Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende National Health and Medical Research Council (bevillingsnr. GNT1111694 og GNT1141602) og Australian Research Council (bevillingsnr. FT180100417, FL150100060 og CE14100036). Forfatterne vil gerne anerkende Biomedical Imaging Facility ved University of New South Wales. Figurerne blev oprettet med Biorender.com, Adobe Photoshop og Adobe Illustrator og er blevet eksporteret under et betalt abonnement.

1. Fremstilling af knogleblæk
<ol><li>Syntese af α-tricalciumphosphat<ol><li>Calciumhydrogenphosphat (CaHPO4) og calciumcarbonat (CaCO 3) pulvere afvejes i et molforhold på3: 2 Ca: P. Brug en spatel til at homogenisere de to pulvere grundigt.</li>
		<li>Blandingen af calciumhydrogenphosphat-calciumcarbonatpulver tilsættes til en zirkonia-digel, således at den ikke er mere end 75% fuld. BEMÆRK: For at undgå kontaminering skal du bruge en ny digel eller en digel, der tidli...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

3D-printteknikken COBICS blev udviklet til at muliggøre fremstilling af mineraliserede knoglelignende strukturer via ekstrudering til en tværlænbar mikrogelsuspension indeholdende levende celler. Teknikken er blevet anvendt på en nedbrydelig mikrogelsuspension, og celler viser god levedygtighed, spredning og osteogen differentieringsevne inden for systemet11. En nøgledeterminant for succesen med konstruktioner skabt ved hjælp af denne teknik er den korrekte syntese af det α-TCP-baserede kno...

