Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier le National Health and Medical Research Council (subventions no. GNT1111694 et GNT1141602) et l’Australian Research Council (subvention no. FT180100417, FL150100060 et CE14100036). Les auteurs aimeraient remercier le Biomedical Imaging Facility de l’Université de Nouvelle-Galles du Sud. Les figurines ont été créées avec Biorender.com, Adobe Photoshop et Adobe Illustrator et ont été exportées dans le cadre d’un abonnement payant.

1. Fabrication à l’encre d’os
<ol><li>Synthèse du phosphate α-tricalcique<ol><li>Peser les poudres d’hydrogénophosphate de calcium (CaHPO4) et de carbonate de calcium (CaCO 3) dans un rapport molaire de3:2 Ca:P. À l’aide d’une spatule, homogénéiser soigneusement les deux poudres.</li>
		<li>Ajouter le mélange de poudre d’hydrogénophosphate de calcium et de carbonate de calcium à un creuset en zircone de telle sorte qu’il ne soit pas rempli à plus de 75%.<b...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

La technique d’impression 3D COBICS a été développée pour permettre la fabrication de structures minéralisées ressemblant à des os par extrusion dans une suspension de microgel réticulable contenant des cellules vivantes. La technique a été appliquée à une suspension de microgel dégradable, et les cellules montrent une bonne viabilité, propagation et capacité de différenciation ostéogénique dans le système11. Un déterminant clé du succès des constructions créées à l’ai...

L’os a des capacités de régénération remarquables en tant que l’une des rares structures du corps qui peut guérir en recréant sa composition cellulaire normale, son orientation et sa force mécanique jusqu’à une taille de défaut critique, lorsque la capacité de guérison endogène est compromise1. L’os, avec le cartilage et les ligaments, soutient et facilite le mouvement du corps, tout en stockant les minéraux et les graisses et en produisant des cellules sanguines. En tant que tissu conjonctif dur et dense, l’os est principalement composé d’une phase inorganique, d’eau et de matière organique composée principalement de fibres de collagène2. Les cellules sont intégrées dans cette matrice hautement minéralisée de fibres de collagène I et de cristaux d’hydroxyapatite (HA), formant une structure hiérarchique3.
L’organisation complexe de ce tissu rend la fabrication d’alternatives synthétiques pour reproduire les micro et nano-environnements osseux hétérogènes exceptionnellement difficile3. À cette fin, une variété de matériaux, y compris des biocéramiques, des hydrogels chargés de cellules et des matériaux synthétiques ont été proposés comme solutions pour créer des matrices osseuses. Parmi les techniques de fabrication d’échafaudages, les techniques basées sur l’impression 3D ont récemment émergé et ont reçu beaucoup d’attention de la communauté de l’ingénierie tissulaire en raison de leur capacité remarquable à permettre la fabrication de structures hautement sophistiquées et précises avec de grandes promesses de traitement spécifique au patient 4,5,6 . Les hydrogels ont été le choix le plus populaire d’imitations matricielles et de bio-encres car ils peuvent être imprimés avec des cellules et des molécules bioactives, générant des constructions fonctionnelles6. Cependant, les hydrogels n’ont pas les propriétés fonctionnelles de l’os, telles que la résistance mécanique et une phase inorganique hautement calcifiée contenant des cellules métaboliquement actives.
Les échafaudages en céramique imprimés en 3D nécessitent généralement des étapes de post-traitement, y compris le frittage, les traitements à haute température ou l’utilisation de produits chimiques agressifs qui doivent être soigneusement lavés avant les applications in vitro ou in vivo 5. Pour remédier à ces limitations, Lode et coll.7 ont récemment mis au point une pâte à base de phosphate α-tricalcique formée d’hydroxyapatite, qui peut être imprimée et durcie dans des conditions physiologiques. Cependant, ce matériau ne peut toujours pas être imprimé avec des cellules vivantes car il nécessite un post-traitement dans un environnement humide et une immersion ultérieure en solution aqueuse pendant une longue période.
Alternativement, des hydrogels chargés de cellules avec des particules inorganiques incorporées ont été proposés en remplacement de la matrice osseuse 3D 8,9. Malgré leur grande capacité à soutenir la viabilité cellulaire, ils ne sont pas en mesure de récapituler l’environnement du tissu osseux densément minéralisé. Thrivikarman et coll.10 ont adopté une approche biomimétique dans laquelle un milieu sursaturé de calcium et de phosphate a été utilisé avec un analogue protéique non collagène pour mieux imiter le dépôt d’apatite à l’échelle nanométrique. Cependant, leurs constructions ne peuvent toujours pas générer de constructions 3D rigides avec une architecture à l’échelle micro et macro ressemblant à de l’os.
La présente étude comble ces lacunes en élaborant une stratégie d’impression pour fabriquer des constructions imitant les os, en phases inorganiques et organiques, capables d’intégrer à la fois les cellules et les facteursde croissance 11. COBICS récapitule de manière unique la structure minérale et cellulaire de l’os en utilisant une technique de bio-impression à base de microgel. Le protocole décrit ici le processus de synthèse des microgels céramiques à base d’encre d’os et de gélatine, puis de combinaison de cellules permettant COBICS. Le processus commence par la synthèse du principal matériau précurseur de l’encre osseuse. L’hydrogel réticulable est ensuite synthétisé et formé en microgels. Enfin, l’encre osseuse est déposée de manière omnidirectionnelle dans un bain de support des microgels chargés de cellules (Figure 1).
L’encre osseuse peut être imprimée dans n’importe quelle suspension de microgels présentant les caractéristiques de limite d’élasticité appropriées, c’est-à-dire la capacité de fluidiser à une vitesse de cisaillement spécifique et de soutenir ensuite la structure déposée. Deux approches flexibles ont été démontrées : une suspension constituée de microgels de gélatine et une suspension constituée de microgels de méthacrylate de gélatine (GelMA). La première suspension se dissout lorsque la température est portée à 37 °C, la technique d’encastrement réversible d’hydrogels en suspension (FRESH)12, tandis que la seconde peut être photoréticulée après impression, ce qui permet de « coudre » efficacement les microgels ensemble et de verrouiller l’encre osseuse imprimée en place. La présente étude se concentre sur l’utilisation de GelMA comme matrice car elle offre l’avantage unique de pouvoir soutenir la croissance cellulaire avec l’impression in situ de structures mimétiques osseuses complexes. En fin de compte, cette approche permet la génération de modèles tissulaires complexes avec des niveaux élevés de biomimétisme et de vastes implications pour la modélisation de la maladie, la découverte de médicaments et l’ingénierie régénérative.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> Figure 1 : Schéma du flux de travail. (A) L’encre osseuse est synthétisée à partir de la synthèse du phosphate α-tricalcique et de sa combinaison ultérieure avec du glycérol, du polysorbate 80 et du phosphate d’ammonium dibasique. (B) Les microgels GelMA sont fabriqués par la méthode de l’émulsion eau dans huile. Les microgels obtenus sont alors (C) hydratés et (D) combinés avec des cellules. Les composites cellule-microgel sont ensuite utilisés comme un bain granulaire dans lequel l’encre osseuse est déposée. (E) L’ensemble de la construction est ensuite réticulé par UV et transféré à l’incubateur pour la culture. Abréviations : α-TCP = phosphate α-tricalcique; GelMA = méthacrylate de gélatine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

