Name: a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

Författarna tackar Yoko Ishida (Juntendo University) för AAV-vektorproduktion och Kisara Hoshino (Juntendo University) för tekniskt bistånd. Denna studie stöddes av JSPS KAKENHI (JP20K07231 till K.Y.; JP21H03529 till T.F.; JP20K07743 till M.K.; JP21H02592 till H.H.) och vetenskaplig forskning om innovativt område "Resonansbio" (JP18H04743 till H.H.). Denna studie stöddes också av Japan Agency for Medical Research and Development (AMED) (JP21dm0207112 till T.F. och H.H.), Moonshot R&D från Japan Science and Technology Agency (JST) (JPMJMS2024 till H.H.), Fusion Oriented Research for disruptive Science and Technology (FOREST) från JST (JPMJFR204D till H.H.), Grants-in-Aid från Research Institute for Diseases of Old Age vid Juntendo University School of Medicine (X2016 till K.Y.; X2001 till H.H.) och Private School Branding Project.

Alla experiment godkändes av Institutional Animal Care and Use Committees of Juntendo University (godkännande nr 2021245, 2021246) och utfördes i enlighet med grundläggande riktlinjer för korrekt genomförande av djurförsök av Japans vetenskapsråd (2006). Här användes manliga C57BL / 6J-möss injicerade med AAV-vektor som bär förbättrad grön fluorescerande protein (EGFP) gen och parvalbumin (PV) / myristoylering-EGFP-low-density lipoprotein receptor C-terminal bakteriell artificiell kromosom (BAC) transgena...

<ol>
	<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+light+microscopy/electron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method,+ScaleSF.">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601 (2022).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy.">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li><li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre/lox+system.">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).</li><li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites.">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li><li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons:+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system.">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex.">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li><li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat:+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors.">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).</li><li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum.">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons.">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331 (2016).</li></ol>

Kritiska steg inom protokollet Det finns några kritiska steg i protokollet som bör genomföras med största försiktighet för att få meningsfulla resultat. Enhetlig fixering av prover är absolut nödvändigt för 3D-avbildning i storskaliga vävnader. Objektivlinsen, provet och nedsänkningsvätskan ska ha matchande RI. RI-missmatchning bland dem kommer att leda till mycket störd avbildning av EGFP-uttryckande celler i de rensade hjärnskivorna (figur 3). Korrigeringskragens jus...

Vävnadsrensningsmetoder har förbättrat djupoberoende avbildning av biologiska och kliniska prover med ljusmikroskopi, vilket möjliggör extraktion av strukturell information på intakta vävnader 1,2. Optiska röjningstekniker kan också potentiellt påskynda och minska kostnaden för histologisk analys. För närvarande finns tre huvudsakliga clearingmetoder tillgängliga: hydrofila, hydrofoba och hydrogelbaserade metoder 1,2. Hydrofila tillvägagångssätt överträffar när det gäller att bevara fluorescenssignaler och vävnadsintegritet och är mindre giftiga jämfört med de andra två tillvägagångssätten 3,4.
En hydrofil röjningsmetod, ScaleS, har en särställning med sitt bevarande av strukturell och molekylär integritet samt potent röjningsförmåga (clearing-bevarandespektrum)5. I en tidigare studie utvecklade vi ett snabbt och isometriskt clearingprotokoll, ScaleSF, för vävnadsskivor (~1 mm tjocklek) genom att modifiera röjningsproceduren för ScaleS6. Detta clearingprotokoll kräver sekventiella inkubationer av hjärnskivor i tre lösningar för 10,5-14,5 h. Metoden har ett högt clearing-bevarandespektrum, vilket är kompatibelt även med elektronmikroskopi (EM) -analys (kompletterande figur 1), vilket möjliggör flerskalig högupplöst tredimensionell (3D) avbildning med exakt signalrekonstruktion6. Således bör ScaleSF vara effektiv särskilt i hjärnan, där neuronala celler utarbetar sprudlande processer av enorm längd och ordnar specialiserade fina subcellulära strukturer för överföring och mottagning av information. Att extrahera strukturell information med skalor från krets till subcellulära nivåer på neuronala celler är ganska användbart för bättre förståelse av hjärnans funktioner.
Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att visualisera neuronala strukturer med skalor från den mesoskopiska / kretsen till mikroskopisk / subcellulär nivå med ScaleSF. Protokollet inkluderar vävnadsberedning, vävnadsförtydligande, hantering av rensade vävnader och konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) avbildning av rensade vävnader. Vårt protokoll fokuserar på att förhöra neuronala strukturer från krets till subcellulära komponentskalor. För en detaljerad procedur för beredning av lösningarna och stereotaxisk injektion av adenoassocierade virusvektorer (AAV) i mushjärnor, se Miyawaki et al.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16x multi-immersion objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TaKaRa Bio</td>
			<td>L03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13407-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06286-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-cyclodextrin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essential</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>ver. 9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27575-31</td>
			<td>10x PBS(&#8211;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31233-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating tissue slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales

