Name: a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales
Uploaded: 2022-05-10T16:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

Yazarlar, AAV vektör üretimi için Yoko Ishida'ya (Juntendo Üniversitesi) ve teknik yardım için Kisara Hoshino'ya (Juntendo Üniversitesi) teşekkür eder. Bu çalışma JSPS KAKENHI (JP20K07231 to K.Y.; JP21H03529 için T.F.; JP20K07743 için M.K.; JP21H02592 için H.H.) ve Yenilikçi Alan "Rezonans Biyosu" Üzerine Bilimsel Araştırma (JP18H04743 ila H.H.). Bu çalışma aynı zamanda Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı (AMED) (JP21dm0207112'den T.F. ve H.H.'ye), Japonya Bilim ve Teknoloji Ajansı'ndan (JST) Moonshot Ar-Ge'si (JPMJMS2024'ten H.H.'ye), JST'den Yıkıcı Bilim ve Teknoloji için Füzyon Odaklı Araştırma (FOREST) (JPMJFR204D'den H.H.'ye), Juntendo Üniversitesi Tıp Fakültesi Yaşlılık Hastalıkları Araştırma Enstitüsü'nden Yardım-Hibeler (X2016'dan K.Y.'ye; X2001'den H.H.'ye) ve Özel Okul Markalaşma Projesi.

Tüm deneyler, Juntendo Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri (Onay No. 2021245, 2021246) tarafından onaylanmış ve Japonya Bilim Konseyi (2006) tarafından Hayvan Deneylerinin Uygun Şekilde Yürütülmesi için Temel Kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Burada, gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) geni taşıyan AAV vektörü enjekte edilen erkek C57BL/6J fareler ve parvalbümin (PV)/miristoilasyon-EGFP-düşük yoğunluklu lipoprotein reseptörü C-terminal bakteriyel yapay ...

<ol>
	<li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+Toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Reviews of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Furuta, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+light+microscopy/electron+microscopy+neuronal+imaging+from+brain+to+synapse+with+a+tissue+clearing+method,+ScaleSF.">Multi-scale light microscopy/electron microscopy neuronal imaging from brain to synapse with a tissue clearing method, ScaleSF.</a> iScience. 25 (1), 103601 (2022).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+cleared+brain+by+confocal+laser-scanning+microscopy.">Deep imaging of cleared brain by confocal laser-scanning microscopy.</a> Protocol Exchange. , (2016).</li><li>Okamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exclusive+labeling+of+direct+and+indirect+pathway+neurons+in+the+mouse+neostriatum+by+an+adeno-associated+virus+vector+with+Cre/lox+system.">Exclusive labeling of direct and indirect pathway neurons in the mouse neostriatum by an adeno-associated virus vector with Cre/lox system.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100230 (2021).</li><li>Kameda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin-producing+cortical+interneurons+receive+inhibitory+inputs+on+proximal+portions+and+cortical+excitatory+inputs+on+distal+dendrites.">Parvalbumin-producing cortical interneurons receive inhibitory inputs on proximal portions and cortical excitatory inputs on distal dendrites.</a> The European Journal of Neuroscience. 35 (6), 838-854 (2012).</li><li>Sohn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+vector+platform+for+high-level+gene+transduction+of+central+neurons:+Adeno-associated+virus+vector+equipped+with+the+Tet-off+system.">A single vector platform for high-level gene transduction of central neurons: Adeno-associated virus vector equipped with the Tet-off system.</a> PLoS One. 12 (1), 0169611 (2017).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Stepanyants, A., Martinez, L. M., Ferecsko, A. S., Kisvarday, Z. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fractions+of+short-+and+long-range+connections+in+the+visual+cortex.">The fractions of short- and long-range connections in the visual cortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3555-3560 (2009).</li><li>Kuramoto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+types+of+thalamocortical+projections+from+the+motor+thalamic+nuclei+of+the+rat:+a+single+neuron-tracing+study+using+viral+vectors.">Two types of thalamocortical projections from the motor thalamic nuclei of the rat: a single neuron-tracing study using viral vectors.</a> Cerebral Cortex. 19 (9), 2065-2077 (2009).</li><li>Matsuda, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nigrostriatal+dopaminergic+neurons+form+widely+spread+and+highly+dense+axonal+arborizations+in+the+neostriatum.">Single nigrostriatal dopaminergic neurons form widely spread and highly dense axonal arborizations in the neostriatum.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (2), 444-453 (2009).</li><li>Lin, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+and+projection-specific+brain-wide+reconstruction+of+single+neurons.">Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons.</a> Nature Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).</li><li>Winnubst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+1,000+projection+neurons+reveals+new+cell+types+and+organization+of+long-range+connectivity+in+the+mouse+brain.">Reconstruction of 1,000 projection neurons reveals new cell types and organization of long-range connectivity in the mouse brain.</a> Cell. 179 (1), 268-281 (2019).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Scientific Reports. 6, 34331 (2016).</li></ol>

