Name: a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

המחברים מודים ליוקו אישידה (אוניברסיטת ג'ונטנדו) על ייצור וקטור AAV ולקיסארה הושינו (אוניברסיטת ג'ונטנדו) על הסיוע הטכני. מחקר זה נתמך על ידי JSPS KAKENHI (JP20K07231 עד K.Y.; JP21H03529 עד T.F.; JP20K07743 עד M.K.; JP21H02592 עד H.H.) ומחקר מדעי על אזור חדשני "תהודה ביו" (JP18H04743 עד H.H.). מחקר זה נתמך גם על ידי הסוכנות היפנית למחקר ופיתוח רפואי (AMED) (JP21dm0207112 ל- T.F. ו- H.H.), מו"פ Moonshot מסוכנות המדע והטכנולוגיה של יפן (JST) (JPMJMS2024 עד H.H.), מחקר מונחה היתוך למדע וטכנולוגיה משבשים (יער) מ- JST (JPMJFR204D עד H.H.), מענקים בסיוע ממכון המחקר למחלות זקנה בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת ג'ונטנדו (X2016 עד K.Y.; X2001 ל-H.H.), ופרויקט מיתוג בתי הספר הפרטיים.

כל הניסויים אושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ונטנדו (אישור מס '2021245, 2021246) ובוצעו בהתאם להנחיות היסוד לביצוע נכון של ניסויים בבעלי חיים על ידי המועצה המדעית של יפן (2006). כאן נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים שהוזרקו להם וקטור AAV הנושאים גן משופר של חלבון פלואו?...

<ol>
	<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+light+microscopy/electron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method,+ScaleSF.">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601 (2022).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy.">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li><li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre/lox+system.">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).</li><li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites.">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li><li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons:+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system.">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex.">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li><li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat:+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors.">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).</li><li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum.">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons.">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331 (2016).</li></ol>

שלבים קריטיים בפרוטוקול ישנם כמה שלבים קריטיים בפרוטוקול שיש לבצע בזהירות מרבית כדי להשיג תוצאות משמעותיות. קיבוע אחיד של דגימות הוא הכרחי להדמיה תלת-ממדית בתוך רקמות בקנה מידה גדול. העדשה האובייקטיבית, המדגם ונוזל הטבילה צריכים להיות בעלי RI תואם. אי-התאמה של RI ביניהם תוביל להד...

שיטות ניקוי רקמות שיפרו הדמיה בלתי תלוית עומק של דגימות ביולוגיות וקליניות באמצעות מיקרוסקופיה קלה, ואפשרו מיצוי של מידע מבני על רקמות שלמות 1,2. טכניקות ניקוי אופטיות עשויות גם להאיץ, ולהפחית את העלות עבור ניתוח היסטולוגי. נכון לעכשיו, קיימות שלוש גישות סליקה עיקריות: שיטות הידרופיליות, הידרופוביות ומבוססות הידרוג'ל 1,2. הגישות ההידרופיליות עולות בשמירה על אותות פלואורסצנטיים ושלמות הרקמות והן פחות רעילות בהשוואה לשתי הגישות האחרות 3,4.
שיטת סליקה הידרופילית, ScaleS, מחזיקה בעמדה ייחודית עם שימור השלמות המבנית והמולקולרית שלה, כמו גם יכולת הסליקה החזקה (ספקטרום ניקוי-שימור)5. במחקר קודם פיתחנו פרוטוקול סליקה מהיר ואיזומטרי, ScaleSF, לפרוסות רקמה (בעובי של כ-1 מ"מ) על ידי שינוי הליך הסליקה של ScaleS6. פרוטוקול סליקה זה דורש דגירות עוקבות של פרוסות מוח בשלושה פתרונות למשך 10.5-14.5 שעות. השיטה מוצגת עם ספקטרום גבוה של ניקוי-שימור, התואם אפילו לניתוח מיקרוסקופיית אלקטרונים (EM) (איור משלים 1), המאפשר הדמיה תלת-ממדית (תלת-ממדית) רב-ממדית ברזולוציה גבוהה (3D) עם שחזור אותות מדויק6. לפיכך, ScaleSF צריך להיות יעיל במיוחד במוח, שבו תאי עצב מפרטים תהליכים שופעים באורך עצום, ומסדרים מבנים תת-תאיים עדינים מיוחדים להעברת וקבלת מידע. חילוץ מידע מבני עם קשקשים מרמות מעגליות לתת-תאיות על תאים עצביים הוא די שימושי להבנה טובה יותר של תפקודי המוח.
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט להדמיית מבנים עצביים עם קשקשים מהרמה המזוסקופית/מעגלית לרמה המיקרוסקופית/תת-תאית באמצעות ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות, הבהרת רקמות, טיפול ברקמות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM) של רקמות מנוקות. הפרוטוקול שלנו מתמקד בחקירת מבנים עצביים מקנה מידה של מעגלים לרכיבים תת-תאיים. לקבלת הליך מפורט להכנת הפתרונות והזרקה סטריאוטקסית של וקטורים הקשורים לנגיף אדנו (AAV) למוחם של עכברים, עיין ב- Miyawaki et al. 20167 ו- Okamoto et al. 20218, בהתאמה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16x multi-immersion objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TaKaRa Bio</td>
			<td>L03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13407-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06286-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-cyclodextrin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essential</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>ver. 9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27575-31</td>
			<td>10x PBS(&#8211;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31233-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating tissue slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales

פרוטוקול מפורט מסופק כאן כדי לדמיין מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות ברקמות המוח. מבנים עצביים הנעים בין מעגלים עצביים למבנים עצביים תת-תאיים מוצגים באופן חזותי בפרוסות מוח של עכברים המנוקות אופטית באמצעות ScaleSF. שיטת ניקוי זו היא גרסה שונה של ScaleS והיא שיטה הידרופילית לניקוי רקמות עבור פרוסות רקמה שמשיגה יכולת ניקוי חזקה כמו גם רמה גבוהה של שימור אותות פלואורסצנטיים ושלמות מבנית. תא הדמיה תלת-ממדי (תלת-ממדי) הניתן להתאמה אישית (3D) מתוכנן להרכבה אמינה של רקמות מוח מנוקות. מוחות עכברים שהוזרקו להם וקטור נגיף הקשור לאדנו הנושא גן חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר תוקנו עם 4% פרפורמלדהיד ונחתכו לפרוסות בעובי של 1 מ"מ עם פרוסת רקמה רוטטת. פרוסות המוח נוקו על ידי ביצוע פרוטוקול הסליקה, הכולל דגירות עוקבות בשלוש תמיסות, כלומר, תמיסת ScaleS0, מלח חיץ פוספט (–) ותמיסת ScaleS4, בסך הכל 10.5–14.5 שעות. פרוסות המוח המנוקות הותקנו על תא ההדמיה והוטמעו בג'ל אגרוז של 1.5% שהומס בתמיסת ScaleS4D25(0). רכישת התמונה התלת-ממדית של הפרוסות בוצעה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית מרובת טבילות של מרחק עבודה ארוך. החל מהדמיה עצבית מזוסקופית, הצלחנו לדמיין מבנים עצביים תת-תאיים עדינים, כגון עמודי שדרה דנדריטיים ובוטונים אקסונאליים, בפרוסות המוח המנוקות אופטית. פרוטוקול זה יקל על הבנת המבנים העצביים מקנה מידה של מעגלים לרכיבים תת-תאיים.

ניקוי אופטי של פרוסת מוח של עכבר בעובי 1 מ"מ הושג באמצעות פרוטוקול זה. איור 1B מייצג תמונות שידור של פרוסת מוח של עכבר לפני ואחרי הטיפול בפינוי. שיטת ניקוי הרקמות הפכה פרוסת מוח עכברית בעובי 1 מ"מ לשקופה. הרחבה קלה בגדלים הסופיים של פרוסות המוח נמצאה לאחר הדגירה בתמיסת הסליקה במשך 12 ש?...