Knogle har bemærkelsesværdige regenereringsevner som en af de få strukturer i kroppen, der kan helbrede ved at genskabe sin normale cellulære sammensætning, orientering og mekaniske styrke indtil en kritisk defektstørrelse, når endogen helingskapacitet er kompromitteret1. Knogler, sammen med brusk og ledbånd, understøtter og letter kroppens bevægelse, samtidig med at de lagrer mineraler og fedtstoffer og producerer blodlegemer. Som et hårdt, tæt bindevæv består knoglen hovedsageligt af en uorganisk fase, vand og organisk materiale, der primært består af kollagenfibre2. Celler er indlejret i denne stærkt mineraliserede matrix af kollagen I fibre og hydroxyapatit (HA) krystaller, der danner en hierarkisk struktur3.
Den komplekse organisering af dette væv gør fremstillingen af syntetiske alternativer til at replikere de heterogene knoglemikro- og nanomiljøer usædvanligt udfordrende3. Til dette formål er en række forskellige materialer, herunder biokeramik, cellebelastede hydrogeler og syntetiske materialer blevet foreslået som løsninger til at skabe knoglematricer. Blandt stilladsfremstillingsteknikkerne er 3D-printbaserede teknikker for nylig opstået og modtaget meget opmærksomhed fra vævsingeniørsamfundet på grund af deres bemærkelsesværdige evne til at tillade fremstilling af meget sofistikerede og præcise strukturer med stort løfte om patientspecifik behandling 4,5,6 . Hydrogeler har været det mest populære valg af matrixefterligninger og bioblæk, da de kan udskrives sammen med celler og bioaktive molekyler, hvilket genererer funktionelle konstruktioner6. Imidlertid mangler hydrogeler de funktionelle egenskaber af knogler, såsom mekanisk styrke og en stærkt forkalket, uorganisk fase indeholdende metabolisk aktive celler.
3D-printede keramiske stilladser kræver typisk efterbehandlingstrin, herunder sintring, højtemperaturbehandlinger eller brug af skrappe kemikalier, der skal vaskes grundigt inden in vitro - eller in vivo-applikationer 5. For at løse disse begrænsninger udviklede Lode et al.7 for nylig en α-tricalciumphosphatbaseret pasta dannet af hydroxyapatit, som kan udskrives og indstilles under fysiologiske forhold. Dette materiale kan dog stadig ikke udskrives sammen med levende celler, da det kræver efterbehandling i et fugtigt miljø og efterfølgende nedsænkning i vandig opløsning i lang tid.
Alternativt er cellebelastede hydrogeler med inkorporerede uorganiske partikler blevet foreslået som erstatning for 3D-knoglematrix 8,9. På trods af deres store evne til at understøtte cellelevedygtighed er de ikke i stand til at rekapitulere det tæt mineraliserede knoglevævsmiljø. Thrivikarman et al.10 vedtog en biomimetisk tilgang, hvor et overmættet calcium- og fosfatmedium blev anvendt med en ikke-kollagen proteinanalog for bedre at efterligne nanoskala apatitaflejring. Imidlertid kan deres konstruktioner stadig ikke generere stive 3D-konstruktioner med mikro- og makroskalaarkitektur, der ligner knogle.
Denne undersøgelse adresserer disse mangler gennem udvikling af en trykstrategi til fremstilling af knoglelignende konstruktioner i uorganiske og organiske faser, der er i stand til at integrere både celler og vækstfaktorer11. COBICS rekapitulerer entydigt knoglens mineralske og cellulære struktur ved hjælp af en mikrogelbaseret bioprintteknik. Protokollen heri beskriver processen med at syntetisere de keramiske knogleblæk og gelatinebaserede mikrogeler og derefter kombinere celler, der muliggør COBICS. Processen begynder med syntesen af knogleblækkets vigtigste forløbermateriale. Den tværbundne hydrogel syntetiseres derefter og formes til mikrogeler. Endelig deponeres knogleblækket omnidirektionelt i et støttebad af mikrogelerne belæsset med celler (figur 1).
Knogleblækket kan trykkes i enhver suspension af mikrogeler, der har de passende udbytte-stressegenskaber, det vil sige evnen til at fluidisere ved en bestemt forskydningshastighed og efterfølgende understøtte den deponerede struktur. Der er påvist to fleksible tilgange: en suspension bestående af gelatinemikrogeler og en suspension bestående af gelatinemethacrylatmikrogeler. Den førstnævnte suspension opløses, når temperaturen hæves til 37 °C, den frie form reversible indlejring af suspenderede hydrogeler (FRESH) teknik12, mens sidstnævnte kan fototværbindes efter udskrivning, hvilket effektivt "syr" mikrogelerne sammen og låser den trykte knogleblæk på plads. Dette studie fokuserer på at bruge GelMA som matrix, da det giver den unikke fordel at kunne understøtte cellevækst med in situ-print af komplekse knoglemimetiske strukturer. I sidste ende muliggør denne tilgang generering af komplekse vævsmodeller med høje niveauer af biomimetik og brede konsekvenser for sygdomsmodellering, lægemiddelopdagelse og regenerativ teknik.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk over arbejdsgangen . (A) Knogleblækket syntetiseres fra α-tricalciumphosphatsyntese og dets efterfølgende kombination med glycerol, polysorbat 80 og ammoniumphosphatdibasisk. (B) GelMA-mikrogeler fremstilles ved vand-i-olie-emulsionsmetoden. De opnåede mikrogeler hydreres derefter (C) og (D) kombineres med celler. Celle-mikrogelkompositter anvendes derefter som et granulært bad, hvor knogleblækket deponeres. (E) Hele konstruktionen UV-tværbindes derefter og overføres til inkubatoren til kultur. Forkortelser: α-TCP = α-tricalciumphosphat; GelMA = gelatine methacrylat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