Ett detaljerat protokoll tillhandahålls här för att visualisera neuronala strukturer från mesoskopiska till mikroskopiska nivåer i hjärnvävnader. Neuronala strukturer som sträcker sig från neurala kretsar till subcellulära neuronala strukturer visualiseras i mushjärnskivor optiskt rensade med ScaleSF. Denna clearingmetod är en modifierad version av ScaleS och är en hydrofil vävnadsrensningsmetod för vävnadsskivor som uppnår potent röjningsförmåga samt en hög grad av bevarande av fluorescenssignaler och strukturell integritet. En anpassningsbar tredimensionell (3D) tryckt bildkammare är utformad för tillförlitlig montering av rensade hjärnvävnader. Mushjärnor injicerade med en adenoassocierad virusvektor som bär förbättrad grön fluorescerande proteingen fixerades med 4% paraformaldehyd och skars i skivor med 1 mm tjocklek med en vibrerande vävnadsskivare. Hjärnskivorna rensades genom att följa clearingprotokollet, som inkluderar sekventiella inkubationer i tre lösningar, nämligen ScaleS0-lösning, fosfatbuffertsaltlösning (–) och ScaleS4-lösning, i totalt 10,5–14,5 timmar. De rensade hjärnskivorna monterades på bildkammaren och inbäddades i 1,5% agarosgel upplöst i ScaleS4D25(0)-lösning. 3D-bildinhämtningen av skivorna utfördes med hjälp av ett konfokalt laserscanningsmikroskop utrustat med en objektivlins med flera nedsänkningar med långt arbetsavstånd. Från och med mesoskopisk neuronal avbildning lyckades vi visualisera fina subcellulära neuronala strukturer, såsom dendritiska ryggar och axonala boutoner, i de optiskt rensade hjärnskivorna. Detta protokoll skulle underlätta förståelsen av neuronala strukturer från krets till subcellulära komponentskalor.

Optisk rensning av en mushjärnskiva med 1 mm tjocklek uppnåddes med hjälp av detta protokoll. Figur 1B representerar överföringsbilder av en mushjärnskiva före och efter rensningsbehandlingen. Vävnadsrensningsmetoden gjorde en 1 mm tjock mushjärnskiva transparent. En liten expansion i slutliga storlekar av hjärnskivor hittades efter inkubationen i clearinglösningen i 12 timmar (linjär expansion: 102,5% ± 1,3%). Bevarandet av fluorescens och strukturell integritet hos vävnaderna bedömdes m...

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Protokollet ger en detaljerad metod för neuronal avbildning i hjärnskiva med hjälp av en vävnadsrensningsmetod, ScaleSF. Protokollet inkluderar beredning av hjärnvävnad, vävnadsförtydligande, hantering av rensade skivor och konfokal laserskanningsmikroskopiavbildning av neuronala strukturer från mesoskopiska till mikroskopiska nivåer.

En vävnadsrensningsmetod för neuronal avbildning från mesoskopiska till mikroskopiska skalor

