Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

يود المؤلفون أن ينوهوا المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (رقم المنحة. GNT1111694 و GNT1141602) ومجلس البحوث الأسترالي (رقم المنحة. FT180100417 وFL150100060 وCE14100036). يود المؤلفون أن ينوهوا بمرفق التصوير الطبي الحيوي في جامعة نيو ساوث ويلز. تم إنشاء الأشكال باستخدام Biorender.com و Adobe Photoshop و Adobe Illustrator وتم تصديرها بموجب اشتراك مدفوع.

1. تصنيع الحبر العظمي
<ol><li>تخليق فوسفات α-tricalcium<ol><li>قم بوزن مساحيق فوسفات هيدروجين الكالسيوم (CaHPO4) وكربونات الكالسيوم (CaCO 3) بنسبة مولار3: 2 Ca: P. باستخدام ملعقة ، قم بتجانس المساحيق تماما.</li>
		<li>أضف خليط مسحوق فوسفات هيدروجين الكالسيوم وكربونات الكالسيوم إلى بوتقة زركوني...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

تم تطوير تقنية الطباعة 3D COBICS لتمكين تصنيع الهياكل الشبيهة بالعظام المعدنية عن طريق البثق إلى تعليق ميكروجيل قابل للتشابك يحتوي على خلايا حية. تم تطبيق هذه التقنية على معلق ميكروجيل قابل للتحلل ، وتظهر الخلايا قدرة جيدة على الجدوى والانتشار والتمايز العظمي داخل النظام11. أحد ا...