Strukturelt er knoglevæv en uorganisk-organisk sammensætning indeholdende metabolisk aktive celler indlejret i en hierarkisk, stærkt mineraliseret matrix. Denne organisation er udfordrende at replikere på grund af det heterogene miljø af knogler. Keramisk omnidirektionel bioprint i cellesuspensioner (COBICS) er en mikrogelbaseret bioprintteknik, der unikt replikerer knoglens mineralske og cellulære struktur. COBICS printer komplekse, biologisk relevante konstruktioner uden behov for offerstøttematerialer eller barske efterbehandlingstrin (f.eks. stråling og sintring ved høj temperatur), som er to af de største udfordringer i additiv fremstilling af knoglemimetiske konstruktioner. Denne teknik muliggøres via fri ekstrudering af en ny calciumphosphatbaseret blæk i en gelatinebaseret mikrogelsuspension. Suspensionens udbytte-stressegenskaber tillader aflejring og understøtter den trykte knoglestruktur. UV-tværbinding og nanonedbør "låser" den derefter på plads. Evnen til at udskrive nanostruktureret knoglemimetisk keramik inden for cellebelastede biomaterialer giver rumlig tidsmæssig kontrol over makro- og mikroarkitektur og letter realtidsfremstilling af komplekse knoglekonstruktioner i kliniske omgivelser.

COBICS printer komplekse, biologisk relevante konstruktioner uden behov for offerstøttematerialer eller barske efterbehandlingstrin (f.eks. stråling og sintring ved høj temperatur), som er to af de største udfordringer i additiv fremstilling af knoglemimetiske konstruktioner. For at demonstrere COBIC-dannelse af komplekse knoglestrukturer og co-print af celler i mikrogelsuspensioner blev der taget repræsentative billeder af knoglelignende kompositter fremstillet af knogleblækket, og en semikvantitativ analyse af AD...

Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Denne protokol beskriver en 3D-printteknik til fremstilling af knoglelignende strukturer ved at deponere et calciumphosphatblæk i en gelatinebaseret granulær støtte. Trykte knogleanaloger deponeres i fri form med fleksibilitet til direkte høst af udskriften eller tværbinding i en levende cellematrix til multifasiske konstruktioner.

Keramisk omnidirektionel bioprint i cellebelastede suspensioner til generering af knogleanaloger

