissionsbilder eines Maus-Gehirnschnitts vor und nach der Clearing-Behandlung. Die Gewebereinigungsmethode machte eine 1 mm dicke Gehirnscheibe der Maus transparent. Eine leichte Ausdehnung der Endgrößen der Hirnschnitte wurde nach der Inkubation in der Clearinglösung für 12 h festgestellt (lineare Ausdehnung: 102,5% ± 1,3%). Die Erhaltung der Fluoreszenz und strukturellen Integr...

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A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Das Protokoll bietet eine detaillierte Methode der neuronalen Bildgebung in Gehirnschnitten unter Verwendung einer Gewebereinigungsmethode, ScaleSF. Das Protokoll umfasst die Vorbereitung des Hirngewebes, die Gewebeklärung, die Handhabung von abgeräumten Schnitten und die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-Bildgebung neuronaler Strukturen von mesoskopischer bis mikroskopischer Ebene.

Eine Gewebereinigungsmethode für die neuronale Bildgebung von der mesoskopischen bis zur mikroskopischen Skala

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Unser Protokoll würde die Untersuchung neuronaler Strukturen von Schaltkreis- bis zu Komponentenskalen erleichtern, was für ein besseres Verständnis der Gehirnfunktionen unerlässlich ist. Unsere Clearing-Technik, ScaleSF, übt eine starke Clearing-Fähigkeit sowie ein hohes Maß an Gewebekonservierung aus, das für die gleichzeitige Visualisierung von großen und kleinen Strukturen erforderlich ist. Unser Protokoll ist besonders effektiv im Gehirn, wo neuronale Zellen ausgeklügelte Prozesse und enorme Verbindungen aufweisen und spezialisierte feine subzelluläre Strukturen anordnen.Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, bereiten Sie Sca/eS-Lösungen wie in dieser Tabelle gezeigt vor und bedecken Sie die Proben mit Folie. Beginnen Sie den Vorgang, indem Sie jeweils acht Milliliter ScaleS0- und ScaleS4-Lösungen zu zwei separaten Vertiefungen einer Zellkulturplatte mit sechs Bohrlöchern hinzufügen und die Platte in einem Inkubator auf 37 Grad Celsius vorwärmen. Übertragen Sie die Gehirnscheiben mit einem Spatel auf die vorgewärmte ScaleS0-Lösung und inkubieren Sie die Scheiben zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Schüttelinkubator bei 90 U / min.Als nächstes übertragen Sie die permeabilisierten Gehirnschnitte in acht Milliliter PBS minus in eine Zellkulturplatte mit sechs Bohrlöchern und waschen Sie sie 15 Minuten lang, indem Sie sie in einem Orbitalschüttler bei 40 bis 60 U / min halten. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal. Übertragen Sie dann die Gehirnschnitte in acht Milliliter vorgewärmter ScaleS4-Lösung und inkubieren Sie sie acht bis 12 Stunden lang bei 90 U / min bei 37 Grad Celsius.Für die Kammervorbereitung drucken Sie den Kammerrahmen und die Mikroskop-Tischadapter in 3D. Befestigen Sie den Kammerrahmen mit einem Haftkleber an einem Deckglas. Bereiten Sie 1,5% Agarose in ScaleS4D25(0)Lösung vor.Mischen Sie die Lösung und mikrowellieren Sie sie, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Dann lassen Sie die Lösung auf 37 Grad Celsius abkühlen. Montieren Sie die gereinigte Gehirnscheibe mit einem Spatel auf das untere Deckglas der Bildgebungskammer.Entfernen Sie die überschüssige Lösung mit einem sauberen Tuch aus der gereinigten Scheibe. Fügen Sie das ScaleS4-Gel mit einer Mikropipette in die Gehirnscheibe ein, um die Bildgebungskammer zu füllen. Legen Sie ein weiteres Deckglas mit einer Pinzette darauf, gefolgt von einem Stück Seidenpapier und einem Glasobjektträger.Überführen Sie die Bildgebungskammer bei vier Grad Celsius in einen Kühlschrank. Legen Sie Metallgewichte auf den Glasschieber und lassen Sie sie 30 Minuten stehen. Entfernen Sie nach der Inkubation das Material aus der Bildgebungskammer und wischen Sie überschüssiges Gel ab.Legen Sie die Abbildungskammer in eine 60 Millimeter große Petrischale aus Glas und befestigen Sie den Rand der Bildkammer an mehreren Stellen mit einem Haftkleber an der Schale. Gießen Sie die ScaleS4-Lösung in die Schale und schütteln Sie sie vorsichtig für eine Stunde bei 40 bis 60 U / min bei 20 bis 25 Grad Celsius. Ersetzen Sie es durch frische Lösung und entfernen Sie Luftblasen auf der Geloberfläche, indem Sie die Oberfläche vorsichtig mit einer Pipettenspitze abkratzen.Montieren Sie die Bildgebungskammer auf