Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

De auteurs willen graag de National Health and Medical Research Council (Grant no. GNT1111694 en GNT1141602) en de Australian Research Council (Grant no. FT180100417, FL150100060 en CE14100036) erkennen. De auteurs willen graag de Biomedical Imaging Facility aan de Universiteit van New South Wales erkennen. Figuren zijn gemaakt met Biorender.com, Adobe Photoshop en Adobe Illustrator en zijn geëxporteerd onder een betaald abonnement.

1. Fabricage van beeninkt
<ol><li>Synthese van α-tricalciumfosfaat<ol><li>Weeg calciumwaterstoffosfaat (CaHPO4) en calciumcarbonaat (CaCO3) poeders af in een 3:2 Ca:P molaire verhouding. Gebruik een spatel om de twee poeders grondig te homogeniseren.</li>
		<li>Voeg het mengsel van calciumwaterstoffosfaat-calciumcarbonaatpoeder toe aan een zirkoniakroes, zodat deze niet meer dan 75% vol is. OPMERKING: Om besmetting te voorkomen, gebruikt u een nieuwe smeltkroes of een smeltkro...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

De 3D-printtechniek COBICS is ontwikkeld om de fabricage van gemineraliseerde botachtige structuren via extrusie in een crosslinkable microgel-suspensie met levende cellen mogelijk te maken. De techniek is toegepast op een afbreekbare microgelsuspensie en cellen vertonen een goede levensvatbaarheid, verspreiding en osteogene differentiatiecapaciteit binnen het systeem11. Een belangrijke determinant van het succes van constructen die met deze techniek zijn gemaakt, is de juiste synthese van de α-T...