Structurellement, le tissu osseux est un composite inorganique-organique contenant des cellules métaboliquement actives intégrées dans une matrice hiérarchique hautement minéralisée. Cette organisation est difficile à reproduire en raison de l’environnement hétérogène de l’os. La bioimpression céramique omnidirectionnelle en suspensions cellulaires (COBICS) est une technique de bio-impression à base de microgel qui reproduit de manière unique la structure minérale et cellulaire de l’os. COBICS imprime des constructions complexes et biologiquement pertinentes sans avoir besoin de matériaux de support sacrificiels ou d’étapes de post-traitement sévères (par exemple, rayonnement et frittage à haute température), qui sont deux des plus grands défis de la fabrication additive de constructions mimétiques osseuses. Cette technique est rendue possible par l’extrusion libre d’une nouvelle encre à base de phosphate de calcium dans une suspension de microgel à base de gélatine. Les propriétés de limite d’élasticité de la suspension permettent le dépôt et soutiennent la structure osseuse imprimée. La réticulation UV et les nanoprécipitations le « verrouillent » ensuite en place. La capacité d’imprimer des céramiques nanostructurées mimétiques osseuses dans des biomatériaux chargés de cellules fournit un contrôle spatio-temporel sur la macro et la micro-architecture et facilite la fabrication en temps réel de constructions osseuses complexes dans des contextes cliniques.

COBICS imprime des constructions complexes et biologiquement pertinentes sans avoir besoin de matériaux de support sacrificiels ou d’étapes de post-traitement sévères (par exemple, le rayonnement et le frittage à haute température) qui sont deux des plus grands défis de la fabrication additive de constructions mimétiques osseuses. Pour démontrer la formation COBICS de structures osseuses complexes et la co-impression de cellules dans des suspensions de microgel, des images représentatives de composites osseux...

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Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Ce protocole décrit une technique d’impression 3D pour fabriquer des structures ressemblant à des os en déposant une encre au phosphate de calcium dans un support granulaire à base de gélatine. Les analogues osseux imprimés sont déposés sous forme libre, avec une flexibilité pour la récolte directe de l’empreinte ou la réticulation dans une matrice de cellules vivantes pour les constructions multiphasiques.