einem Mikroskoptisch. Bereiten Sie ein konfokales Laser-Scanning-Mikroskop vor, das mit einer Multi-Immersionsobjektivlinse mit 2,5 Millimetern Arbeitsabstand, 16-facher Vergrößerung und 0,60-numerischer Blende ausgestattet ist. Schalten Sie alle relevanten Bildgebungsgeräte wie Workstation, Mikroskop, Scanner, Laser und Quecksilberlampe ein und starten Sie eine Bildgebungssoftware.Stellen Sie den Korrekturkragen des Multi-Immersionsobjektivs auf 1,47 ein. Tauchen Sie die Objektivlinse in die Lösung ein und lassen Sie sie sich langsam der Scheibe nähern. Entfernen Sie alle Luftblasen, die an der Spitze der Objektivlinse eingeschlossen sind.Finden Sie Regionen von Interesse in gereinigten Geweben mit Epifluoreszenz. Um Bildaufnahmeparameter festzulegen, bestimmen Sie zunächst die Bittiefe für die Bildaufnahme, da die Größe des Bildes mit dem Bit zunimmt. Stellen Sie dann die Detektionswellenlänge entsprechend dem Emissionsspektrum ein.Stellen Sie die XY-Auflösung, die Scangeschwindigkeit und die Pinhole-Größe ein. Passen Sie auch die Laserleistung, die Verstärkung des Detektorverstärkers und den Offset an, bis ein geeignetes Bild erhalten wird. Bestimmen Sie die Kachelgröße basierend auf der Größe des ROI und stellen Sie sicher, dass die gesamte Länge und Breite des ROI erfasst wird.Navigieren Sie durch das Gewebe in allen Ebenen und legen Sie den Start und die Endpunkte des Stapels fest. Stellen Sie die Z-Schrittgröße entsprechend der gewünschten Z-Auflösung ein. Sammeln Sie die Bilder und verarbeiten Sie sie mit einer Bildanalysesoftware.Mit diesem Protokoll wurde das optische Clearing einer Maus-Hirnscheibe von einem Millimeter Dicke erreicht. Die EGFP-Expression in der Großhirnrinde von PV-FFL-Mäusen zeigte, dass die Fluoreszenz und strukturelle Integrität der Gewebe erhalten blieb. Brechungsindex-Mismatch-induzierte Aberrationen verursachten einen spürbaren Verlust der Bildhelligkeit und Auflösung von EGFP-positiven Neuronen.Diese Neuronen wurden mit dem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop deutlich visualisiert, als der Korrekturkragen an diese ScaleS4-Lösung angepasst wurde. Die 3D-Rekonstruktion von EGFP-markierten Neuronen im primären somatosensorischen Kortex der Maus wurde in einem einen Millimeter dicken Gehirnschnitt durchgeführt. Einzelne dendritische Lauben, die mit dendritischen Stacheln verziert waren, wurden bei höherer Vergrößerung gesehen.Axon Terminal Arborization und axonale Boutons wurden ebenfalls in den Scheiben beobachtet. Der Abgleich des Reflexionsindex zwischen Bildgebungsflüssigkeit und Objektlinse ist für die 3D-Bildgebung in gereinigtem Gewebe von entscheidender Bedeutung. Unsere Technik würde es erleichtern, die Neuronenstruktur von Schaltkreis- zu Komponentenskalen zu integrieren und Einblicke in Neuronenmechanismen und Informationen über die Verarbeitung im Gehirn zu liefern.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Labeling von Neuronen aus Nager und nicht-menschlichen Primaten Hirnschnitten

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Forschung

Neurowissenschaften

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Automatisierte Sholl Analyse digitalisierter neuronale Morphologie bei Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Kryokonservierung von kortikalen Gewebes Bausteine ​​für die Generierung von hoch angereichertem neuronalen Kulturen

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Längerer Inkubation von Akute neuronales Gewebe für Elektrophysiologie und Calcium-Bildgebung

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Neuronale Schaltungen neu verdrahten: Eine neue Methode zur schnellen Neuritenverlängerung und funktionellen neuronalen Verbindung

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Eine hydrophobe Gewebereinigungsmethode für Rattenhirngewebe

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Vorbereitung von Adult Drosophila melanogaster für die Bildgebung des gesamten Gehirns während des Verhaltens und der Stimuli-Reaktionen

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

ROS Live Cell Imaging während der neuronalen Entwicklung

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Immunfärbung von Whole-Mount-Netzhäuten mit der CLARITY Tissue Clearing Methode

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...