Name: a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00
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저자들은 AAV 벡터 제작을 위한 이시다 요코(준텐도 대학)와 기술 지원을 위해 호시노 키사라(준텐도 대학)에게 감사를 표한다. 본 연구는 JSPS KAKENHI (JP20K07231 내지 K.Y.; JP21H03529 내지 T.F.; JP20K07743 내지 M.K.; JP21H02592 내지 H.H.) 혁신 영역 "공명 바이오"에 대한 과학 연구 (JP18H04743 ~ H.H.). 이 연구는 또한 일본 의학 연구 개발청 (AMED) (JP21dm0207112 ~ T.F. 및 H.H.), 일본 과학 기술국 (JST)의 Moonshot R & D (JPMJMS2024 ~ H.H.), JST (JPMJFR204D에서 H.H.까지)의 파괴적인 과학 기술을위한 융합 지향 연구 (FOREST), 중텐도 대학 의과 대학 의과 대학 노년기 질환 연구소 (X2016 ~ K.Y.; X2001 to H.H.), 그리고 사립 학교 브랜딩 프로젝트.

모든 실험은 준텐도 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (승인 번호 2021245, 2021246)의 승인을 받았으며 일본 과학위원회 (2006)의 동물 실험의 적절한 수행을위한 기본 지침에 따라 수행되었습니다. 여기서, 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP) 유전자와 파브알부민(PV)/미리스토일화-EGFP-저밀도 지단백 수용체 C-말단 박테리아 인공염색체(BAC) 형질전환 마우스(PV-FGL 마우스)9 를 담은 AAV 벡?...

<ol>
	<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+light+microscopy/electron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method,+ScaleSF.">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601 (2022).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy.">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li><li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre/lox+system.">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).</li><li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites.">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li><li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons:+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system.">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex.">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li><li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat:+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors.">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).</li><li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum.">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons.">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331 (2016).</li></ol>

프로토콜 내의 중요한 단계 프로토콜에는 의미 있는 결과를 얻기 위해 최대한의 주의를 기울여 수행해야 하는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 샘플의 균일 한 고정은 대규모 조직 내에서 3D 이미징을 위해 필수적입니다. 대물 렌즈, 샘플 및 침지 유체는 일치하는 RI를 가져야합니다. 이들 사이의 RI-불일치는 제거된 뇌 절편 내에서 EGFP 발현 세포의 고도로 교란된 영상화로 이어질 ?...

조직 제거 방법은 광 현미경으로 생물학적 및 임상 샘플의 깊이 독립적 인 이미징을 개선하여 손상되지 않은 조직 1,2에 대한 구조 정보를 추출 할 수 있습니다. 광학 클리어링 기술은 잠재적으로 속도를 높이고 조직학적 분석 비용을 절감할 수 있습니다. 현재 세 가지 주요 클리어링 접근법이 있습니다 : 친수성, 소수성 및 하이드로 겔 기반 방법 1,2. 친수성 접근법은 형광 신호 및 조직 완전성을 보존하는 데 있어 능가하며, 다른 두 접근법(3,4)에 비해 독성이 적다.
친수성 클리어링 방법인 ScaleS는 구조적 및 분자 무결성의 보존과 강력한 클리어링 능력(클리어링-보존 스펙트럼)5으로 독특한 위치를 차지하고 있습니다. 이전 연구에서, 우리는 Sca l eS6의 클리어링 절차를 수정하여 조직 슬라이스 (~ 1-mm 두께)에 대한 신속하고 등각 클리어링 프로토콜 인 ScaleSF를 개발했습니다. 이 클리어링 프로토콜은 10.5-14.5 시간 동안 세 가지 솔루션으로 뇌 조각을 순차적으로 배양해야합니다. 이 방법은 전자 현미경 (EM) 분석 (보충 그림 1)과도 호환되는 높은 클리어링 보존 스펙트럼을 특징으로하므로 정확한 신호 재구성6을 갖춘 멀티 스케일 고해상도 3D (3D) 이미징이 가능합니다. 따라서 ScaleSF는 특히 신경 세포가 엄청난 길이의 풍부한 과정을 정교하게하고 정보를 전달하고 수신하기위한 전문화 된 미세한 세포 하부 구조를 배열하는 뇌에서 효과적이어야합니다. 신경 세포의 회로에서 세포 하위 수준까지 비늘로 구조 정보를 추출하는 것은 뇌 기능을 더 잘 이해하는 데 매우 유용합니다.
여기에서는 ScaleSF를 사용하여 중시경 / 회로에서 현미경 / 세포 수준까지의 스케일로 신경 구조를 시각화하기위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜에는 조직 준비, 조직 정화, 클리어 된 조직의 취급 및 클리어 된 조직의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM) 이미징이 포함됩니다. 우리의 프로토콜은 회로에서 아세포 구성 요소 척도에 이르기까지 신경 구조를 심문하는 데 중점을 둡니다. 용액의 제조를 위한 상세한 절차와 마우스 뇌에 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터의 입체택시 주사를 위한 상세한 절차는 각각 Miyawaki et al. 20167 및 Okamoto et al. 20218을 참조한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16x multi-immersion objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TaKaRa Bio</td>
			<td>L03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13407-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06286-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-cyclodextrin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essential</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>ver. 9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27575-31</td>
			<td>10x PBS(&#8211;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31233-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating tissue slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales

중강경에서 뇌 조직의 현미경 수준에 이르기까지 신경 구조를 시각화하기 위해 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 신경 회로에서 세포 하부 신경 구조에 이르기까지 뉴런 구조는 ScaleSF로 광학적으로 클리어 된 마우스 뇌 조각에서 시각화됩니다. 이 클리어링 방법은 ScaleS의 변형 된 버전이며 강력한 클리어링 기능뿐만 아니라 형광 신호의 높은 수준의 보존 및 구조적 무결성을 달성하는 조직 슬라이스에 대한 친수성 조직 제거 방법입니다. 사용자 정의 가능한 3차원(3D) 인쇄 이미징 챔버는 클리어된 뇌 조직의 안정적인 장착을 위해 설계되었습니다. 강화된 녹색 형광 단백질 유전자를 운반하는 아데노 관련 바이러스 벡터를 주입한 마우스 뇌를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 진동 조직 슬라이서로 1-mm 두께의 조각으로 절단하였다. 뇌 조각은 세 가지 용액, 즉 Sca l eS0 용액, 인산염 완충 식염수 (-) 및 ScaleS4 용액에서 순차적 인 배양을 포함하는 클리어링 프로토콜에 따라 총10.5-14.5 h의 클리어링 프로토콜에 따라 제거되었습니다. 클리어된 뇌 조각을 이미징 챔버에 장착하고 ScaleS4D25(0) 용액에 용해된 1.5% 아가로스 겔에 매립하였다. 슬라이스의 3D 이미지 획득은 긴 작동 거리의 다중 침지 대물 렌즈가 장착 된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수행되었습니다. 중강경 신경 영상으로 시작하여, 우리는 수지상 척추 및 축삭돌과 같은 미세한 세포 하부 신경 구조를 광학적으로 지워진 뇌 조각에서 시각화하는 데 성공했습니다. 이 프로토콜은 회로에서 아세포 구성 요소 척도에 이르기까지 신경 구조의 이해를 용이하게합니다.

1-mm 두께의 마우스 뇌 슬라이스의 광학 클리어링은 이 프로토콜을 사용하여 달성되었다. 도 1B 는 클리어링 처리 전후의 마우스 뇌 슬라이스의 전송 이미지를 나타낸다. 조직 제거 방법은 1mm 두께의 마우스 뇌 조각을 투명하게 렌더링했습니다. 뇌 조각의 최종 크기에서 약간의 확장은 12 h 동안 클리어링 용액에서 인큐베이션 한 후에 발견되었다 (선형 팽창 : 102.5 % ± 1.3 %). 조직의 형광...

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A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

이 프로토콜은 조직 제거 방법인 ScaleSF를 사용하여 뇌 절편에서 신경 세포 영상의 상세한 방법을 제공한다. 이 프로토콜에는 뇌 조직 준비, 조직 정화, 클리어 슬라이스 처리 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미징이 포함됩니다.