Bot heeft opmerkelijke regeneratiecapaciteiten als een van de weinige structuren in het lichaam die kunnen genezen door de normale cellulaire samenstelling, oriëntatie en mechanische sterkte te recreëren tot een kritieke defectgrootte, wanneer de endogene genezingscapaciteit wordt aangetast1. Bot, samen met kraakbeen en ligament, ondersteunt en vergemakkelijkt de lichaamsbeweging, terwijl het ook mineralen en vetten opslaat en bloedcellen produceert. Als hard, dicht bindweefsel bestaat bot voornamelijk uit een anorganische fase, water en organisch materiaal dat voornamelijk bestaat uit collageenvezels2. Cellen zijn ingebed in deze sterk gemineraliseerde matrix van collageen I-vezels en hydroxyapatiet (HA) kristallen, die een hiërarchische structuur vormen3.
De complexe organisatie van dit weefsel maakt de fabricage van synthetische alternatieven om de heterogene botmicro- en nano-omgevingen te repliceren uitzonderlijk uitdagend3. Voor dit doel zijn verschillende materialen, waaronder biokeramiek, met cellen beladen hydrogels en synthetische materialen voorgesteld als oplossingen om botmatrices te maken. Onder de steigerfabricagetechnieken zijn onlangs op 3D-printen gebaseerde technieken naar voren gekomen en hebben ze veel aandacht gekregen van de tissue engineering-gemeenschap vanwege hun opmerkelijke vermogen om de fabricage van zeer geavanceerde en nauwkeurige structuren mogelijk te maken met een grote belofte van patiëntspecifieke behandeling 4,5,6 . Hydrogels zijn de meest populaire keuze van matrix-mimics en bio-inkten, omdat ze samen met cellen en bioactieve moleculen kunnen worden afgedrukt en functionele constructen genereren6. Hydrogels missen echter de functionele eigenschappen van bot, zoals mechanische sterkte en een sterk verkalkte, anorganische fase die metabolisch actieve cellen bevat.
3D-geprinte keramische steigers vereisen meestal nabewerkingsstappen, waaronder sinteren, behandelingen op hoge temperatuur of het gebruik van agressieve chemicaliën die grondig moeten worden gewassen voordat ze in vitro of in vivo worden toegepast5. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben Lode et al.7 onlangs een pasta op basis van α tricalciumfosfaat ontwikkeld, gevormd door hydroxyapatiet, die onder fysiologische omstandigheden kan worden afgedrukt en ingesteld. Dit materiaal kan echter nog steeds niet samen met levende cellen worden afgedrukt, omdat het nabehandeling in een vochtige omgeving en daaropvolgende onderdompeling in waterige oplossingen gedurende een lange periode vereist.
Als alternatief zijn celbeladen hydrogels met anorganische deeltjes erin opgenomen voorgesteld als vervanging voor 3D-botmatrix 8,9. Ondanks hun grote vermogen om de levensvatbaarheid van cellen te ondersteunen, zijn ze niet in staat om de dicht gemineraliseerde botweefselomgeving samen te vatten. Thrivikarman et al.10 hanteerden een biomimetische benadering waarbij een oververzadigd calcium- en fosfaatmedium werd gebruikt met een niet-collageenachtig eiwitanaloog om de apatietafzetting op nanoschaal beter na te bootsen. Hun constructies kunnen echter nog steeds geen rigide 3D-constructies genereren met micro- en macroschaalarchitectuur die op bot lijkt.
De huidige studie pakt deze tekortkomingen aan door de ontwikkeling van een printstrategie om bot-nabootsende constructies te fabriceren, in anorganische en organische fasen, die in staat zijn om zowel cellen als groeifactoren te integreren11. COBICS recapituuleert op unieke wijze de minerale en cellulaire structuur van bot met behulp van een op microgel gebaseerde bioprinttechniek. Het protocol hierin beschrijft het proces van het synthetiseren van de keramische botinkt en op gelatine gebaseerde microgels en vervolgens het combineren van cellen die COBICS mogelijk maken. Het proces begint met de synthese van het belangrijkste precursormateriaal van de botinkt. De cross-linkable hydrogel wordt vervolgens gesynthetiseerd en gevormd tot microgels. Ten slotte wordt de botinkt omnidirectioneel afgezet in een steunbad van de microgels beladen met cellen (figuur 1).
De botinkt kan worden afgedrukt in elke suspensie van microgels die de juiste vloeigrenskenmerken hebben, dat wil zeggen het vermogen om te fluïdiseren met een specifieke afschuifsnelheid en vervolgens de gedeponeerde structuur te ondersteunen. Er zijn twee flexibele benaderingen gedemonstreerd: een suspensie bestaande uit gelatinemicrogels en een suspensie bestaande uit gelatinemethacrylaat (GelMA) microgels. De eerste suspensie lost op wanneer de temperatuur wordt verhoogd tot 37 °C, de vrije vorm omkeerbare inbedding van gesuspendeerde hydrogels (FRESH) techniek12, terwijl de laatste na het afdrukken kan worden gefotocrosslinkt, waardoor de microgels effectief aan elkaar worden "gestikt" en de bedrukte botinkt op zijn plaats wordt vergrendeld. De huidige studie richt zich op het gebruik van GelMA als de matrix, omdat het het unieke voordeel biedt dat het de celgroei kan ondersteunen met in situ printen van complexe bot mimetische structuren. Uiteindelijk maakt deze aanpak het mogelijk om complexe weefselmodellen te genereren met hoge niveaus van biomimicry en brede implicaties voor ziektemodellering, medicijnontdekking en regeneratieve engineering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van de workflow. (A) De botinkt wordt gesynthetiseerd op basis van α-tricalciumfosfaatsynthese en de daaropvolgende combinatie met glycerol, polysorbaat 80 en ammoniumfosfaatdibasisch. (B) GelMA-microgels worden vervaardigd door de water-in-olie-emulsiemethode. De verkregen microgels worden vervolgens (C) gehydrateerd en (D) gecombineerd met cellen. Cel-microgel composieten worden vervolgens gebruikt als een korrelig bad waarin de botinkt wordt afgezet. (E) Het hele construct wordt vervolgens UV-crosslinked en overgebracht naar de incubator voor kweek. Afkortingen: α-TCP = α-tricalciumfosfaat; GelMA =gelatinemethacrylaat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

