Name: a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00
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Os autores agradecem a Yoko Ishida (Universidade de Juntendo) pela produção de vetores AAV e kisara Hoshino (Universidade de Juntendo) pela assistência técnica. Este estudo foi apoiado por JSPS KAKENHI (JP20K07231 a K.Y.; JP21H03529 a T.F.; JP20K07743 a M.K.; JP21H02592 a H.H.) e Pesquisa Científica sobre Área Inovadora "Ressonância Bio" (JP18H04743 a H.H.). Este estudo também foi apoiado pela Agência japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED) (JP21dm0207112 a T.F. e H.H.), Moonshot P&D da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão (JST) (JPMJMS2024 a H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) da JST (JPMJFR204D a H.H.), Grants-in-Aid do Instituto de Pesquisa para Doenças da Velhice na Escola de Medicina da Universidade de Juntendo (X2016 a K.Y.; X2001 para H.H.), e o Projeto de Branding de Escolas Particulares.

Todos os experimentos foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Juntendo (Aprovação nº 2021245, 2021246) e realizados de acordo com as Diretrizes Fundamentais para a Conduta Adequada dos Experimentos Animais pelo Conselho Científico do Japão (2006). Aqui, camundongos C57BL/6J machos injetados com vetor AAV que transportam genes de proteína fluorescente verde aumentada (EGFP) e parvalbumina (PV)/myristoylation-EGFP-low-density lipoprotein receptor C-terminal bacter...

<ol>
	<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+light+microscopy/electron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method,+ScaleSF.">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601 (2022).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy.">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li><li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre/lox+system.">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).</li><li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites.">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li><li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons:+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system.">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex.">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li><li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat:+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors.">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).</li><li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum.">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons.">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331 (2016).</li></ol>

Passos críticos dentro do protocolo Existem alguns passos críticos no protocolo que devem ser conduzidos com a máxima cautela para obter resultados significativos. A fixação uniforme das amostras é imprescindível para imagens 3D dentro de tecidos de grande escala. A lente objetiva, a amostra e o fluido de imersão devem ter ri correspondente. A incompatibilidade de RI entre eles levará a imagens altamente perturbadas de células expressas por EGFP dentro das fatias cerebrais limpas (Fi...

Os métodos de limpeza tecidual melhoraram a imagem independente de profundidade de amostras biológicas e clínicas com microscopia leve, permitindo a extração de informações estruturais em tecidos intactos 1,2. Técnicas de compensação óptica também poderiam potencialmente acelerar e reduzir o custo para análise histológica. Atualmente, três grandes abordagens de compensação estão disponíveis: métodos à base de hidrofílico, hidrofóbico e hidrogel 1,2. As abordagens hidrofílicas superam na preservação de sinais de fluorescência e integridade tecidual e são menos tóxicas em comparação com as outras duas abordagens 3,4.
Um método de compensação hidrofílica, ScaleS, mantém uma posição distinta com sua preservação da integridade estrutural e molecular, bem como potente capacidade de compensação (espectro de preservação de desmatamento)5. Em um estudo anterior, desenvolvemos um protocolo de compensação rápida e isométrica, ScaleSF, para fatias de tecido (~1 mm de espessura) modificando o procedimento de compensação do ScaleS6. Este protocolo de compensação requer incubações sequenciais de fatias cerebrais em três soluções para 10,5-14,5 h. O método é apresentado com um espectro de alta preservação de compensação, que é compatível mesmo com a análise de microscopia eletrônica (EM) (Figura Suplementar 1), permitindo imagens tridimensionais (3D) de alta resolução em larga escala com reconstrução precisa do sinal6. Assim, o ScaleSF deve ser eficaz especialmente no cérebro, onde as células neuronais elaboram processos exuberantes de comprimento tremendo, e organizam estruturas subcelulares finas especializadas para transmitir e receber informações. Extrair informações estruturais com escalas de circuito para níveis subcelulares em células neuronais é bastante útil para uma melhor compreensão das funções cerebrais.
Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para visualizar estruturas neuronais com escamas do mesoscópico/circuito ao nível microscópico/subcelular usando ScaleSF. O protocolo inclui preparação tecidual, esclarecimento de tecidos, manuseio de tecidos limpos e microscopia de escaneamento a laser confocal (CLSM) de tecidos limpos. Nosso protocolo se concentra em interrogar estruturas neuronais de circuito para escalas de componentes subcelulares. Para um procedimento detalhado para a preparação das soluções e injeção estereotaxica de vetores de vírus associados ao adeno (AAV) em cérebros de camundongos, consulte Miyawaki et al. 20167 e Okamoto et al. 20218, respectivamente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16x multi-immersion objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TaKaRa Bio</td>
			<td>L03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13407-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06286-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-cyclodextrin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essential</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>ver. 9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27575-31</td>
			<td>10x PBS(&#8211;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31233-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating tissue slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales

Um protocolo detalhado é fornecido aqui para visualizar estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos em tecidos cerebrais. Estruturas neuronais que vão desde circuitos neurais até estruturas neuronais subcelulares são visualizadas em fatias cerebrais de camundongos adequadamente limpas com ScaleSF. Este método de compensação é uma versão modificada do ScaleS e é um método de limpeza de tecido hidrofílico para fatias teciduais que alcança potente capacidade de limpeza, bem como um alto nível de preservação de sinais de fluorescência e integridade estrutural. Uma câmara de imagem digital 3D digitalizado (3D) personalizável é projetada para uma montagem confiável de tecidos cerebrais limpos. Cérebros de camundongos injetados com um vetor de vírus associado ao adeno carregando um gene de proteína fluorescente verde aprimorado foram corrigidos com 4% de paraformaldeído e cortados em fatias de espessura de 1 mm com um cortador de tecido vibrante. As fatias cerebrais foram limpas seguindo o protocolo de compensação, que incluem incubações sequenciais em três soluções: solução ScaleS0, soro fisco tampão de fosfato (–), e solução ScaleS4, totalizando 10,5-14,5 h. As fatias cerebrais limpas foram montadas na câmara de imagem e embutidas em gel de 1,5% de agarose dissolvido na solução ScaleS4D25(0). A aquisição de imagem 3D das fatias foi realizada utilizando um microscópio de varredura a laser confocal equipado com uma lente objetiva de multi-imersão de uma longa distância de trabalho. Começando com imagens neuronais mesoscópicas, conseguimos visualizar estruturas neuronais subcelulares finas, como espinhas dendríticas e boutons axonais, nas fatias cerebrais adequadamente limpas. Este protocolo facilitaria a compreensão das estruturas neuronais desde circuito até escalas de componentes subcelulares.

A limpeza óptica de uma fatia cerebral do rato de 1 mm de espessura foi alcançada usando este protocolo. A Figura 1B representa imagens de transmissão de uma fatia cerebral de camundongos antes e depois do tratamento de compensação. O método de limpeza tecidual tornou transparente uma fatia cerebral de camundongo de 1 mm de espessura. Uma ligeira expansão nos tamanhos finais das fatias cerebrais foi encontrada após a incubação na solução de compensação por 12h (expansão linear: 102,5% ± 1...

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A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

O protocolo fornece um método detalhado de imagem neuronal na fatia cerebral usando um método de limpeza tecidual, ScaleSF. O protocolo inclui preparação de tecidos cerebrais, esclarecimento de tecidos, manuseio de fatias limpas e microscopia de varredura a laser confocal de estruturas neuronais de níveis mesoscópicos a microscópicos.

Um método de limpeza de tecidos para imagens neuronais de escalas mesoscópicas a microscópicas