Bio-impression omnidirectionnelle céramique dans des suspensions chargées de cellules pour la génération d’analogues osseux

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Ce protocole permet la fabrication d’analogues osseux sans nécessiter de chauffage ou de produits chimiques toxiques. De cette façon, les structures osseuses sont formées avec le potentiel de réparer un défaut osseux dans les milieux cliniques en utilisant les propres cellules d’un patient. Le principal avantage de la technique est que l’encre osseuse peut être imprimée avec des cellules vivantes pour former n’importe quelle structure osseuse complexe et pour diriger la différenciation vers la lignée formant l’os.En outre, les médicaments peuvent être chargés dans l’encre osseuse pour améliorer simultanément la cicatrisation des plaies, la régénération osseuse et pour traiter des pathologies comme le cancer. La démonstration de la procédure sera assurée par Gagan Jalandhra, candidate au doctorat dans mon laboratoire, et le Dr Sara Romanazzo, qui a travaillé avec moi et le Dr Jalandhra sur divers projets, y compris le développement de cette technologie. Commencez par ajouter le mélange d’hydrogénophosphate de calcium et de poudre de carbonate de calcium à un creuset de zircone de sorte qu’il ne soit pas rempli à plus de 75%.Transférer le creuset dans un four, le chauffer à 1 400 degrés Celsius à un taux de cinq degrés Celsius par minute et le maintenir pendant trois heures. Éteindre la réaction en retirant le creuset du four et en le laissant au sommet du bloc réfractaire. Laissez-le refroidir complètement avant de le manipuler.Utilisez un mortier et un pilon pour casser et broyer le gâteau de phosphate alpha-tricalcique de sorte que les granulés obtenus aient une taille maximale de 200 micromètres. Ajouter trois boules de zircone stabilisées à l’yttrium de trois millimètres au mélange broyé, suivies d’éthanol à 100%. Fixez le couvercle et broyez pendant deux heures à 180 rotations par minute.Récupérez la suspension et séparez les billes en utilisant 100% d’éthanol pour le lavage. Sécher la suspension dans un four à 120 degrés Celsius pendant 24 heures. Ajouter la poudre séchée dans les bocaux de mouture avec des boules de zircone d’un millimètre et 100% d’éthanol dans les mêmes rapports de poids qu’à la première étape.Broyer pendant deux heures à 180 rotations par minute. Puis séparer et sécher au four. Retirer l’échantillon du four.Pour faire l’encre osseuse, ajoutez 630 microlitres de glycérol et 130 microlitres de polysorbate 80 dans un pot de bille bil. Ajouter ensuite 100 milligrammes de phosphate d’ammonium dibasique et deux grammes de poudre de phosphate alpha-tricalcique à la solution et remuer continuellement avec une spatule pour combiner. Ajouter une boule de zircone de 25 millimètres, fixer le couvercle et le placer à l’intérieur d’un moulin planétaire pendant 60 minutes à 180 rotations par minute, en s’arrêtant à mi-chemin pour gratter les côtés du pot avec une spatule à l’aide d’une spatule.Chargez l’encre dans une seringue d’un millilitre. Faire une solution à 10% de gélatine de type A dans 1X PBS comme décrit dans le manuscrit texte. Placer la fiole conique sur l’agitateur.Ajoutez ensuite 5,796 millilitres d’anhydride méthacrylique et continuez à agiter dans l’obscurité à 50 degrés Celsius pendant 90 minutes. Éteindre la réaction en diluant deux fois le contenu des flacons coniques avec du PBS. Décanter dans des tubes de 50 millilitres et éliminer l’anhydride méthacrylique n’ayant pas réagi par centrifugation à 3000 RCF à température ambiante pendant trois minutes et collecte du surnageant.Dialyser le surnageant à l’intérieur de tubes de dialyse en cellulose coupés de 14 kilodaltons contre de l’eau désionisée à 40 degrés Celsius pendant cinq jours tout en remuant doucement. Remplacez l’eau désionisée tous les jours. Préparez-vous pour le stockage en décantant dans des tubes de 50 millilitres, en fixant le bouchon et en le plaçant au réfrigérateur pendant 12 heures.Ensuite, congelez les échantillons avec de l’azote liquide et lyophilisez immédiatement pendant cinq jours à moins 54 degrés Celsius et 0,4 millibars. Conservez la mousse obtenue dans un congélateur à moins 20 degrés Celsius. Pour synthétiser les microgels GelMA, préparez une solution de GelMA à 10% poids par poids dans du PBS en pesant le GelMA lyophilisé, en l’ajoutant à un tube avec du PBS et en le chauffant au bain-marie à 50 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit complètement hydraté.Ajoutez 37 millilitres d’huile par millilitre de solution de GelMA à un bécher, en veillant à ce qu’il ne soit pas rempli à plus de 65%. Installez un système de double