Structureel gezien is botweefsel een anorganisch-organische samenstelling die metabolisch actieve cellen bevat die zijn ingebed in een hiërarchische, sterk gemineraliseerde matrix. Deze organisatie is een uitdaging om te repliceren vanwege de heterogene omgeving van bot. Keramische omnidirectionele bioprinting in celsuspensies (COBICS) is een op microgel gebaseerde bioprinttechniek die op unieke wijze de minerale en cellulaire structuur van bot repliceert. COBICS print complexe, biologisch relevante constructies zonder de noodzaak van opofferingsmaterialen of harde nabewerkingsstappen (bijv. Straling en hoge temperatuur sinteren), twee van de grootste uitdagingen in de additieve productie van bot mimetische constructies. Deze techniek wordt mogelijk gemaakt via de vrije extrusie van een nieuwe inkt op basis van calciumfosfaat in een op gelatine gebaseerde microgelsuspensie. De vloeigrenseigenschappen van de suspensie maken afzetting mogelijk en ondersteunen de geprinte botstructuur. UV-crosslinking en nanoprecipitatie "vergrendelen" het vervolgens op zijn plaats. De mogelijkheid om nanogestructureerde bot-mimetische keramiek te printen in celbeladen biomaterialen biedt spatiotemporale controle over macro- en micro-architectuur en vergemakkelijkt de real-time fabricage van complexe botconstructies in klinische omgevingen.

COBICS print complexe, biologisch relevante constructies zonder de noodzaak van opofferingsmaterialen of harde nabewerkingsstappen (bijv. Straling en hoge temperatuur sinteren), twee van de grootste uitdagingen bij de additieve productie van bot mimetische constructies. Om cobics-vorming van complexe botstructuren en het co-printen van cellen in microgel-suspensies aan te tonen, werden representatieve beelden van botachtige composieten gemaakt van de botinkt genomen en werd een semikwantitatieve analyse van de levensvatb...

Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Dit protocol beschrijft een 3D-printtechniek om botachtige structuren te fabriceren door een calciumfosfaatinkt af te zetten in een op gelatine gebaseerde korrelige ondersteuning. Geprinte botanalogen worden in vrije vorm afgezet, met flexibiliteit voor het direct oogsten van de afdruk of crosslinking binnen een levende celmatrix voor multifasische constructies.

Keramische omnidirectionele bioprinting in celbeladen suspensies voor het genereren van botanalogen