Protokol içindeki kritik adımlar Protokolde, anlamlı sonuçlar elde etmek için azami dikkatle yürütülmesi gereken birkaç kritik adım vardır. Numunelerin düzgün bir şekilde sabitlenmesi, büyük ölçekli dokularda 3D görüntüleme için zorunludur. Objektif lens, numune ve daldırma sıvısı eşleşen RI'ya sahip olmalıdır. Aralarındaki RI-uyumsuzluğu, temizlenmiş beyin dilimleri içindeki EGFP eksprese eden hücrelerin oldukça rahatsız edici görüntülenmesine yol açacaktır (...

Doku temizleme yöntemleri, biyolojik ve klinik örneklerin ışık mikroskobu ile derinlikten bağımsız görüntülenmesini geliştirerek bozulmamış dokular üzerindeki yapısal bilgilerin çıkarılmasına olanak sağlamıştır 1,2. Optik temizleme teknikleri de potansiyel olarak hızlanabilir ve histolojik analiz maliyetini azaltabilir. Şu anda, üç ana temizleme yaklaşımı mevcuttur: hidrofilik, hidrofobik ve hidrojel bazlı yöntemler 1,2. Hidrofilik yaklaşımlar floresan sinyallerini ve doku bütünlüğünü korumada aşar ve diğer iki yaklaşıma kıyasla daha az toksiktir 3,4.
Bir hidrofilik temizleme yöntemi olan ScaleS, yapısal ve moleküler bütünlüğün korunmasının yanı sıra güçlü temizleme kabiliyeti (temizleme-koruma spektrumu) ile ayırt edici bir konuma sahiptir5. Önceki bir çalışmada, Sca l eS6'nın temizleme prosedürünü değiştirerek doku dilimleri (~ 1 mm kalınlığında) için hızlı ve izometrik bir temizleme protokolü olan ScaleSF'yi geliştirdik. Bu temizleme protokolü, beyin dilimlerinin 10.5-14.5 saat boyunca üç çözeltide sıralı inkübasyonunu gerektirir. Yöntem, elektron mikroskobu (EM) analizi (Ek Şekil 1) ile bile uyumlu olan ve doğru sinyal rekonstrüksiyonu ile çok ölçekli yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) görüntülemeye izin veren yüksek bir temizleme-koruma spektrumu ile donatılmıştır6. Bu nedenle, ScaleSF, özellikle nöronal hücrelerin muazzam uzunlukta coşkulu süreçleri detaylandırdığı ve bilgi iletmek ve almak için uzmanlaşmış ince hücre altı yapıları düzenlediği beyinde etkili olmalıdır. Nöronal hücreler üzerinde devreden hücre altı seviyelere kadar olan ölçeklerle yapısal bilginin çıkarılması, beyin fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması için oldukça yararlıdır.
Burada, ScaleSF kullanarak mezoskopik / devreden mikroskobik / hücre altı seviyeye kadar ölçeklerle nöronal yapıları görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Protokol, doku hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dokuların işlenmesi ve temizlenmiş dokuların konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) görüntülemesini içerir. Protokolümüz, devreden hücre altı bileşen ölçeklerine kadar nöronal yapıları sorgulamaya odaklanmaktadır. Adeno ilişkili virüs (AAV) vektörlerinin fare beyinlerine çözeltilerinin hazırlanması ve stereotaksik enjeksiyonu için ayrıntılı bir prosedür için, sırasıyla Miyawaki ve ark. 20167 ve Okamoto ve ark. 20218'e bakınız.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>16x multi-immersion objective lens</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>HC FLUOTAR 16x/0.60 IMM CORR VISIR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>01028-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>TaKaRa Bio</td>
			<td>L03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>13407-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Sorbitol</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>06286-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#947;-cyclodextrin</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td>037-10643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huygens Essential</td>
			<td>Scientific Volume Imaging</td>
			<td>ver. 18.10.0p8/21.10.1p0 64b</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td>ver. 9.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>LAS X, ver. 3.5.5.19976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td>Tokyo Chemical Industry</td>
			<td>M1356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1.04005.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (10x; pH 7.4)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>27575-31</td>
			<td>10x PBS(&#8211;)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>31233-55</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pentobarbital</td>
			<td>Kyoritsu Seiyaku</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35501-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>35940-65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating tissue slicer</td>
			<td>Dosaka EM</td>
			<td>PRO7N</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a tissue clearing method for neuronal imaging from mesoscopic to microscopic scales

