Наш протокол облегчит исследование нейронных структур от схемы до компонентного масштаба, что важно для лучшего понимания функций мозга. Наша техника очистки, ScaleSF, обладает мощными возможностями очистки, а также высоким уровнем сохранности тканей, который необходим для одновременной визуализации как крупных, так и мелких структур. Наш протокол особенно эффективен в мозге, где нейронные клетки демонстрируют сложные процессы, огромные связи и организуют специализированные тонкие субклеточные структуры.
Перед началом эксперимента подготовьте растворы Sca/eS, как показано в этой таблице, и покройте образцы фольгой. Начните процедуру с добавления восьми миллилитров каждого из растворов ScaleS0 и ScaleS4 в две отдельные лунки пластины для культивирования шестилуночных клеток и предварительно разогрейте пластину до 37 градусов Цельсия в инкубаторе. Переложите ломтики мозга в предварительно нагретый раствор ScaleS0 шпателем и высиживайте ломтики в течение двух часов при 37 градусах Цельсия в встряхивающемся инкубаторе при 90 об/мин.
Затем перенесите пермеабилизированные срезы мозга в восемь миллилитров PBS минус в шестилуночную пластину для культивирования клеток и промыть в течение 15 минут, держа в орбитальном шейкере при 40-60 оборотах в минуту. Повторите этот шаг дважды. Затем переложите срезы мозга в восемь миллилитров предварительно разогретого раствора ScaleS4 и инкубируйте в течение восьми-12 часов при 90 об/мин при 37 градусах Цельсия.
Для подготовки камеры 3D-печать камерной рамы и адаптеров сцены микроскопа. Прикрепите раму камеры к крышке с помощью чувствительного к давлению клея. Готовят 1,5% агарозу в растворе ScaleS4D25(0)..
Перемешайте раствор и разогрейте его в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Затем дайте раствору остыть до 37 градусов Цельсия. Установите очищенный мозговой срез на нижнюю крышку камеры визуализации шпателем.
Удалите лишний раствор с очищенного среза с помощью чистой ткани. Добавьте гель ScaleS4 в срез мозга с помощью микропипетки, чтобы заполнить камеру визуализации. Положите сверху еще одну крышку с щипцами, а затем лист папиросной бумаги и стеклянную горку.
Переместите камеру визуализации в холодильник при четырех градусах Цельсия. Поместите металлические гири на стеклянную горку и оставьте их на 30 минут. После инкубации извлеките материал из камеры визуализации и вытрите лишний гель.
Поместите камеру визуализации в 60-миллиметровую стеклянную чашку Петри и прикрепите ободок камеры визуализации в нескольких точках к чашке чувствительным к давлению клеем. Налейте раствор ScaleS4 в посуду и аккуратно встряхните в течение одного часа при 40-60 об/мин при температуре от 20 до 25 градусов Цельсия. Заменить свежим раствором и удалить пузырьки воздуха на поверхности геля, аккуратно соскоблив поверхность с помощью наконечника пипетки.
Установите камеру визуализации на ступень микроскопа. Подготовьте конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, оснащенный объективом с несколькими погружениями с рабочим расстоянием 2,5 миллиметра, 16-кратным увеличением и числовой апертурой 0,60. Включите все необходимое оборудование для обработки изображений, такое как рабочая станция, микроскоп, сканер, лазеры, ртутная лампа, и запустите программное обеспечение для визуализации.
Установите корректирующий воротник объектива с несколькими погружениями на 1,47. Погрузите объектив в раствор и позвольте ему медленно приблизиться к срезу. Удалите все пузырьки воздуха, захваченные на кончике объектива.
Найдите области, представляющие интерес в очищенных тканях с помощью эпифлуоресценции. Чтобы задать параметры получения изображения, сначала определите битовую глубину для получения изображения по мере увеличения размера изображения с битом. Затем установите длину волны обнаружения в соответствии со спектром излучения.
Установите разрешение XY, скорость сканирования и размер точечного отверстия. Также отрегулируйте мощность лазера, усиление усилителя детектора и смещение до получения подходящего изображения. Определите размер плитки на основе размера ROI, гарантируя, что вся длина и ширина ROI фиксируются.
Перемещайтесь по ткани во всех плоскостях и устанавливайте начальную и конечную точки стека. Установите размер шага Z в соответствии с требуемым разрешением Z. Собирайте изображения и обрабатывайте их с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
С помощью этого протокола была достигнута оптическая очистка среза мозга мыши толщиной в один миллиметр. Экспрессия EGFP в коре головного мозга мышей PV-FGL показала, что флуоресценция и структурная целостность тканей сохраняется. Несоответствие показателя преломления, вызванное аберрациями, вызвало заметную потерю яркости изображения и разрешения EGFP-положительных нейронов.
Эти нейроны были четко визуализированы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа, когда коррекционный ошейник был скорректирован в соответствии с этим решением ScaleS4. 3D-реконструкция меченых EGFP нейронов в первичной соматосенсорной коре мыши была выполнена в срезе мозга толщиной в один миллиметр. Отдельные дендритные беседки, украшенные дендритными шипами, были замечены при более высоком увеличении.
В срезах также наблюдалась терминальная арборизация аксонов и аксональные бутоны. Соответствие отражающего индекса между жидкостью визуализации и линзой объекта имеет решающее значение для 3D-визуализации в очищенных тканях. Наша методика облегчит интеграцию структуры нейронов от схемы к компоненту, обеспечивая понимание нейронных механизмов, информацию об обработке в мозге.