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Dit protocol maakt de fabricage van botanalogen mogelijk zonder dat verwarming of giftige chemicaliën nodig zijn. Op deze manier worden botstructuren gevormd met het potentieel voor het repareren van een botdefect in klinische omgevingen met behulp van de eigen cellen van een patiënt. Het belangrijkste voordeel van de techniek is dat de botinkt kan worden afgedrukt met levende cellen om een complexe botachtige structuur te vormen en om differentiatie te richten op botvormende afstamming.Verder kunnen medicijnen in de botinkt worden geladen om tegelijkertijd wondgenezing, botregeneratie en pathologieën zoals kanker te verbeteren. Gagan Jalandhra, een promovendus in mijn lab, en Dr. Sara Romanazzo, die met mij en Dr.Jalandhra aan verschillende projecten heeft gewerkt, waaronder de ontwikkeling van deze technologie, demonstreren de procedure. Begin met het toevoegen van het calciumwaterstoffosfaat en calciumcarbonaat poedermengsel aan een zirkonia-kroes, zodat deze niet meer dan 75% vol is.Breng de kroes over in een oven, verwarm deze tot 1.400 graden Celsius met een snelheid van vijf graden Celsius per minuut en houd deze drie uur vast. Doof de reactie door de kroes uit de oven te verwijderen en op een top van een vuurvast blok te laten staan. Laat het volledig afkoelen voordat u het hanteert.Gebruik een vijzel en stamper om de alfa-tricalciumfosfaatkoek te breken en te malen, zodat de resulterende korrels een maximale grootte van 200 micrometer hebben. Voeg drie millimeter yttria-gestabiliseerde zirkoniaballen toe aan het gemalen mengsel, gevolgd door 100% ethanol. Zet het deksel vast en maal gedurende twee uur met 180 omwentelingen per minuut.Verzamel de suspensie en scheid de ballen, met behulp van 100% ethanol voor het wassen. Droog de suspensie 24 uur in een oven op 120 graden Celsius. Voeg het gedroogde poeder toe aan de maalpotten met één millimeter zirkoniaballen en 100% ethanol in dezelfde gewichtsverhoudingen als in de eerste fase.Maal gedurende twee uur met 180 rotaties per minuut. Daarna scheiden en drogen in de oven. Haal het monster uit de oven.Om de bone-ink te maken, voeg 630 microliter glycerol en 130 microliter polysorbaat 80 toe aan een potje ball mil. Voeg vervolgens 100 milligram ammoniumfosfaat dibasiszuur en twee gram alfa-tricalciumfosfaatpoeder toe aan de oplossing en roer continu met een spatel om te combineren. Voeg een zirkoniabal van 25 millimeter toe, bevestig het deksel en plaats het gedurende 60 minuten in een planetaire molen met 180 rotaties per minuut, pauzeer halverwege om de zijkanten van de pot met een spatel met een spatel naar beneden te schrapen.Plaats de inkt in een spuit van één milliliter. Maak een 10%-oplossing van gelatine type A in 1X PBS zoals beschreven in het tekstmanuscript. Plaats de erlenmeyer op de roerder.Voeg vervolgens 5,796 milliliter methacrylzuuranhydride toe en blijf 90 minuten roeren in het donker bij 50 graden Celsius. Doof de reactie door de inhoud van de erlenmeyers tweevoudig te verdunnen met PBS. Decanteer in buizen van 50 milliliter en verwijder het niet-gereageerde methacrylzuuranhydride door centrifugatie bij 3000 RCF bij kamertemperatuur gedurende drie minuten en verzamel het supernatant.Dialyseer het supernatant in 14 kilodalton afgesneden cellulosedialysebuizen tegen gedeïoniseerd water bij 40 graden Celsius gedurende vijf dagen terwijl je voorzichtig roert. Vervang het gedeïoniseerde water elke dag. Bereid je voor op opslag door in buizen van 50 milliliter te decanteren, de dop vast te zetten en 12 uur in de koelkast te plaatsen.Vries vervolgens de monsters in met vloeibare stikstof en lyofiel onmiddellijk gedurende vijf dagen bij min 54 graden Celsius en 0,4 millibar. Bewaar het resulterende schuim in een vriezer bij min 20 graden Celsius. Om GelMA-microgels te synthetiseren, maakt u een GelMA-oplossing van 10% gewicht in PBS door de gelofiliseerde GelMA te wegen, toe te voegen aan een buis met PBS en te verwarmen in een waterbad op 50 graden Celsius totdat deze volledig gehydrateerd is.Voeg 37 milliliter olie per milliliter GelMA-oplossing toe aan een bekerglas en zorg ervoor dat het niet meer dan 65% vol is. Zet een dubbel bekersysteem op een hete plaat met magnetisch roeren door het bekerglas met olie in een groter bekerglas te plaatsen. Verwarm al roerend tot 40 graden Celsius.Laad de GelMA-oplossing in een spuit en voeg deze druppelsgewijs toe aan de roerolie door een filter van 0,45 micrometer. Laat de emulsie gedurende 10 minuten in evenwicht zijn. Verlaag de temperatuur van de emulsie tot 15 graden Celsius tot thermisch.Stabiliseer de bollen door gemalen ijs toe te voegen aan de ruimte tussen de twee bekers. Voeg aceton toe aan de draaiende GelMA-emulsie. Decanteer de inhoud van het bekerglas in buizen van 50 milliliter en zorg ervoor dat u de wanden van het bekerglas met aceton wast.Laat het 20 minuten rusten om de uitgedroogde microgels naar de bodem te laten zakken. Gooi het