Burada beyin dokularında mezoskopik seviyelerden mikroskobik seviyelere kadar nöronal yapıları görselleştirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Nöral devrelerden hücre altı nöronal yapılara kadar değişen nöronal yapılar, ScaleSF ile optik olarak temizlenmiş fare beyin dilimlerinde görselleştirilir. Bu temizleme yöntemi, ScaleS'nin modifiye edilmiş bir versiyonudur ve güçlü temizleme kabiliyetinin yanı sıra floresan sinyallerinin ve yapısal bütünlüğün yüksek düzeyde korunmasını sağlayan doku dilimleri için hidrofilik bir doku temizleme yöntemidir. Özelleştirilebilir üç boyutlu (3D) baskılı görüntüleme odası, temizlenmiş beyin dokularının güvenilir bir şekilde monte edilmesi için tasarlanmıştır. Gelişmiş yeşil floresan protein geni taşıyan adeno ilişkili bir virüs vektörü ile enjekte edilen fare beyinleri,% 4 paraformaldehit ile sabitlendi ve titreşen bir doku dilimleyici ile 1 mm kalınlığında dilimler halinde kesildi. Beyin dilimleri, Sca l eS0 çözeltisi, fosfat tampon salin (-) ve ScaleS4 çözeltisi olmak üzere üç çözeltide sıralı inkübasyonları içeren temizleme protokolü izlenerek toplam 10.5-14.5 saat boyunca temizlendi. Temizlenmiş beyin dilimleri görüntüleme odasına monte edildi ve ScaleS4D25 (0) çözeltisinde çözünmüş% 1.5 agaroz jeline gömüldü. Dilimlerin 3D görüntü alımı, uzun bir çalışma mesafesine sahip çok daldırmalı objektif bir lens ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılarak gerçekleştirildi. Mezoskopik nöronal görüntüleme ile başlayarak, optik olarak temizlenmiş beyin dilimlerinde dendritik dikenler ve aksonal butonlar gibi ince hücre altı nöronal yapıları görselleştirmeyi başardık. Bu protokol, devreden hücre altı bileşen ölçeklerine kadar nöronal yapıların anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

Bu protokol kullanılarak 1 mm kalınlığında bir fare beyin diliminin optik olarak temizlenmesi sağlandı. Şekil 1B, temizleme işleminden önce ve sonra bir fare beyin diliminin iletim görüntülerini temsil eder. Doku temizleme yöntemi, 1 mm kalınlığında bir fare beyin dilimini şeffaf hale getirdi. Temizleme çözeltisinde 12 saat boyunca inkübasyondan sonra beyin dilimlerinin son boyutlarında hafif bir genişleme bulundu (doğrusal genişleme: % 102.5 ±% 1.3). PV-FGL farelerde floresan...

Watch this Scientific Journal Video about A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales at JoVE.com

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

Protokol, bir doku temizleme yöntemi olan ScaleSF kullanılarak beyin diliminde ayrıntılı bir nöronal görüntüleme yöntemi sağlar. Protokol, beyin dokusu hazırlama, doku berraklaştırma, temizlenmiş dilimlerin işlenmesi ve nöronal yapıların mezoskopikten mikroskobik seviyelere kadar konfokal lazer taramalı mikroskopi görüntülemesini içerir.