تتمتع العظام بقدرات تجديد ملحوظة كواحدة من الهياكل القليلة في الجسم التي يمكن أن تلتئم عن طريق إعادة تكوين تركيبتها الخلوية الطبيعية واتجاهها وقوتها الميكانيكية حتى حجم العيب الحرج ، عندما تتعرض قدرة الشفاء الداخليةللخطر 1. العظام ، جنبا إلى جنب مع الغضاريف والأربطة ، تدعم وتسهل حركة الجسم ، مع تخزين المعادن والدهون وإنتاج خلايا الدم. كنسيج ضام صلب وكثيف ، يتكون العظم بشكل أساسي من طور غير عضوي وماء ومواد عضوية تتكون بشكل أساسي من ألياف الكولاجين2. يتم تضمين الخلايا داخل هذه المصفوفة عالية التمعدن من ألياف الكولاجين I وبلورات هيدروكسيباتيت (HA) ، وتشكل بنية هرمية3.
إن التنظيم المعقد لهذا النسيج يجعل تصنيع البدائل الاصطناعية لتكرار البيئات الدقيقة والنانوية العظمية غير المتجانسة تحديا استثنائيا3. لهذا الغرض ، تم اقتراح مجموعة متنوعة من المواد ، بما في ذلك السيراميك الحيوي ، والهلاميات المائية المحملة بالخلايا ، والمواد الاصطناعية كحلول لإنشاء مصفوفات العظام. من بين تقنيات تصنيع السقالات ، ظهرت مؤخرا تقنيات تعتمد على الطباعة ثلاثية الأبعاد وحظيت باهتمام كبير من مجتمع هندسة الأنسجة نظرا لقدرتها الرائعة على السماح بتصنيع هياكل متطورة ودقيقة للغاية مع وعد كبير بالعلاج الخاص بالمريض4،5،6 . كانت الهلاميات المائية هي الخيار الأكثر شيوعا لمحاكاة المصفوفة والأحبار الحيوية حيث يمكن طباعتها مع الخلايا والجزيئات النشطة بيولوجيا ، مما يؤدي إلى إنشاء تركيبات وظيفية6. ومع ذلك ، تفتقر الهلاميات المائية إلى الخصائص الوظيفية للعظام ، مثل القوة الميكانيكية ومرحلة غير عضوية متكلسة للغاية تحتوي على خلايا نشطة أيضيا.
تتطلب سقالات السيراميك المطبوعة ثلاثية الأبعاد عادة خطوات ما بعد المعالجة ، بما في ذلك التلبيد ، أو العلاجات ذات درجات الحرارة العالية ، أو استخدام المواد الكيميائية القاسية التي يجب غسلها جيدا قبل التطبيقات في المختبر أو في الجسم الحي 5. لمعالجة هذه القيود ، طور Lode et al.7 مؤخرا عجينة أساسها فوسفات α-tricalcium مكونة من هيدروكسيباتيت ، والتي يمكن طباعتها ووضعها في ظل ظروف فسيولوجية. ومع ذلك ، لا يزال يتعذر طباعة هذه المادة مع الخلايا الحية لأنها تتطلب المعالجة اللاحقة في بيئة رطبة والغمر المائي اللاحق لفترة طويلة.
بدلا من ذلك ، تم اقتراح الهلاميات المائية المحملة بالخلايا مع جزيئات غير عضوية مدمجة كبديل لمصفوفة العظام ثلاثية الأبعاد 8,9. على الرغم من قدرتها الكبيرة على دعم بقاء الخلايا ، إلا أنها غير قادرة على تلخيص بيئة الأنسجة العظمية المعدنية الكثيفة. اعتمد Thrivikarman et al.10 نهج المحاكاة الحيوية حيث تم استخدام وسط الكالسيوم والفوسفات المفرط التشبع مع نظير بروتين غير كولاجيني لتقليد ترسب الأباتيت النانوي بشكل أفضل. ومع ذلك ، لا تزال بنياتها غير قادرة على توليد بنيات 3D جامدة مع بنية صغيرة وكبيرة تشبه العظام.
تعالج الدراسة الحالية أوجه القصور هذه من خلال تطوير استراتيجية طباعة لتصنيع تركيبات تحاكي العظام ، في المراحل غير العضوية والعضوية ، القادرة على دمج كل من الخلايا وعوامل النمو11. تلخص COBICS بشكل فريد البنية المعدنية والخلوية للعظام باستخدام تقنية الطباعة الحيوية القائمة على microgel. يصف البروتوكول هنا عملية توليف حبر العظام الخزفي والهلام الدقيق القائم على الجيلاتين ثم الجمع بين الخلايا التي تمكن COBICS. تبدأ العملية بتوليف مادة السلائف الرئيسية لحبر العظام. ثم يتم تصنيع هيدروجيل قابل للربط وتشكيله في كبسولات هلامية دقيقة. أخيرا ، يتم ترسيب حبر العظام في كل اتجاه في حمام دعم من المواد الهلامية الدقيقة المحملة بالخلايا (الشكل 1).
يمكن طباعة الحبر العظمي في أي تعليق من الهلاميات الدقيقة التي لها خصائص إجهاد الخضوع المناسبة ، أي القدرة على التمييع بمعدل قص محدد وبالتالي دعم الهيكل المترسب. تم عرض نهجين مرنين: معلق يتكون من كبسولات جيلاتينية دقيقة ومعلق يتكون من كبسولات ميكروجيلاتينية ميثاكريلات (GelMA). يذوب التعليق السابق عندما ترتفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ، وتقنية التضمين الحر القابل للانعكاس للهلاميات المائية المعلقة (FRESH)12 ، بينما يمكن ربط الأخير ضوئيا بعد الطباعة ، مما يؤدي إلى "خياطة" الكبسولات الهلامية الدقيقة معا بشكل فعال وقفل الحبر العظمي المطبوع في مكانه. تركز الدراسة الحالية على استخدام GelMA كمصفوفة لأنها توفر ميزة فريدة تتمثل في القدرة على دعم نمو الخلايا من خلال الطباعة في الموقع لهياكل محاكاة العظام المعقدة. في نهاية المطاف ، يتيح هذا النهج توليد نماذج الأنسجة المعقدة ذات المستويات العالية من المحاكاة الحيوية والآثار الواسعة لنمذجة الأمراض واكتشاف الأدوية والهندسة التجديدية.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> الشكل 1: رسم تخطيطي لسير العمل . (أ) تخليق الحبر العظمي بدءا من تخليق فوسفات α-tricalcium واتحاده اللاحق مع الجليسرول وبوليسوربات 80 وفوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة. (ب) يتم تصنيع الهلاميات الدقيقة GelMA بطريقة مستحلب الماء في الزيت. ثم يتم ترطيب الكبسولات الهلامية الدقيقة التي تم الحصول عليها (C) و (D) مع الخلايا. ثم يتم استخدام مركبات الخلايا microgel كحمام حبيبي يتم فيه ترسيب حبر العظام. (ه) ثم يتم ربط البناء بأكمله بالأشعة فوق البنفسجية ونقله إلى الحاضنة للثقافة. الاختصارات: α-TCP = فوسفات α-tricalcium ؛ GelMA = الجيلاتين ميثاكريلات. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

