Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

作者要感谢国家健康和医学研究委员会（批准号GNT1111694和GNT1141602）和澳大利亚研究委员会（批准号FT180100417，FL150100060和CE14100036）。作者要感谢新南威尔士大学的生物医学成像设施。图表是用 Biorender.com、Adobe Photoshop和Adobe Illustrator创建的，并已通过付费订阅导出。

1. 骨墨制作
<ol><li>α-磷酸三钙的合成<ol><li>以 3：2 Ca：P 摩尔比称出磷酸氢钙 （CaHPO4） 和碳酸钙 （CaCO3） 粉末。使用刮刀，彻底均质两种粉末。</li>
		<li>将磷酸氢钙-碳酸钙粉末混合物加入氧化锆坩埚中，使其不超过75%。 注意：为避免污染，请使用新的坩埚或以前用于制造相同材料的坩埚。要清洁，请用 100% 乙醇冲洗并在通风橱中风干直至完全干燥，然后再添加?...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

开发3D打印技术COBIS是为了通过挤出成含有活细胞的可交联微凝胶悬浮液来制造矿化的骨状结构。该技术已应用于可降解微凝胶悬浮液，并且细胞在系统内显示出良好的活力、扩散和成骨分化能力11。使用这种技术创建的构造成功的关键决定因素是基于α-TCP的骨墨水的正确合成。首先，α-TCP的形成在很大程度上取决于适当的温度控制。为了形成正确的磷酸三钙相，在反应越过相界?...

骨骼具有非凡的再生能力，是体内为数不多的可以通过重建其正常的细胞组成、方向和机械强度来愈合的结构之一，直到内源性愈合能力受损时出现严重的缺陷大小1.骨骼与软骨和韧带一起支持和促进身体运动，同时还储存矿物质和脂肪并产生血细胞。骨作为一种坚硬、致密的结缔组织，主要由无机相、水和主要由胶原纤维组成的有机物质组成2。细胞嵌入这种高度矿化的胶原蛋白I纤维和羟基磷灰石（HA）晶体基质中，形成分层结构3。
这种组织的复杂组织使得合成替代品的制造变得异常具有挑战性3.为此，已经提出了各种材料，包括生物陶瓷，富含细胞的水凝胶和合成材料作为创建骨基质的解决方案。在支架制造技术中，基于3D打印的技术最近出现并受到组织工程界的广泛关注，因为它们具有制造高度复杂和精密结构的卓越能力，具有患者特异性治疗的巨大前景4，5，6.水凝胶一直是基质模拟物和生物墨水最受欢迎的选择，因为它们可以与细胞和生物活性分子一起打印，产生功能构建体6。然而，水凝胶缺乏骨骼的功能特性，例如机械强度和含有代谢活性细胞的高度钙化无机相。
3D打印陶瓷支架通常需要后处理步骤，包括烧结，高温处理或使用刺激性化学品，这些化学品必须在体外或体内应用之前彻底清洗5。为了解决这些限制，Lode等人7最近开发了一种由羟基磷灰石形成的α-三钙磷酸盐基糊剂，可以在生理条件下印刷和凝固。然而，这种材料仍然不能与活细胞一起打印，因为它需要在潮湿的环境中进行后处理，然后长时间浸泡水溶液。
或者，已经提出了含有无机颗粒的含有细胞的水凝胶作为3D骨基质8，9的替代品。尽管它们具有很强的支持细胞活力的能力，但它们无法概括密集的矿化骨组织环境。Thrivikarman等人10 采用了仿生方法，其中过饱和钙和磷酸盐培养基与非胶原蛋白类似物一起使用，以更好地模拟纳米级磷灰石沉积。然而，他们的结构仍然无法生成具有类似于骨骼的微观和宏观尺度架构的刚性3D结构。
本研究通过开发打印策略来解决这些缺点，以在无机和有机相中制造能够整合细胞和生长因子的骨骼模拟构建体11。COBICS使用基于微凝胶的生物打印技术独特地概括了骨骼的矿物质和细胞结构。本文中的协议描述了合成陶瓷骨墨水和基于明胶的微凝胶，然后组合实现COBICS的细胞的过程。该过程从骨墨的主要前体材料的合成开始。然后将可交联的水凝胶合成并形成微凝胶。最后，将骨墨水全向沉积在装有细胞的微凝胶的支撑浴中（图1）。
骨墨水可以打印到具有适当屈服应力特性的任何微凝胶悬浮液中，即能够以特定的剪切速率流化并随后支撑沉积结构。已经证明了两种灵活的方法：由明胶微凝胶组成的悬浮液和由甲基丙烯酸明胶（GelMA）微凝胶组成的悬浮液。前者悬浮液在温度升至37°C时溶解，悬浮水凝胶的自由形式可逆包埋（FRESH）技术12，而后者可以在印刷后进行光交联，有效地将微凝胶“缝合”在一起并将印刷的骨墨锁定到位。本研究的重点是使用GelMA作为基质，因为它提供了能够通过原 位 打印复杂骨模拟结构来支持细胞生长的独特优势。最终，这种方法能够生成具有高水平仿生学的复杂组织模型，并对疾病建模、药物发现和再生工程具有广泛的影响。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> 图 1：工作流程示意图 。 （A）骨墨从α-磷酸三钙合成开始，随后与甘油，聚山梨醇酯80和磷酸二铵结合。（B）GelMA微凝胶采用油包水乳液法制备。然后将获得的微凝胶（C）水合和（D）与细胞结合。然后将细胞微凝胶复合材料用作颗粒浴，其中沉积骨墨。（E）然后将整个构建体紫外线交联并转移到培养箱中进行培养。缩写：α-TCP = α-磷酸三钙;GelMA =甲基丙烯酸明胶。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的大图。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