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Protokolümüz, beyin fonksiyonlarının daha iyi anlaşılması için gerekli olan devreden bileşen ölçeklerine kadar nöronal yapıların araştırılmasını kolaylaştıracaktır. Temizleme tekniğimiz ScaleSF, hem büyük hem de küçük ölçekli yapıların eşzamanlı olarak görselleştirilmesi için gerekli olan yüksek düzeyde doku korumasının yanı sıra güçlü temizleme kabiliyeti de sunar. Protokolümüz özellikle nöronal hücrelerin ayrıntılı süreçler, muazzam bağlantılar sergilediği ve özel ince hücre altı yapıları düzenlediği beyinde etkilidir.Deneye başlamadan önce, bu tabloda gösterildiği gibi Sca / eS çözeltileri hazırlayın ve numuneleri folyo ile örtün. Altı kuyucuklu hücre kültürü plakasının iki ayrı kuyucuğuna ScaleS0 ve ScaleS4 çözeltilerinin her birine sekiz mililitre ekleyerek prosedürü başlatın ve plakayı bir inkübatörde 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın. Beyin dilimlerini bir spatula ile önceden ısıtılmış ScaleS0 çözeltisine aktarın ve dilimleri 90 RPM'de titreyen bir inkübatörde 37 santigrat derecede iki saat boyunca inkübe edin.Daha sonra, geçirgenleştirilmiş beyin dilimlerini sekiz mililitre PBS eksi altı kuyucuklu bir hücre kültürü plakasına aktarın ve 40 ila 60 RPM'de bir yörüngesel çalkalayıcıda tutarak 15 dakika boyunca yıkayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın. Daha sonra, beyin dilimlerini sekiz mililitre önceden ısıtılmış ScaleS4 çözeltisine aktarın ve 37 santigrat derecede 90 RPM'de sekiz ila 12 saat boyunca inkübe edin.Oda hazırlığı için, oda çerçevesini ve mikroskop sahne adaptörlerini 3D yazdırın. Oda çerçevesini basınca duyarlı bir yapıştırıcı kullanarak bir kapak kapağına takın. ScaleS4D25(0)çözeltisinde %1,5 agaroz hazırlayın.Çözeltiyi karıştırın ve agaroz tamamen çözünene kadar mikrodalgada pişirin. Ardından çözeltinin 37 santigrat dereceye kadar soğumasına izin verin. Temizlenmiş beyin dilimini bir spatula ile görüntüleme odasının alt kapağına monte edin.Fazla çözeltiyi temizlenmiş dilimden temiz bir doku kullanarak çıkarın. Görüntüleme odasını doldurmak için bir mikropipet kullanarak ScaleS4 jelini beyin dilimine ekleyin. Forseps ile üstüne başka bir kapak kayması yerleştirin, ardından bir parça kağıt mendil ve bir cam slayt izleyin.Görüntüleme odasını dört santigrat derecede bir buzdolabına aktarın. Metal ağırlıkları cam slayta yerleştirin ve 30 dakika bekletin. Kuluçkadan sonra, malzemeyi görüntüleme odasından çıkarın ve fazla jeli silin.Görüntüleme odasını 60 milimetrelik cam Petri kabına yerleştirin ve görüntüleme odasının kenarını basınca duyarlı bir yapıştırıcı ile tabağa birden fazla noktadan takın. ScaleS4 çözeltisini kabın içine dökün ve 20 ila 25 santigrat derecede 40 ila 60 RPM'de bir saat boyunca hafifçe çalkalayın. Taze çözelti ile değiştirin ve bir pipet ucu kullanarak yüzeyi nazikçe kazıyarak jel yüzeyindeki hava kabarcıklarını çıkarın.Görüntüleme odasını mikroskop aşamasına monte edin. 2,5 milimetre çalışma mesafesi, 16x büyütme ve 0,60 sayısal diyafram açıklığına sahip çok daldırmalı objektif lens ile donatılmış bir konfokal lazer tarama mikroskobu hazırlayın. İş istasyonu, mikroskop, tarayıcı, lazerler, cıva lambası gibi ilgili tüm görüntüleme ekipmanlarını açın ve bir görüntüleme yazılımı başlatın.Çok daldırmalı objektif lensin düzeltme yakasını 1,47'ye ayarlayın. Objektif lensi çözeltiye daldırın ve dilime yavaşça yaklaşmasına izin verin. Objektif lensin ucunda sıkışmış tüm hava kabarcıklarını çıkarın.Epifloresan kullanarak temizlenmiş dokularla ilgili ilgi alanlarını bulun. Görüntü alma parametrelerini ayarlamak için, önce görüntünün boyutu bitle birlikte arttıkça görüntü alma için bit derinliğini belirleyin. Ardından algılama dalga boyunu emisyon spektrumuna göre ayarlayın.XY çözünürlüğünü, tarama hızını ve iğne deliği boyutunu ayarlayın. Ayrıca lazer gücünü, dedektör amplifikatör kazancını ayarlayın ve uygun bir görüntü elde edilene kadar ofsetleyin. YG'nin boyutuna göre döşeme boyutunu belirleyin ve YG'nin tüm uzunluğunun ve genişliğinin yakalanmasını sağlayın.Tüm düzlemlerde doku arasında gezinin ve yığının başlangıcını ve bitiş noktalarını ayarlayın. İstenilen Z çözünürlüğüne göre Z adım boyutunu ayarlayın. Görüntüleri toplayın ve görüntü analiz yazılımını kullanarak işleyin.Bu protokol kullanılarak, bir milimetre kalınlığında bir fare beyin diliminin optik olarak temizlenmesi sağlandı. PV-FGL farelerin serebral korteksindeki EGFP ekspresyonu, dokuların floresansının ve yapısal bütünlüğünün korunduğunu göstermiştir. Kırılma indisi uyumsuzluğuna bağlı anormallikler, EGFP pozitif nöronların görüntü parlaklığında ve çözünürlüğünde gözle görülür bir kayba neden oldu.Bu nöronlar, düzeltme tasması bu ScaleS4 çözümüne uyacak şekilde ayarlandığında konfokal lazer tarama mikroskobu ile açıkça görselleştirildi. Fare primer somatosensoriyel korteksindeki EGFP etiketli nöronların 3D rekonstrüksiyonu bir milimetre kalınlığında bir beyin diliminde yapıldı. Dendritik dikenlerle süslenmiş bireysel dendritik arbors daha yüksek büyütmede görülmüştür.Dilimlerde akson terminal arborizasyonu ve aksonal butonlar da gözlendi. Görüntüleme sıvısı ve nesne lensi arasındaki yansıtıcı indeks eşleşmesi, temizlenmiş dokularda 3D görüntüleme için kritik öneme sahiptir. Tekniğimiz, nöron yapısını devreden bileşen ölçeklerine entegre etmeyi kolaylaştıracak, nöron mekanizmalarına, beyindeki işleme bilgisine dair bilgiler sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Çoklu Ölçeklerde Sayısallaştırılmış Nöronal Morfoloji Otomatik Sholl Analizi