من الناحية الهيكلية ، فإن الأنسجة العظمية عبارة عن مركب عضوي غير عضوي يحتوي على خلايا نشطة أيضيا مضمنة داخل مصفوفة هرمية عالية التمعدن. هذه المنظمة صعبة التكرار بسبب البيئة غير المتجانسة للعظام. الطباعة الحيوية الخزفية متعددة الاتجاهات في معلقات الخلايا (COBICS) هي تقنية طباعة حيوية قائمة على ميكروجيل تكرر بشكل فريد البنية المعدنية والخلوية للعظام. تطبع COBICS تركيبات معقدة وذات صلة بيولوجية دون الحاجة إلى مواد دعم قربانية أو خطوات قاسية بعد المعالجة (مثل الإشعاع والتلبيد بدرجة حرارة عالية) ، وهما من أكبر التحديات في التصنيع الإضافي لتركيبات محاكاة العظام. يتم تمكين هذه التقنية عن طريق البثق الحر لحبر جديد قائم على فوسفات الكالسيوم داخل معلق ميكروجيل قائم على الجيلاتين. تسمح خصائص إجهاد الخضوع للتعليق بالترسب ودعم بنية العظام المطبوعة. تشابك الأشعة فوق البنفسجية والترسيب النانوي ثم "قفله" في مكانه. توفر القدرة على طباعة سيراميك محاكاة العظام ذات البنية النانوية داخل المواد الحيوية المحملة بالخلايا تحكما زمانيا مكانيا في البنية الكلية والجزئية وتسهل التصنيع في الوقت الفعلي لتركيبات العظام المعقدة في البيئات السريرية.

تطبع COBICS تركيبات معقدة وذات صلة بيولوجية دون الحاجة إلى مواد دعم قربانية أو خطوات ما بعد المعالجة القاسية (مثل الإشعاع والتلبيد بدرجة حرارة عالية) وهما من أكبر التحديات في التصنيع الإضافي لتركيبات محاكاة العظام. لإثبات تكوين COBICS للهياكل العظمية المعقدة والطباعة المشتركة للخلايا في معلقا...

Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

يصف هذا البروتوكول تقنية الطباعة 3D لتصنيع هياكل تشبه العظام عن طريق إيداع حبر فوسفات الكالسيوم في دعامة حبيبية قائمة على الجيلاتين. يتم ترسيب نظائر العظام المطبوعة في شكل حر ، مع مرونة للحصاد المباشر للطباعة أو التشابك داخل مصفوفة الخلية الحية للتركيبات متعددة الأطوار.

الطباعة الحيوية الخزفية متعددة الاتجاهات في المعلقات المحملة بالخلايا لتوليد نظائر العظام