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

הפרוטוקול מספק שיטה מפורטת של הדמיה עצבית בפרוסת המוח באמצעות שיטת ניקוי רקמות, ScaleSF. הפרוטוקול כולל הכנת רקמות מוח, הבהרת רקמות, טיפול בפרוסות מנוקות והדמיית מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקלית של מבנים עצביים מרמות מזוסקופיות למיקרוסקופיות.

שיטת ניקוי רקמות להדמיה עצבית מסולמות מזוסקופיים למיקרוסקופיים

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

הפרוטוקול שלנו יקל על חקירה של מבנים עצביים מקנה מידה של מעגלים לרכיבים, מה שחיוני להבנה טובה יותר של תפקודי המוח. טכניקת הסליקה שלנו, ScaleSF מפעילה יכולת ניקוי חזקה, כמו גם רמה גבוהה של שימור רקמות הנדרשת להדמיה סימולטנית של מבנים בקנה מידה גדול וקטן כאחד. הפרוטוקול שלנו יעיל במיוחד במוח שבו תאי עצב מפגינים תהליכים משוכללים, קשרים אדירים ומסדרים מבנים תת-תאיים עדינים מיוחדים.לפני תחילת הניסוי, הכינו פתרונות Sca/eS כפי שמוצג בטבלה זו וכסו את הדגימות בנייר כסף. התחל את ההליך על ידי הוספת שמונה מיליליטרים כל אחד מתמיסות ScaleS0 ו- ScaleS4 לשתי בארות נפרדות של צלחת תרבית תאים של שש בארות וחמם מראש את הצלחת ל -37 מעלות צלזיוס באינקובטור. מעבירים את פרוסות המוח לתמיסת ScaleS0 שחוממה מראש עם מרית ומדגרים את הפרוסות למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד ב-90 סל"ד.לאחר מכן, מעבירים את פרוסות המוח המחוררות בשמונה מיליליטרים של PBS מינוס בצלחת תרבית תאים של שישה בארים ושוטפים במשך 15 דקות על ידי שמירה על שייקר מסלולי ב-40 עד 60 סל"ד. חזור על שלב זה פעמיים. לאחר מכן, העבירו את פרוסות המוח לשמונה מיליליטרים של תמיסת ScaleS4 שחוממה מראש ודגרו במשך שמונה עד 12 שעות ב-90 סל"ד ב-37 מעלות צלזיוס.להכנת התא, הדפס בתלת-ממד את מסגרת התא ואת מתאמי שלב המיקרוסקופ. חברו את מסגרת התא לכיסוי באמצעות דבק רגיש ללחץ. הכן 1.5% אגרוז בתמיסת ScaleS4D25(0) .מערבבים את התמיסה ומחגלים אותה במיקרוגל עד שהאגרוז מומס במלואו. לאחר מכן אפשרו לתמיסה להתקרר ל-37 מעלות צלזיוס. הרכיבו את פרוסת המוח המנוקה על הכיסוי התחתון של תא ההדמיה בעזרת מרית.הסר את התמיסה העודפת מהפרוסה המנוקה באמצעות רקמה נקייה. הוסיפו את הג'ל ScaleS4 לפרוסת המוח באמצעות מיקרופיפט כדי למלא את תא ההדמיה. מניחים על גבי מכסה נוסף עם מלקחיים ואחריו פיסת נייר טישו ומגלשת זכוכית.מעבירים את תא ההדמיה למקרר בארבע מעלות צלזיוס. מניחים משקולות מתכת על מגלשת הזכוכית ומשאירים אותן למשך 30 דקות. לאחר הדגירה, מוציאים את החומר מתא ההדמיה ומנגבים את עודפי הג'ל.מניחים את תא ההדמיה בצלחת פטרי מזכוכית בקוטר 60 מ"מ ומחברים את שפת תא ההדמיה במספר נקודות לצלחת עם דבק רגיש ללחץ. יוצקים את תמיסת ScaleS4 לתוך המנה ומנערים בעדינות במשך שעה אחת ב-40 עד 60 סל"ד ב-20 עד 25 מעלות צלזיוס. החליפו בתמיסה טרייה והסירו בועות אוויר על משטח הג'ל על ידי גירוד עדין של המשטח באמצעות קצה פיפטה.הרכיבו את תא ההדמיה על במת מיקרוסקופ. הכינו מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי המצויד בעדשה אובייקטיבית מרובת טבילות של מרחק עבודה של 2.5 מילימטרים, הגדלה של פי 16 ומפתח צמצם מספרי של 0.60. הפעל את כל ציוד ההדמיה הרלוונטי, כגון תחנת העבודה, המיקרוסקופ, הסורק, הלייזרים, מנורת הכספית והפעל תוכנת הדמיה.