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

Yüksek zenginleştirilmiş Nöronal Kültürlerin Üretimi için Kortikal Doku Blokları, Kriyoprezervasyon

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Nöronal Yoğun çekirdekli Keseciklerinde süper çözünürlüklü Görüntüleme

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Elektrofizyoloji ve Kalsiyum-görüntüleme için akut nöronal Doku Uzamış İnkübasyon

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

A Hydrophobic Tissue Clearing Method for Rat Brain Tissue

Sıçan Beyin Dokusu için Hidrofobik Doku Temizleme Yöntemi

Hydrophobic tissue clearing methods are easily adjustable, fast, and low-cost procedures that allows for the study of a molecule of interest in unaltered ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

Davranış ve Uyaran Yanıtları Sırasında Yetişkin Drosophila melanogaster'ı Tüm Beyin Görüntülemeye Hazırlama

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Nöronal Gelişim Sırasında ROS Canlı Hücre Görüntüleme

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

Immunostaining of Whole-Mount Retinas with the CLARITY Tissue Clearing Method

CLARITY Doku Temizleme Yöntemi ile Tüm Mount Retinaların İmmünasyonunun İmmünasyon

The tissue hydrogel delipidation method (CLARITY), originally developed by the Deisseroth laboratory, has been modified and widely used for immunostaining ...