supernatant weg en was de microgels twee keer met aceton. Consolideer in één buis, vul aan met aceton en soniceer gedurende 10 seconden.Nogmaals, was het twee keer met aceton. Bewaren in aceton bij kamertemperatuur totdat dit nodig is voor het afdrukken. Om de GelMA microgel suspensie voor te bereiden voor afdrukken, formuleert u een 1% gewichtsgewicht oplossing van GelMA in DMEM zoals beschreven in het tekstmanuscript.Verdamp de aceton uit de gedehydrateerde microgels en weeg het resulterende poeder in een buis. Voeg aceton toe en breng over naar een steriele omgeving. Om de microgel suspensie te vormen, verdampt u de aceton uit het poeder in de bioveiligheidskast.Voeg na verdamping DMEM, 1% GelMA-oplossing in DMEM en 2,5% LAP-initiatoroplossing toe om een uiteindelijke verpakkingsfractie van 30% te bereiken Laat toe om ten minste 12 uur bij kamertemperatuur volledig te hydrateren. Kweek de van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen in dmem met een laag glucosegehalte aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide tot confluent. Verwijder de van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen uit de weefselkweekkolf door het medium te verwijderen en te wassen met steriel PBS.Pelleteer de cellen door gedurende vijf minuten te centrifugeren bij 150 RCF bij kamertemperatuur. Tel de cellen en bereken minstens 5 x 10 tot de vijf cellen voor elke milliliter GelMA-microgels. Wijs het vereiste volume van de celsuspensie toe aan een afzonderlijke buis en pellet zoals eerder gedemonstreerd.Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk supernatant met behulp van een pipet, waarbij alleen de celkorrel overblijft. Voeg het vereiste volume microgelsuspensie toe aan de pellet en pipetteer voorzichtig op en neer om een gelijkmatige verdeling te garanderen. Laad de celbeladen in microgelsuspensie in een reactor met behulp van een pipet.Met behulp van een spuit van één milliliter uitgerust met een naald van 23 gauge, deponeren de botinkt, crosslinken van de cel en met botinkt beladen GelMA-microgelconstructies met een UV-crosslinkerlamp op 405 nanometer gedurende 90 seconden. Breng de microgelsuspensie onmiddellijk over op een putplaat van de juiste grootte met volledige DMEM. Incubeer bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide.Vervang het kweekmedium na 24 uur en vervolgens elke 48 tot 72 uur indien nodig. De botinkt werd geanalyseerd door scanning elektronenmicroscopie om de microstructuur te bepalen, die de vorming van hydroxyapatietkristal na inktinstelling liet zien, vooral zichtbaar in droge omstandigheden. In deze studie werden cellen gemengd met GelMA-microgels en tot vijf dagen in cultuur gehouden, hetzij alleen in micro-gelsuspensie of in het COBICS-systeem.De cellen vertoonden een goede levensvatbaarheid in de aanwezigheid van de botinkt, zowel op dag één als op dag vijf, wat bevestigde dat de uitlogingsproducten van de inkt niet schadelijk waren voor de cellen. Het is cruciaal om de roersnelheid te regelen terwijl het synthetiseren van microgel, omdat een kleine verandering in het roeren grootteverschillen kan veroorzaken. Het is ook belangrijk om te zorgen voor een homogene verdeling van de cellen binnen de suspensie van microgel.Hetzelfde protocol kan worden gebruikt om in gelatine microgel suspensies te printen, die fungeren als opofferingssteunen, waardoor op zichzelf staande botconstructies achterblijven. Maar het gebruik van GelMA opent de weg voor één pot multifasische constructies, zoals osteochondrale of botpeesinterfaces.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Genereren van een drie-dimensionale volledige dikte huidequivalent en Automated Verwonden

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Construeert met een tissue-specifieke Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Kleurovergang stam Chip voor de stimulerende cellulaire gedrag in cel-beladen Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Geautomatiseerde Robotic Dispensing Techniek voor Surface Oriëntatie- en Bioprinting van Cellen

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Bioprinting voor Engineering gevacuoliseerd weefsels en Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting van kraakbeen en huid weefsel analogen met behulp van een roman passief mengen eenheid techniek voor Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Calvariaal model van bot augmentatie in konijn voor beoordeling van botgroei en neovascularisatie in Botsubstitutie materialen

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pancreatic weefsel-afgeleide extracellulaire matrix Bioink voor het afdrukken van 3D Cell-beladen alvleesklier weefsel constructies

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Meten van 3D in-vivo schouderkinematica met behulp van biplanaire videoradiografie

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting van Murine Cortiical Astrocytes voor Engineering Neural-Like Tissue

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...