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

يسمح هذا البروتوكول بتصنيع نظائر العظام دون الحاجة إلى تسخين أو مواد كيميائية سامة. بهذه الطريقة ، يتم تشكيل الهياكل العظمية مع إمكانية إصلاح عيب العظام في الإعدادات السريرية باستخدام خلايا المريض نفسه. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن طباعة الحبر العظمي بخلايا حية لتشكيل أي بنية معقدة تشبه العظام ولتوجيه التمايز نحو سلالة تكوين العظام.علاوة على ذلك ، يمكن تحميل الأدوية في حبر العظام لتعزيز التئام الجروح وتجديد العظام وعلاج أمراض مثل السرطان في نفس الوقت. سيوضح الإجراء جاجان جالاندهرا ، مرشح الدكتوراه في مختبري ، والدكتورة سارة رومانازو ، التي عملت معي ومع الدكتور جالاندهرا في مشاريع مختلفة ، بما في ذلك تطوير هذه التكنولوجيا. ابدأ بإضافة خليط فوسفات هيدروجين الكالسيوم ومسحوق كربونات الكالسيوم إلى بوتقة زركونيا بحيث لا تزيد عن 75٪ ممتلئة.انقل البوتقة إلى الفرن ، وقم بتسخينها إلى 1،400 درجة مئوية بمعدل خمس درجات مئوية في الدقيقة واحتفظ بها لمدة ثلاث ساعات. إخماد التفاعل عن طريق إزالة البوتقة من الفرن وتركها في الجزء العلوي من كتلة حرارية. اتركه ليبرد تماما قبل التعامل معه.استخدم ملاطا ومدقة لكسر وطحن كعكة فوسفات ألفا تريكالسيوم بحيث يكون حجم الحبيبات الناتجة 200 ميكرومتر كحد أقصى. أضف كرات زركونيا مثبتة بثلاثة ملليمترات إلى الخليط المطحون ، متبوعا بالإيثانول بنسبة 100٪. قم بتأمين الغطاء وطحنه لمدة ساعتين بمعدل 180 دورة في الدقيقة.جمع التعليق وفصل الكرات ، وذلك باستخدام 100 ٪ الإيثانول للغسيل. جفف المعلق في فرن على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. أضف المسحوق المجفف إلى برطمانات الطحن مع كرات زركونيا ملليمتر واحد و 100٪ إيثانول بنفس نسب الوزن كما في المرحلة الأولى.طحن لمدة ساعتين في 180 دورة في الدقيقة. ثم افصلها وجففها في الفرن. أخرج العينة من الفرن.لصنع حبر العظام ، أضف 630 ميكرولتر من الجلسرين و 130 ميكرولتر من بوليسوربات 80 إلى جرة كرة مل. ثم أضف 100 ملليغرام من فوسفات الأمونيوم ثنائي القاعدة وجرامين من مسحوق فوسفات ألفا تريكالسيوم إلى المحلول وحركه باستمرار باستخدام ملعقة حتى يتجانس. أضف كرة زركونيا 25 ملم ، وقم بتأمين الغطاء ووضعه داخل مطحنة كوكبية لمدة 60 دقيقة بمعدل 180 دورة في الدقيقة ، وتوقف مؤقتا في منتصف الطريق لكشط جوانب الجرة باستخدام ملعقة باستخدام ملعقة.قم بتحميل الحبر في حقنة ملليلتر. اصنع محلول 10٪ من الجيلاتين من النوع A في 1X PBS كما هو موضح في مخطوطة النص. ضع القارورة المخروطية على المحرض.ثم أضف 5.796 ملليلتر من أنهيدريد الميثاكريليك واستمر في التحريك في الظلام عند 50 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. إخماد رد الفعل عن طريق تخفيف محتويات القوارير المخروطية مرتين مع PBS. صب في أنابيب 50 ملليلتر وإزالة أنهيدريد الميثاكريليك غير المتفاعل عن طريق الطرد المركزي عند 3000 RCF في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق وجمع المادة الطافية.قم بغسيل المادة الطافية داخل أنابيب غسيل السليلوز المقطوعة 14 كيلودالتون ضد الماء منزوع الأيونات عند 40 درجة مئوية لمدة خمسة أيام مع التحريك برفق. استبدل الماء منزوع الأيونات كل يوم. استعد للتخزين عن طريق الصب في أنابيب سعة 50 ملليلتر ، وتأمين الغطاء ووضعه في الثلاجة لمدة 12 ساعة.ثم قم بتجميد العينات باستخدام النيتروجين السائل وتجفيفها على الفور لمدة خمسة أيام عند 54 درجة مئوية تحت الصفر و 0.4 مليبار. قم بتخزين الرغوة الناتجة في الثلاجة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. لتجميع الهلاميات الدقيقة GelMA ، قم بعمل محلول GelMA بالوزن بنسبة 10٪ في PBS عن طريق وزن GelMA المجفف بالتجميد ، وإضافته إلى أنبوب مع PBS وتسخينه في حمام مائي عند 50 درجة مئوية حتى يتم ترطيبه بالكامل.أضف 37 ملليلترا من الزيت لكل ملليلتر واحد من محلول GelMA إلى الدورق ، مع التأكد من أنه لا يزيد عن 65٪ ممتلئ. قم بإعداد دورق مزدوج على لوح تسخين مع التحريك المغناطيسي عن طريق وضع الكأس الزجاجية التي تحتوي على الزيت داخل كأس زجاجية أكبر. يسخن إلى 40 درجة مئوية مع التحريك.قم بتحميل محلول GelMA في حقنة وأضفه قطرة إلى زيت التحريك من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر. اترك المستحلب يتوازن لمدة 10 دقائق. خفض درجة حرارة المستحلب إلى 15 درجة مئوية إلى حراريا.ثبت الكرتين عن طريق إضافة الثلج المجروش إلى الفراغ بين الكأسين. أضف الأسيتون إلى مستحلب GelMA الدوار. صب محتويات الكأس الزجاجية في أنابيب سعة 50 ملليلتر، مع التأكد من غسل جدران الكأس الزجاجية بالأسيتون.