在结构上，骨组织是一种无机有机复合材料，含有嵌入分层、高度矿化基质中的代谢活性细胞。由于骨骼的异质环境，这种组织很难复制。细胞悬浮液中的陶瓷全向生物打印（COBICS）是一种基于微凝胶的生物打印技术，可独特地复制骨骼的矿物质和细胞结构。COBICS打印复杂的生物学相关结构，无需牺牲支撑材料或苛刻的后处理步骤（例如辐射和高温烧结），这是骨模拟结构增材制造中的两个最大挑战。该技术是通过在明胶基微凝胶悬浮液中自由挤出新型磷酸钙基油墨来实现的。悬浮液的屈服应力特性允许沉积并支撑打印的骨结构。然后紫外线交联和纳米沉淀将其“锁定”到位。在充满细胞的生物材料中打印纳米结构的模拟骨陶瓷的能力提供了对宏观和微观结构的时空控制，并促进了临床环境中复杂骨骼结构的实时制造。

COBICS打印复杂的生物学相关结构，无需牺牲支撑材料或苛刻的后处理步骤（例如辐射和高温烧结），这是骨模拟结构增材制造中的两个最大挑战。为了证明COBISS在复杂骨结构的形成和微凝胶悬浮液中细胞的共印，拍摄了由骨墨水制成的骨样复合材料的代表性图像，并对COBISC中的ADSC活力进行了长达7天的半定量分析。 图4 显示了通过在由明胶微凝胶组成的支撑浴中沉积骨墨水?...

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Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

该协议描述了一种3D打印技术，通过将磷酸钙墨水沉积在基于明胶的颗粒载体中来制造骨状结构。印刷的骨类似物以自由形式沉积，具有直接收获印刷品或在活细胞基质内交联以进行多相构建体的灵活性。