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Denne protokol tillader fremstilling af knogleanaloger uden at kræve opvarmning eller giftige kemikalier. På denne måde dannes knoglestrukturer med potentiale til at reparere en knogledefekt i kliniske indstillinger ved hjælp af patientens egne celler. Den største fordel ved teknikken er, at knogleblækket kan udskrives med levende celler for at danne enhver kompleks knoglelignende struktur og for at rette differentiering mod knogledannende afstamning.Endvidere kan lægemidler lægges i knogleblækket for samtidig at forbedre sårheling, knogleregenerering og til behandling af patologier som kræft. Demonstration af proceduren vil være Gagan Jalandhra, en ph.d.-kandidat i mit laboratorium, og Dr.Sara Romanazzo, der har arbejdet sammen med mig og Dr.Jalandhra på forskellige projekter, herunder udvikling af denne teknologi. Begynd med at tilsætte calciumhydrogenphosphat og calciumcarbonatpulverblandingen til en zirkonia-digel, så den ikke er mere end 75% fuld.Overfør diglen til en ovn, opvarm den til 1.400 grader Celsius med en hastighed på fem grader Celsius pr. Minut og hold i tre timer. Sluk reaktionen ved at fjerne digelen fra ovnen og efterlade den i toppen af ildfast blok. Lad det køle helt af inden håndtering.Brug en mørtel og støderen til at bryde og male alfa-tricalciumphosphatkagen, således at de resulterende granulater har en maksimal størrelse på 200 mikrometer. Tilsæt tre millimeter yttriumstabiliserede zirconiakugler til den slibede blanding efterfulgt af 100% ethanol. Fastgør låget og slib i to timer ved 180 rotationer pr. Minut.Opsaml suspensionen og adskil kuglerne ved hjælp af 100% ethanol til vask. Tør suspensionen i en ovn ved 120 grader Celsius i 24 timer. Tilsæt det tørrede pulver til fræseglassene med en millimeter zirkoniakugler og 100% ethanol i samme vægtforhold som i første trin.Slib i to timer ved 180 rotationer pr. Minut. Derefter adskilles og tørres i ovnen. Fjern prøven fra ovnen.For at fremstille knogleblækket tilsættes 630 mikroliter glycerol og 130 mikroliter polysorbat 80 til en kuglemilkrukke. Derefter tilsættes 100 mg ammoniumphosphatdibasisk og to gram alfa-tricalciumphosphatpulver til opløsningen og omrøres kontinuerligt med en spatel for at kombinere. Tilsæt en 25 millimeter zirconia kugle, fastgør låget og læg det inde i en planetmølle i 60 minutter ved 180 rotationer i minuttet, og hold pause halvvejs for at skrabe ned siderne af krukken med en spatel ved hjælp af en spatel.Læg blækket i en milliliter sprøjte. Lav en 10% opløsning af gelatine type A i 1X PBS som beskrevet i tekstmanuskriptet. Den koniske kolbe anbringes på omrøreren.Derefter tilsættes 5.796 ml methacrylsyreanhydrid og omrøres under omrøring i mørke ved 50 grader Celsius i 90 minutter. Reaktionen slukkes ved at fortynde indholdet af koniske kolber to gange med PBS. Der dekanteres i 50 ml reagensglas, og det ureagerede methacrylsyreanhydrid fjernes ved centrifugering ved 3000 RCF ved stuetemperatur i tre minutter og opsamling af supernatanten.Dialysere supernatanten inde i 14 kilodalton afskårne cellulosedialyserør mod deioniseret vand ved 40 grader Celsius i fem dage under forsigtig omrøring. Udskift det deioniserede vand hver dag. Forbered opbevaring ved at dekantere i 50 ml rør, fastgør hætten og læg den i køleskabet i 12 timer.Derefter fryses prøverne ved hjælp af flydende nitrogen og straks frysefryse i fem dage ved minus 54 grader Celsius og 0,4 millibar. Opbevar det resulterende skum i en fryser ved minus 20 grader Celsius. For at syntetisere GelMA-mikrogeler fremstilles en GelMA-opløsning på 10 vægtprocent i PBS ved at veje den frysetørrede GelMA, tilsætte den til et rør med PBS og opvarme i et vandbad ved 50 grader Celsius, indtil den er fuldt hydreret.Tilsæt 37 ml olie pr. milliliter GelMA-opløsning til et bægerglas, og sørg for, at det ikke er mere end 65% fyldt. Et dobbelt bægersystem anbringes på en kogeplade med magnetisk omrøring ved at placere det olieholdige bægerglas i et større bægerglas. Opvarm til 40 grader Celsius under omrøring.Kom GelMA-opløsningen i en sprøjte og tilsæt den dråbevis i omrøringsolien gennem et 0,45 mikrometer filter. Lad emulsionen ekvilibrere i 10 minutter. Reducer emulsionens temperatur til 15 grader Celsius til termisk.Stabiliser kuglerne ved at tilføje knust is i mellemrummet mellem de to bægerglas. Tilsæt acetone til den roterende GelMA-emulsion. Bægerglassets indhold dekanteres i 50 ml rør, og sørg for at vaske bægerglassets vægge med acetone.Lad det hvile i 20 minutter for at lade de dehydrerede mikrogeler slå sig ned til bunden. Supernatanten