bécher sur une plaque chauffante sous agitation magnétique en plaçant le bécher contenant de l’huile à l’intérieur d’un bécher plus grand. Chauffer à 40 degrés Celsius en remuant.Chargez la solution GelMA dans une seringue et ajoutez-la goutte à goutte dans l’huile d’agitation à travers un filtre de 0,45 micromètre. Laissez l’émulsion s’équilibrer pendant 10 minutes. Réduire la température de l’émulsion à 15 degrés Celsius à thermiquement.Stabilisez les sphères en ajoutant de la glace pilée dans l’espace entre les deux béchers. Ajouter de l’acétone à l’émulsion GelMA tournante. Décanter le contenu du bécher dans des tubes de 50 millilitres, en veillant à laver les parois du bécher avec de l’acétone.Laisser reposer pendant 20 minutes pour permettre aux microgels déshydratés de se déposer au fond. Jeter le surnageant et laver les microgels deux fois avec de l’acétone. Consolider dans un tube, remplir d’acétone et soniquer pendant 10 secondes.Encore une fois, lavez-le deux fois avec de l’acétone. Conserver dans de l’acétone à température ambiante jusqu’à ce qu’elle soit nécessaire pour l’impression. Pour préparer la suspension de microgel GelMA pour l’impression, formuler une solution à 1% poids par poids de GelMA dans DMEM comme décrit dans le manuscrit texte.Évaporer l’acétone des microgels déshydratés et peser la poudre obtenue dans un tube. Ajouter l’acétone et transférer dans un environnement stérile. Pour former la suspension de microgel, évaporez l’acétone de la poudre à l’intérieur de l’enceinte de biosécurité.Après évaporation, ajouter du DMEM, une solution de GelMA à 1% dans du DMEM et une solution initiatrice LAP à 2,5% pour obtenir une fraction d’emballage finale de 30%Laisser hydrater complètement pendant au moins 12 heures à température ambiante. Culture des cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux dans du DMEM à faible teneur en glucose supplémenté en 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à confluence. Retirer les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu en retirant le milieu et en les lavant avec du PBS stérile.Enduire les cellules par centrifugation à 150 RCF à température ambiante pendant cinq minutes. Comptez les cellules et calculez au moins 5 x 10 aux cinq cellules pour chaque millilitre de microgels GelMA. Attribuer le volume requis de la suspension cellulaire à un tube et à une pastille séparés, comme démontré précédemment.Retirer délicatement autant de surnageant que possible à l’aide d’une pipette, en ne laissant que la pastille de cellule. Ajouter le volume requis de suspension de microgel à la pastille et pipeter doucement de haut en bas pour assurer une distribution uniforme. Charger la cellule chargée en suspension de microgel dans un réacteur à l’aide d’une pipette.À l’aide d’une seringue d’un millilitre équipée d’une aiguille de calibre 23, déposer l’encre osseuse, réticuler la cellule et les constructions de microgel GelMA chargées d’encre osseuse avec une lampe de réticulation UV à 405 nanomètres pendant 90 secondes. Transférer immédiatement la suspension de microgel sur une plaque de puits de taille appropriée contenant du DMEM complet. Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Remplacez le milieu de culture après 24 heures, puis toutes les 48 à 72 heures au besoin. L’encre osseuse a été analysée par microscopie électronique à balayage pour déterminer sa microstructure, qui a montré la formation de cristaux d’hydroxyapatite après prise d’encre, particulièrement visible dans des conditions sèches. Dans cette étude, les cellules ont été mélangées avec des microgels GelMA et conservées en culture jusqu’à cinq jours, soit en suspension de microgel uniquement, soit dans le système COBICS.Les cellules ont montré une bonne viabilité en présence de l’encre osseuse, à la fois le premier et le cinquième jour, confirmant que les produits de lixiviation de l’encre n’étaient pas nocifs pour les cellules. Il est crucial de contrôler la vitesse de l’agitateur tout en synthétisant le microgel, car de légers changements peuvent entraîner des différences de taille. Il est également important d’assurer une distribution homogène des cellules dans la suspension de microgel.Le même protocole peut être utilisé pour imprimer à l’intérieur des suspensions de microgel de gélatine, qui agissent comme des supports sacrificiels, laissant derrière eux des constructions osseuses autonomes. Mais l’utilisation de GelMA ouvre la voie à des constructions multiphasiques à pot, telles que les interfaces ostéochondrales ou tendineuses osseuses.

Research

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Bioengineering

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