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Vårt protokoll skulle underlätta undersökning av neuronala strukturer från krets till komponentskalor vilket är viktigt för bättre förståelse av hjärnans funktioner. Vår clearingteknik, ScaleSF, utövar potent röjningsförmåga, samt en hög nivå av vävnadsbevarande som krävs för samtidig visualisering av både stora och små strukturer. Vårt protokoll är särskilt effektivt i hjärnan där neuronala celler uppvisar utarbetade processer, enorma länkar och ordnar specialiserade fina subcellulära strukturer.Innan du påbörjar experimentet, förbered Sca/eS-lösningar enligt denna tabell och täck proverna med folie. Börja proceduren genom att tillsätta åtta milliliter vardera av ScaleS0- och ScaleS4-lösningar till två separata brunnar av en sexbrunnscellodlingsplatta och förvärm plattan till 37 grader Celsius i en inkubator. Överför hjärnskivorna till den förvärmda ScaleS0-lösningen med en spatel och inkubera skivorna i två timmar vid 37 grader Celsius i en skakinkubator vid 90 rpm.Överför sedan de permeabiliserade hjärnskivorna i åtta milliliter PBS minus i en sexbrunnscellodlingsplatta och tvätta i 15 minuter genom att hålla i en orbitalskakare vid 40 till 60 RPM. Upprepa detta steg två gånger. Överför sedan hjärnskivorna i åtta milliliter förvärmd ScaleS4-lösning och inkubera i åtta till 12 timmar vid 90 varv / min vid 37 grader Celsius.För kammarförberedelse, 3D-utskrift av kammarramen och mikroskopstegadaptrarna. Fäst kammarramen på ett täckglas med ett tryckkänsligt lim. Förbered 1,5% agaros i ScaleS4D25(0)-lösning.Blanda lösningen och mikrovågsugn tills agarosen är helt upplöst. Låt sedan lösningen svalna till 37 grader Celsius. Montera den rensade hjärnskivan på bildkammarens nedre täckglas med en spatel.Ta bort överskottslösningen från den rensade skivan med en ren vävnad. Tillsätt ScaleS4-gelén i hjärnskivan med en mikropipett för att fylla bildkammaren. Placera ett annat täckglas ovanpå med pincett följt av en bit silkespapper och en glasskiva.Överför bildkammaren till ett kylskåp vid fyra grader Celsius. Placera metallvikter på glasskivan och låt dem stå i 30 minuter. Efter inkubationen, ta bort materialet från bildkammaren och torka av överflödig gel.Placera bildkammaren i en 60 millimeters petriskål i glas och fäst bildkammarens kant på flera punkter i skålen med ett tryckkänsligt lim. Häll ScaleS4-lösningen i skålen och skaka försiktigt i en timme vid 40 till 60 varv / min vid 20 till 25 grader Celsius. Ersätt med färsk lösning och ta bort luftbubblor på gelytan genom att försiktigt skrapa ytan med en pipettspets.Montera bildkammaren på ett mikroskopsteg. Förbered ett konfokalt laserscanningsmikroskop utrustat med en objektivlins med flera nedsänkningar på 2,5 millimeter arbetsavstånd, 16x förstoring och 0,60 numerisk bländare. Slå på all relevant bildutrustning, till exempel arbetsstation, mikroskop, skanner, lasrar, kvicksilverlampa och starta en bildprogramvara.Ställ in korrigeringskragen på objektivlinsen med flera nedsänkningar på 1,47. Sänk ner objektivlinsen i lösningen och låt den närma sig segmentet långsamt. Ta bort alla luftbubblor som är instängda på objektivlinsens spets.Hitta regioner av intresse för rensade vävnader med epifluorescens. Om du vill ställa in parametrar för bildinsamling bestämmer du först bitdjupet för bildförvärv när bildens storlek ökar med biten. Ställ sedan in detektionsvåglängden enligt emissionsspektrumet.Ställ in XY-upplösning, skanningshastighet och pinhålstorlek. Justera också lasereffekten, detektorförstärkarens förstärkning och förskjutning tills en lämplig bild erhålls. Bestäm plattsättningsstorleken baserat på ROI-storleken och se till att hela ROI-längden och bredden på ROI fångas.Navigera genom vävnaden i alla plan och ställ in start och slutpunkter för stacken. Ställ in Z-stegstorleken enligt önskad Z-upplösning. Samla in bilderna och bearbeta dem med hjälp av bildanalysprogramvara.Med hjälp av detta protokoll uppnåddes optisk rensning av en mushjärnskiva med en millimeter tjocklek. EGFP-uttryck i hjärnbarken hos PV-FGL-möss visade att fluorescensen och den strukturella integriteten hos vävnaderna bevarades. Brytningsindexmatchning inducerade avvikelser orsakade en märkbar förlust av bildens ljusstyrka och upplösning av EGFP-positiva neuroner.Dessa neuroner visualiserades tydligt med det konfokala laserscanningsmikroskopet när korrigeringskragen justerades för att matcha denna ScaleS4-lösning. 3D-rekonstruktion av EGFP-märkta nervceller i musens primära somatosensoriska cortex gjordes i en en millimeter tjock hjärnskiva. Individuella dendritiska arbors dekorerade med dendritiska spines sågs vid högre förstoring.Axon terminal arborisering och axonala boutoner observerades också i skivorna. Reflekterande indexmatchning mellan bildvätska och objektlins är avgörande för 3D-avbildning i rensade vävnader. Vår teknik skulle underlätta integrering av neuronstruktur från krets till komponentskalor, vilket ger insikter i neuronmekanismer, information om bearbetning i hjärnan.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Märkning av nervceller från gnagare och icke-mänskliga primater Slices Brain

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Automatiserad Sholl Analys av digitaliserade Neuronal Morfologi på flera skalor

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Frysförvaring av kortikal vävnad block för generering av höganrikat Neuronal kulturer

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-upplösning avbildning av neurala Tät-core Blåsor

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Förlängd inkubation av akut neuronal vävnad för elektrofysiologi och kalcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Rewiring Neuronal Circuits: En ny metod för snabb Neurit förlängning och funktionell Neuronal anslutning

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

En hydrofobisk vävnadsrensningsmetod för råtta hjärnvävnad

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Förbereda vuxen Drosophila melanogaster för hela hjärnan imaging under beteende och Stimuli svar

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

ROS Live Cell Imaging under neuronal utveckling

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

Immunostaining av helmonterade näthinnor med CLARITY Tissue Clearing Method

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...