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Nosso protocolo facilitaria a investigação de estruturas neuronais de circuitos a escalas de componentes, o que é essencial para uma melhor compreensão das funções cerebrais. Nossa técnica de compensação, ScaleSF exerce potente capacidade de compensação, bem como um alto nível de preservação tecidual que é necessário para visualização simultânea de estruturas de grande e pequena escala. Nosso protocolo é especialmente eficaz no cérebro onde as células neuronais exibem processos elaborados, ligações tremendas e organizam estruturas subcelulares especializadas.Antes de iniciar o experimento, prepare as soluções Sca/eS, como mostrado nesta tabela e cubra as amostras com papel alumínio. Inicie o procedimento adicionando oito mililitros cada uma das soluções ScaleS0 e ScaleS4 a dois poços separados de uma placa de cultura de seis poços e pré-aqueça a placa a 37 graus Celsius em uma incubadora. Transfira as fatias cerebrais para a solução ScaleS0 pré-aquecida com uma espátula e incuba as fatias por duas horas a 37 graus Celsius em uma incubadora de agitação a 90 RPM.Em seguida, transfira as fatias cerebrais permeabilizadas em oito mililitros de PBS menos em uma placa de cultura de seis poços e lave por 15 minutos mantendo-se em um agitador orbital a 40 a 60 RPM. Repita este passo duas vezes. Em seguida, transfira as fatias cerebrais em oito mililitros de solução ScaleS4 pré-aquecida e incubar por oito a 12 horas a 90 RPM a 37 graus Celsius.Para preparação da câmara, imprima em 3D o quadro da câmara e os adaptadores do estágio do microscópio. Conecte o quadro da câmara a uma mancha de cobertura usando um adesivo sensível à pressão. Prepare 1,5% de agarose na solução ScaleS4D25(0)..Misture a solução e micro-ondas até que a agarose esteja totalmente dissolvida. Em seguida, deixe a solução esfriar a 37 graus Celsius. Monte a fatia do cérebro limpa na tampa inferior da câmara de imagem com uma espátula.Remova a solução em excesso da fatia limpa usando um tecido limpo. Adicione o gel ScaleS4 à fatia cerebral usando uma micropipette para encher a câmara de imagem. Coloque outra mancha de cobertura em cima com fórceps seguidos de um pedaço de papel de tecido e um slide de vidro.Transfira a câmara de imagem para uma geladeira a 4 graus Celsius. Coloque pesos metálicos no deslizamento de vidro e deixe-os por 30 minutos. Após a incubação, remova o material da câmara de imagem e limpe o excesso de gel.Coloque a câmara de imagem em uma placa de Petri de vidro de 60 milímetros e conecte a borda da câmara de imagem em vários pontos à placa com um adesivo sensível à pressão. Despeje a solução ScaleS4 no prato e agite suavemente por uma hora a 40 a 60 RPM a 20 a 25 graus Celsius. Substitua com uma solução fresca e remova bolhas de ar na superfície do gel raspando suavemente a superfície usando uma ponta de pipeta.Monte a câmara de imagens em um palco de microscópio. Prepare um microscópio de varredura a laser confocal equipado com uma lente objetiva multi-imersão de 2,5 milímetros de distância de trabalho, ampliação de 16x e abertura numérica de 0,60. Ligue todos os equipamentos de imagem relevantes, como a estação de trabalho, microscópio, scanner, lasers, lâmpada de mercúrio e lance um software de imagem.Coloque a coleira de correção da lente objetiva de multi-imersão para 1,47. Mergulhe a lente objetiva na solução e deixe-a aproximar-se lentamente da fatia. Remova todas as bolhas de ar presas na ponta da lente objetiva.Encontre regiões de interesse em tecidos limpos usando epifluorescência. Para definir os parâmetros de aquisição de imagens, primeiro, determine a profundidade de bit para aquisição de imagem à medida que o tamanho da imagem aumenta com o bit. Em seguida, defina o comprimento de onda de detecção de acordo com o espectro de emissões.Defina a resolução XY, a velocidade de varredura e o tamanho do pinhole. Ajuste também a potência do laser, o ganho do amplificador do detector e o deslocamento até que uma imagem adequada seja obtida. Determine o tamanho do revestimento com base no tamanho do ROI, garantindo que todo o comprimento e largura do ROI sejam capturados.Navegue pelo tecido em todos os planos e defina os pontos de partida e os pontos finais da pilha. Defina o tamanho da etapa Z, de acordo com a resolução Z desejada. Colete as imagens e processe-as usando software de análise de imagem.Usando este protocolo, foi alcançada a limpeza óptica de uma fatia cerebral do rato de uma espessura milimétrica. A expressão EGFP no córtex cerebral dos camundongos PV-FGL mostrou que a fluorescência e a integridade estrutural dos tecidos foram preservadas. As incompatibilidades de índices refrativos induzidas causaram uma perda notável de brilho da imagem e resolução de neurônios positivos EGFP.Esses neurônios foram claramente visualizados com o microscópio de varredura a laser confocal quando a coleira de correção foi ajustada para corresponder a esta solução ScaleS4. A reconstrução 3D dos neurônios rotulados por EGFP no córtex somatosensorial primário do camundongo foi feita em uma fatia cerebral de um milímetro de espessura. Arboris dendráticos individuais decorados com espinhas dendríticas foram vistos em maior ampliação.Arborização terminal axon e boutons axonal também foram observados nas fatias. A correspondência de índice reflexivo entre fluido de imagem e lente de objeto é fundamental para imagens 3D em tecidos limpos. Nossa técnica facilitaria a integração da estrutura dos neurônios do circuito às escalas de componentes, fornecendo insights sobre mecanismos de neurônios, informações de processamento no cérebro.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Neurociência

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Criopreservação de tecido cortical Blocos de Geração de culturas altamente enriquecido Neuronal

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-Resolution Imaging da Neuronal Vesicles Dense-core

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

A incubação prolongada de aguda Neuronal Tissue de Eletrofisiologia e cálcio-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Rewiring Neuronal Circuits: um novo método para Fast Neurite Extension e Functional Neuronal Connection

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Um método de limpeza de tecido hidrofóbico para tecido cerebral de rato

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparando melanogaster de Drosophila adulto para imagem cerebral inteira durante respostas comportamentais e estímulos

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Imagem de células vivas ROS durante o desenvolvimento neuronal

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Imunostaining de Retinas de Monte Inteiro com o Método de Limpeza tecidual CLARITY

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...