הגדר את צווארון התיקון של העדשה האובייקטיבית מרובת הטבילות ל- 1.47. לטבול את העדשה האובייקטיבית בפתרון ולתת לה להתקרב לפרוסה לאט. הסר את כל בועות האוויר הלכודות בקצה העדשה האובייקטיבית.מצא אזורים בעלי עניין ברקמות מנוקות באמצעות אפיפלואורסצנציה. כדי להגדיר פרמטרים של רכישת תמונה, ראשית, קבע את עומק הסיביות לרכישת תמונה ככל שגודל התמונה גדל עם הסיבית. לאחר מכן הגדר את אורך הגל של הגילוי בהתאם לספקטרום הפליטה.הגדר את רזולוציית XY, מהירות הסריקה וגודל חור הסיכה. כמו כן, התאם את כוח הלייזר, את הגדלת מגבר הגלאי והסט עד לקבלת תמונה מתאימה. קבעו את גודל הריצוף בהתבסס על גודל ההחזר על ההשקעה, והבטיחו שכל האורך והרוחב של ההחזר על ההשקעה יילכדו.נווט דרך הרקמה בכל המישורים והגדר את נקודות ההתחלה והסיום של הערימה. הגדר את גודל הצעד Z, בהתאם לרזולוציית Z הרצויה. אסוף את התמונות ועבד אותן באמצעות תוכנת ניתוח תמונות.באמצעות פרוטוקול זה הושג ניקוי אופטי של פרוסת מוח של עכבר בעובי של מילימטר אחד. ביטוי EGFP בקליפת המוח של עכברי PV-FGL הראה כי הפלואורסצנציה והשלמות המבנית של הרקמות נשמרו. אי-התאמה של מקדם שבירה שגרמה לסטיות שנגרמו כתוצאה מאובדן ניכר של בהירות התמונה והרזולוציה של נוירונים חיוביים של EGFP.נוירונים אלה הודגמו בבירור באמצעות מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקלי כאשר צווארון התיקון הותאם כך שיתאים לפתרון ScaleS4 זה. שחזור תלת-ממדי של תאי עצב המסומנים על-ידי EGFP בקליפת המוח הסומטוסנסורית הראשונית של העכבר נעשה בפרוסת מוח בעובי של מילימטר אחד. ארבורים דנדריטיים בודדים המעוטרים בקוצים דנדריטיים נראו בהגדלה גבוהה יותר.כמו כן נצפו בפרוסות ארבוריזציה של מסוף אקסון ובוטונים אקסונאליים. התאמת אינדקס רפלקטיבי בין נוזל הדמיה לעדשת אובייקט היא קריטית להדמיה תלת-ממדית ברקמות מנוקות. הטכניקה שלנו תקל על שילוב מבנה הנוירונים מקנה מידה של מעגל לרכיבים, ותספק תובנות על מנגנוני נוירונים, מידע על עיבוד במוח.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

ניתוח אוטומטי של מורפולוגיה Sholl העצבית סרוקים בקני מידה מרובים

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Cryopreservation של בלוקים רקמות קליפתיים לדור תרבויות העצבית מועשר

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית ​​צפופות ליבות עצבית

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

דגירה ממושכת של רקמות חריפות עצביות עבור Electrophysiology ו-הדמית סידן

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

שיטת ניקוי רקמות הידרופובית לרקמת מוח חולדה

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

הכנת מלנוגאסטר דרוזופילה למבוגרים להדמיית מוח שלמה במהלך תגובות התנהגות וגירויים

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

ROS הדמיית תאים חיים במהלך התפתחות עצבית

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

חיסון של רטינות הר שלם עם שיטת ניקוי רקמת בהירות

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...