중시경에서 현미경 비늘에 이르기까지 신경 세포 이미징을위한 조직 제거 방법

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

우리의 프로토콜은 뇌 기능을 더 잘 이해하는 데 필수적인 회로에서 구성 요소 척도에 이르기까지 신경 구조에 대한 조사를 용이하게합니다. 당사의 클리어링 기술인 ScaleSF는 강력한 클리어링 기능뿐만 아니라 크고 작은 규모의 구조물을 동시에 시각화하는 데 필요한 높은 수준의 조직 보존을 발휘합니다. 우리의 프로토콜은 신경 세포가 정교한 과정, 엄청난 링크를 나타내며 전문화 된 미세한 세포 하부 구조를 배열하는 뇌에서 특히 효과적입니다.실험을 시작하기 전에 이 표와 같이 Sca/eS 솔루션을 준비하고 샘플을 호일로 덮습니다. 여섯 웰 세포 배양 플레이트의 두 개의 분리된 웰에 각각 8밀리리터의 ScaleS0 및 ScaleS4 용액을 8밀리리터씩 첨가하여 절차를 시작하고 인큐베이터에서 플레이트를 섭씨 37도까지 미리 데온합니다. 뇌 조각을 주걱으로 미리 가온된 ScaleS0 용액으로 옮기고 90RPM의 진탕 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 두 시간 동안 슬라이스를 인큐베이션합니다.다음에, 투과된 뇌 절편을 6개의 웰 세포 배양 플레이트에서 마이너스 PBS 8밀리리터로 옮기고, 40 내지 60 RPM의 오비탈 진탕기에서 유지함으로써 15분 동안 세척한다. 이 단계를 두 번 반복합니다. 그런 다음 뇌 조각을 미리 예열 된 ScaleS4 용액 8 밀리리터로 옮기고 섭씨 37도에서 90RPM에서 8 ~ 12 시간 동안 배양하십시오.챔버 준비를 위해 챔버 프레임과 현미경 스테이지 어댑터를 3D 프린팅합니다. 감압 접착제를 사용하여 챔버 프레임을 커버슬립에 부착합니다. ScaleS4D25(0) 용액에서 1.5% 아가로스를 준비합니다.용액을 혼합하고 아가로스가 완전히 용해 될 때까지 전자 레인지를 돌립니다. 그런 다음 용액을 섭씨 37도까지 식히십시오. 클리어 된 뇌 조각을 주걱으로 이미징 챔버의 하단 커버 슬립에 장착하십시오.깨끗한 조직을 사용하여 클리어 슬라이스에서 과량의 용액을 제거하십시오. ScaleS4 젤을 마이크로 피펫을 사용하여 뇌 조각에 추가하여 이미징 챔버를 채 웁니다. 포셉으로 위에 다른 커버 슬립을 놓고 티슈 페이퍼와 유리 슬라이드를 놓습니다.이미징 챔버를 섭씨 네 도의 냉장고로 옮깁니다. 유리 슬라이드에 금속 무게를 놓고 30 분 동안 그대로 두십시오. 인큐베이션 후, 이미징 챔버로부터 물질을 제거하고 과량의 겔을 닦아낸다.이미징 챔버를 60mm 유리 페트리 접시에 넣고 이미징 챔버의 테두리를 여러 지점에 감압 접착제로 접시에 부착하십시오. ScaleS4 용액을 접시에 붓고 섭씨 20 ~ 25도에서 40 ~ 60 RPM으로 한 시간 동안 부드럽게 흔들어줍니다. 신선한 용액으로 대체하고 피펫 팁을 사용하여 표면을 부드럽게 긁어 젤 표면의 기포를 제거하십시오.이미징 챔버를 현미경 스테이지에 장착하십시오. 2.5 밀리미터 작동 거리, 16x 배율 및 0.60 수치 조리개의 다중 침지 대물 렌즈가 장착 된 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 준비하십시오. 워크 스테이션, 현미경, 스캐너, 레이저, 수은 램프와 같은 모든 관련 이미징 장비를 켜고 이미징 소프트웨어를 시작하십시오.다중 침지 대물 렌즈의 보정 칼라를 1.47로 설정합니다. 대물 렌즈를 용액에 담그고 슬라이스에 천천히 접근하게하십시오. 대물 렌즈 끝에 갇힌 모든 기포를 제거하십시오.epifluorescence를 사용하여 클리어 된 조직에서 관심있는 영역을 찾으십시오. 이미지 획득 파라미터를 설정하려면, 먼저, 비트에 따라 이미지의 크기가 증가함에 따라 이미지 획득을 위한 비트 깊이를 결정한다. 그런 다음 방출 스펙트럼에 따라 검출 파장을 설정하십시오.XY 해상도, 스캔 속도 및 핀홀 크기를 설정합니다. 또한 레이저 전력, 검출기 증폭기 이득 및 적절한 이미지가 얻어질 때까지 오프셋을 조정한다. ROI의 크기에 따라 타일링 크기를 결정하여 ROI의 전체 길이와 너비가 캡처되도록 합니다.모든 평면에서 조직을 탐색하고 스택의 시작과 끝점을 설정합니다. 원하는 Z 해상도에 따라 Z 단계 크기를 설정합니다. 이미지를 수집하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 처리합니다.이 프로토콜을 사용하여, 한 밀리미터 두께의 마우스 뇌 슬라이스의 광학 클리어링이 달성되었다. PV-FGL 마우스의 대뇌 피질에서의 EGFP 발현은 조직의 형광 및 구조적 완전성이 보존되었음을 보여주었다. 굴절률 불일치 유도 수차는 EGFP 양성 뉴런의 이미지 밝기 및 해상도의 현저한 손실을 야기하였다.이 뉴런은 보정 칼라가이 ScaleS4 솔루션과 일치하도록 조정되었을 때 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 명확하게 시각화되었습니다. 마우스 일차 체감각 피질에서 EGFP 표지된 뉴런의 3D 재구성은 한 밀리미터 두께의 뇌 절편에서 이루어졌다. 수지상 척추로 장식 된 개별 수지상 arbors는 더 높은 배율로 보였다.축삭 말단 수목화 및 축삭 부톤도 슬라이스에서 관찰되었다. 이미징 유체와 오브젝트 렌즈 사이의 반사 지수 정합은 클리어링된 조직에서 3D 이미징에 매우 중요합니다. 우리의 기술은 회로에서 구성 요소 스케일에 이르기까지 뉴런 구조를 통합하는 것을 촉진하여 뉴런 메커니즘에 대한 통찰력, 뇌에서의 처리 정보를 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

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DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

연구

신경과학

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여러 스케일에서 디지털의 연결 형태론의 자동 숄 분석

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In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

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Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

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ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

신경 발달 도중 ROS 살아있는 세포 화상 진찰

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

선명도 조직 클리어링 방법으로 전산 망막의 면역 염색

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...