kasseres, og mikrogelerne vaskes to gange med acetone. Konsolider i et rør, fyld op med acetone og sonikere i 10 sekunder.Vask det igen med acetone to gange. Opbevares i acetone ved stuetemperatur, indtil det kræves til udskrivning. For at forberede GelMA mikrogelsuspension til udskrivning formuleres en 1 vægtprocent opløsning af GelMA i DMEM som beskrevet i tekstmanuskriptet.Acetonen inddampes fra de dehydrerede mikrogeler og vejer det resulterende pulver i et rør. Tilsæt acetone og overfør til et sterilt miljø. For at danne mikrogelsuspensionen inddampes acetonen fra pulveret inde i biosikkerhedsskabet.Efter fordampning tilsættes DMEM, 1% GelMA-opløsning i DMEM og 2,5% LAP-initiatoropløsning for at opnå en endelig pakningsfraktion på 30%Lad det hydrere fuldt ud i mindst 12 timer ved stuetemperatur. Dyrk de fedtafledte mesenkymale stamceller i DMEM med lavt glukoseindhold suppleret med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid indtil sammenflydende. De fedtafledte mesenkymale stamceller fjernes fra vævskulturkolben ved at fjerne mediet og vaske med sterilt PBS.Pellet cellerne ved centrifugering ved 150 RCF ved stuetemperatur i fem minutter. Tæl cellerne og beregn mindst 5 x 10 til de fem celler for hver milliliter GelMA mikrogeler. Det krævede volumen af cellesuspensionen allokeres til et separat rør og pellet som vist tidligere.Så meget supernatant som muligt fjernes forsigtigt med en pipette, idet der kun er cellepillen tilbage. Tilsæt den nødvendige mængde mikrogelsuspension til pelleten og pipette forsigtigt op og ned for at sikre jævn fordeling. Den cellebelastede celle i mikrogelsuspension hældes i en reaktor ved hjælp af en pipette.Brug en milliliter sprøjte udstyret med en 23 gauge nål, deponer knogleblækket, krydsbinder cellen og knogleblækbelastet GelMA mikrogel konstruerer med en UV-tværbindingslampe ved 405 nanometer i 90 sekunder. Overfør straks mikrogelsuspensionen til en brøndplade af passende størrelse, der indeholder komplet DMEM. Inkuber ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Udskift dyrkningsmediet efter 24 timer, derefter hver 48. til 72. time efter behov. Knogleblækket blev analyseret ved scanning elektronmikroskopi for at bestemme dets mikrostruktur, som viste dannelsen af hydroxyapatitkrystal efter blækindstilling, især synlig under tørre forhold. I denne undersøgelse blev celler blandet med GelMA-mikrogeler og opbevaret i kultur i op til fem dage, enten kun i mikrogelsuspension eller i COBIC-systemet.Cellerne viste god levedygtighed i nærvær af knogleblækket, både på dag et og dag fem, hvilket bekræfter, at blækkets udvaskningsprodukter ikke var skadelige for cellerne. Det er afgørende at kontrollere omrøringshastigheden, mens syntetisering af mikrogel som en lille ændring omrøring kan forårsage størrelsesforskelle. Det er også vigtigt at sikre en homogen fordeling af cellerne i mikrogelsuspension.Den samme protokol kan bruges til at udskrive inde i gelatinemikrogelsuspensioner, der fungerer som offerstøtter, hvilket efterlader selvstændige knoglekonstruktioner. Men ved hjælp af GelMA åbner vejen for en pot multifasiske konstruktioner, såsom osteochondral eller knogle sene grænseflader.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generation af en tre-dimensionel fuld tykkelse Skin Equivalent og Automated Anskydning

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstruerer Ved hjælp af en Tissue-specifik Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradient stamme Chip nemlig stimulere cellulære opførsel i celle-belæsset Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Automatiseret Robotic Udlevering Teknik for Surface Udviklings- og Bioprinting Celler

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrofluid Bioprinting for Engineering vaskulariserede væv og Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting af brusk og huden væv analoger udnytter en roman passiv blanding enhed teknik for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Calvarial model af knogle augmentation i kanin til vurdering af knoglevækst og Neovaskularisering i knogle substitutions materialer

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pancreasvæv-afledte ekstracellulære matrix Bioink til udskrivning 3D celle-lastet pancreas væv konstruktioner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Måling af 3D In-vivo Skulder kinematics ved hjælp af Biplanar Videoradiography

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting af Murine Kortikale Astrocytter til Engineering Neural-lignende Væv

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...