用于生成骨类似物的细胞悬浮液中的陶瓷全向生物打印

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

该协议允许制造骨类似物，而无需加热或有毒化学品。通过这种方式，骨结构形成，有可能在临床环境中使用患者自身的细胞修复骨缺损。该技术的主要优点是骨墨水可以用活细胞打印，以形成任何复杂的骨样结构，并直接分化为骨形成谱系。此外，药物可以加载到骨墨水中，以同时增强伤口愈合，骨骼再生以及治疗癌症等疾病。演示该程序的将是我实验室的博士候选人Gagan Jalandhra和Sara Romanazzo博士，他与我和Jalandhra博士合作过各种项目，包括这项技术的开发。首先将磷酸氢钙和碳酸钙粉末混合物添加到氧化锆坩埚中，使其不超过75%。将坩埚转移到炉子中，以每分钟5摄氏度的速度将其加热至1， 400摄氏度，并保持三小时。通过将坩埚从炉中取出并留在耐火块顶部来淬灭反应。在处理之前让它完全冷却。使用研钵和研杵破碎和研磨α-磷酸三钙饼，使所得颗粒的最大尺寸为200微米。在研磨的混合物中加入三毫米氧化钇稳定的氧化锆球，然后加入 100% 乙醇。盖上盖子并以每分钟 180 转的速度研磨两小时。收集悬浮液并分离球，使用100%乙醇进行洗涤。将悬浮液在 120 摄氏度的烤箱中干燥 24 小时。将干粉加入带有一毫米氧化锆球和100%乙醇的研磨罐中，重量比与第一阶段相同。以每分钟 180 转的速度研磨两小时。然后分开并在烤箱中干燥。从烤箱中取出样品。要制作骨墨，将 630 微升甘油和 130 微升聚山梨酯 80 加入球形罐中。然后在溶液中加入100毫克磷酸二铵和2克α-磷酸三钙粉，用刮刀连续搅拌混合。加入一个 25 毫米的氧化锆球，盖上盖子并将其放入行星磨机内以每分钟 180 转的速度放置 60 分钟，中途停顿以使用刮刀用刮刀刮下罐子的侧面。将墨水装入一毫升注射器中。按照文本手稿中的说明，在1X PBS中制备10%的A型明胶溶液。将锥形烧瓶放在搅拌器上。然后加入5.796毫升甲基丙烯酸酐，继续在50摄氏度的黑暗中搅拌90分钟。通过用PBS将锥形烧瓶内容物稀释两倍来淬灭反应。倒入50毫升管中，通过在室温下以3000 RCF离心3分钟并收集上清液来除去未反应的甲基丙烯酸酐。将14千道尔顿截止纤维素透析管内的上清液与40摄氏度的去离子水透析五天，同时轻轻搅拌。每天更换去离子水。通过将倾析到50毫升管中，固定盖子并将其放入冰箱中12小时来准备储存。然后使用液氮冷冻样品，并立即在零下54摄氏度和0.4毫巴下冻干五天。将产生的泡沫储存在零下 20 摄氏度的冰箱中。为了合成GelMA微凝胶，通过称量冻干的GelMA，将其加入带有PBS的管中并在50摄氏度的水浴中加热直至完全水合，在PBS中制备重量为10%重量的GelMA溶液。每一毫升GelMA溶液向烧杯中加入37毫升油，确保其不超过65%。通过将装有油的烧杯放入较大的烧杯中，在带有磁力搅拌的热板上设置双烧杯系统。搅拌时加热至40摄氏度。将GelMA溶液装入注射器中，并通过0.45微米过滤器将其滴加到搅拌油中。让乳液平衡10分钟。将乳液的温度降低到15摄氏度以加热。通过在两个烧杯之间的空间中添加碎冰来稳定球体。将丙酮添加到旋转的GelMA乳液中。将烧杯的内容物倒入 50 毫升管中，确保用丙酮清洗烧杯壁。让它静置 20 分钟，让脱水的微凝胶沉降到底部。弃去上清液并用丙酮洗涤微凝胶两次。合并成一个管，加满丙酮并超声处理 10 秒钟。再次，用丙酮清洗两次。在室温下储存在丙酮中，直到需要打印。为了制备用于印刷的GelMA微凝胶悬浮液，请按照文本手稿中所述在DMEM中配制1%重量重量的GelMA溶液。从脱水的微凝胶中蒸发丙酮，并将所得粉末称量到管中。加入丙酮并转移到无菌环境中。为了形成微凝胶悬浮液，从生物安全柜内的粉末中蒸发丙酮。蒸发后，加入DMEM，DMEM中的1%GelMA溶液和2.5%LAP引发剂溶液，使最终包装分数达到30%，允许在室温下充分水合至少12小时。在补充有10%FBS和1%青霉素链霉素的低葡萄糖DMEM中培养脂肪来源的间充质干细胞，在37摄氏度和5%二氧化碳下直至汇合。通过去除培养基并用无菌PBS洗涤，从组织培养瓶中去除脂肪来源的间充质干细胞。通过在室温下以 150 RCF 离心五分钟来沉淀细胞。计数细胞并计算每毫升GelMA微凝胶的至少5 x 10到五个细胞。如前所述，将所需体积的细胞悬液分配到单独的管和沉淀中。使用移液管小心地去除尽可能多的上清液，只留下细胞沉淀。将所需体积的微凝胶悬浮液添加到沉淀中，轻轻上下移液以确保均匀分布。使用移液管将装有细胞的微凝胶悬浮液装入反应器中。使用装有 23 号针头的一毫升注射器，将骨墨沉积，用 405 纳米的紫外线交联剂灯交联细胞和含有骨墨的 GelMA 微凝胶构建体 90 秒。立即将微凝胶悬浮液转移到含有完整DMEM的适当大小的孔板中。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育。24小时后更换培养基，然后根据需要每48至72小时更换一次。通过扫描电镜分析骨墨以确定其微观结构，结果表明油墨凝固后形成羟基磷灰石晶体，在干燥条件下尤其明显。在这项研究中，将细胞与GelMA微凝胶混合并在培养物中保持长达五天，无论是仅在微凝胶悬浮液中还是在COBISS系统中。细胞在骨墨存在下，在第一天和第五天都显示出良好的活力，证实了墨水的浸出产物对细胞无害。在合成微凝胶时控制搅拌器速度至关重要，因为搅拌的微小变化会导致尺寸差异。确保微凝胶悬浮液内细胞的均匀分布也很重要。相同的方案可用于在明胶微凝胶悬浮液内部打印，其作为牺牲支撑物，留下独立的骨结构。但是使用GelMA为一盆多相结构开辟了途径，例如骨软骨或骨肌腱界面。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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科研

生物工程

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使用双平面影像学测量 3D 体内肩部运动学

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

用于工程神经样组织的小鼠皮质星形胶质细胞的3D生物打印

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...