اتركه يرتاح لمدة 20 دقيقة للسماح للمواد الهلامية الدقيقة المجففة بالاستقرار في القاع. تخلص من المادة الطافية واغسل الكبسولات الهلامية مرتين باستخدام الأسيتون. دمج في أنبوب واحد ، وأعلى مع الأسيتون وسونيكات لمدة 10 ثوان.مرة أخرى ، اغسله بالأسيتون مرتين. يحفظ في الأسيتون في درجة حرارة الغرفة حتى يكون مطلوبا للطباعة. لتحضير تعليق GelMA microgel للطباعة ، قم بصياغة محلول 1٪ بالوزن بالوزن من GelMA في DMEM كما هو موضح في مخطوطة النص.تبخر الأسيتون من الهلاميات الدقيقة المجففة ووزن المسحوق الناتج في أنبوب. أضف الأسيتون وانقله إلى بيئة معقمة. لتشكيل تعليق microgel ، تبخر الأسيتون من المسحوق داخل خزانة السلامة الحيوية.بعد التبخر ، أضف DMEM ومحلول 1٪ GelMA في DMEM ومحلول بادئ LAP 2.5٪ لتحقيق جزء تعبئة نهائي بنسبة 30٪ اتركه يرطب بالكامل لمدة 12 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. استزرع الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون في DMEM منخفض الجلوكوز المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون حتى تتلاقى. قم بإزالة الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من الدهون من قارورة زراعة الأنسجة عن طريق إزالة الوسط وغسله باستخدام PBS معقم.قم بتكوير الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 150 RCF في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. عد الخلايا واحسب ما لا يقل عن 5 × 10 للخلايا الخمس لكل ملليلتر من الهلاميات الدقيقة GelMA. قم بتخصيص الحجم المطلوب لتعليق الخلية لأنبوب منفصل وحبيبات كما هو موضح سابقا.قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية بعناية باستخدام ماصة ، ولم يتبق سوى حبيبات الخلية. أضف الحجم المطلوب من تعليق ميكروجيل إلى الحبيبات وماصة برفق لأعلى ولأسفل لضمان التوزيع المتساوي. قم بتحميل الخلية المحملة بتعليق ميكروجيل في مفاعل باستخدام ماصة.باستخدام حقنة ملليلتر واحد مزودة بإبرة قياس 23 ، قم بإيداع حبر العظم ، وربط الخلية وحبر العظام المحملة بتركيبات GelMA microgel مع مصباح متقاطع للأشعة فوق البنفسجية عند 405 نانومتر لمدة 90 ثانية. انقل تعليق microgel على الفور إلى لوحة بئر بحجم مناسب تحتوي على DMEM كامل. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.استبدل وسط الاستزراع بعد 24 ساعة ، ثم كل 48 إلى 72 ساعة حسب الحاجة. تم تحليل الحبر العظمي عن طريق المسح المجهري الإلكتروني لتحديد هيكله الدقيق ، والذي أظهر تكوين بلورة هيدروكسيباتيت بعد إعداد الحبر ، خاصة في الظروف الجافة. في هذه الدراسة ، تم خلط الخلايا مع الهلاميات الدقيقة GelMA والاحتفاظ بها في المزرعة لمدة تصل إلى خمسة أيام ، إما في معلق هلام دقيق فقط أو في نظام COBICS.أظهرت الخلايا صلاحية جيدة في وجود حبر العظام ، في اليوم الأول واليوم الخامس ، مما يؤكد أن منتجات ترشيح الحبر لم تكن ضارة بالخلايا. من الضروري التحكم في سرعة التحريك أثناء توليف الميكروجيل لأن التغييرات الطفيفة في التحريك يمكن أن تسبب اختلافات في الحجم. من المهم أيضا ضمان التوزيع المتجانس للخلايا داخل تعليق microgel.يمكن استخدام نفس البروتوكول للطباعة داخل معلقات الجيلاتين الدقيقة ، والتي تعمل كدعامات قربانية ، تاركة وراءها هياكل عظمية قائمة بذاتها. لكن استخدام GelMA يفتح الطريق أمام تركيبات متعددة الأطوار في وعاء واحد ، مثل واجهات العظم الغضروفي أو الأوتار العظمية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized التركيبات باستخدام الأنسجة محددة هيدروجيل Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

رقاقة سلالة التدرج لتحفيز السلوكيات الخلوي في الخلية لادن المائية

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

الآلية الروبوتية الاستغناء عن تقنية لتوجيه السطحية وBioprinting من الخلايا

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

فاسكولاريزيد بيوبرينتينج موائع جزيئية لهندسة الأنسجة وأورجانويدس

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

بيوبرينتينج الغضاريف والجلد الأنسجة النظير استخدام سلبية رواية خلط وحدة تقنية بريسيلولاريزيشن بيوينك

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

نموذج كالفاري لتكبير العظام في الأرنب لتقييم نمو العظام والأوعية الدموية الجديدة في مواد استبدال العظام

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

البنكرياس المشتقة الانسجه المستمدة مصفوفة بيونك للطباعة 3D خلايا البنكرياس لادن الانسجه يبني

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

قياس 3D في الجسم الحي الكتف الحركية باستخدام ثنائية الكواكب فيديو راديوجرافي

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد للخلايا الفلكية القشرية لمورين للأنسجة الهندسية الشبيهة بالعصبية

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...