Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Die Autoren danken dem National Health and Medical Research Council (Grant-Nr. GNT1111694 und GNT1141602) und dem Australian Research Council (Grant-Nr. FT180100417, FL150100060 und CE14100036). Die Autoren danken der Biomedical Imaging Facility an der University of New South Wales. Die Abbildungen wurden mit Biorender.com, Adobe Photoshop und Adobe Illustrator erstellt und im Rahmen eines kostenpflichtigen Abonnements exportiert.

1. Herstellung von Knochentinte
<ol><li>Synthese von α-Tricalciumphosphat<ol><li>Calciumhydrogenphosphat (CaHPO4) und Calciumcarbonat (CaCO 3) Pulver werden in einem molaren Verhältnis von3:2 Ca:P abgewogen. Mit einem Spatel die beiden Pulver gründlich homogenisieren.</li>
		<li>Geben Sie das Calciumhydrogenphosphat-Calciumcarbonat-Pulvergemisch in einen Zirkonoxidtiegel, so dass es nicht mehr als 75% gefüllt ist. HINWEIS: Um eine Kontamination zu vermeiden, verwenden Sie e...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

Die 3D-Drucktechnik COBICS wurde entwickelt, um die Herstellung mineralisierter knochenähnlicher Strukturen durch Extrusion zu einer vernetzbaren Mikrogel-Suspension mit lebenden Zellen zu ermöglichen. Die Technik wurde auf eine abbaubare Mikrogelsuspension angewendet, und die Zellen zeigen eine gute Lebensfähigkeit, Ausbreitung und osteogene Differenzierungsfähigkeit innerhalb des Systems11. Eine Schlüsseldeterminante für den Erfolg von Konstrukten, die mit dieser Technik erstellt werden, i...

Knochen hat bemerkenswerte Regenerationsfähigkeiten als eine der wenigen Strukturen im Körper, die heilen können, indem sie ihre normale zelluläre Zusammensetzung, Orientierung und mechanische Stärke bis zu einer kritischen Defektgröße wiederherstellen, wenn die endogene Heilungskapazität beeinträchtigt ist1. Knochen unterstützt und erleichtert zusammen mit Knorpel und Band die Bewegung des Körpers, speichert Mineralien und Fette und produziert Blutzellen. Als hartes, dichtes Bindegewebe besteht Knochen hauptsächlich aus einer anorganischen Phase, Wasser und organischem Material, das hauptsächlich aus Kollagenfasernbesteht 2. Die Zellen sind in diese hochmineralisierte Matrix aus Kollagen-I-Fasern und Hydroxylapatit (HA)-Kristallen eingebettet und bilden eine hierarchische Struktur3.
Die komplexe Organisation dieses Gewebes macht die Herstellung synthetischer Alternativen zur Replikation der heterogenen Knochenmikro- und Nanoumgebungen außergewöhnlich schwierig3. Zu diesem Zweck wurde eine Vielzahl von Materialien, einschließlich Biokeramik, zellbeladene Hydrogele und synthetische Materialien, als Lösungen zur Herstellung von Knochenmatrizen vorgeschlagen. Unter den Gerüstherstellungstechniken sind in jüngster Zeit 3D-Druck-basierte Techniken aufgetaucht, die aufgrund ihrer bemerkenswerten Fähigkeit, die Herstellung hochentwickelter und präziser Strukturen mit großem Potenzial für eine patientenspezifische Behandlung zu ermöglichen, viel Aufmerksamkeit von der Tissue-Engineering-Community erhaltenhaben 4,5,6 . Hydrogele sind die beliebteste Wahl für Matrix-Mimik und Bio-Tinten, da sie zusammen mit Zellen und bioaktiven Molekülen gedruckt werden können, wodurch funktionelle Konstrukte erzeugtwerden 6. Hydrogelen fehlen jedoch die funktionellen Eigenschaften von Knochen, wie mechanische Festigkeit und eine stark verkalkte, anorganische Phase, die metabolisch aktive Zellen enthält.
3D-gedruckte Keramikgerüste erfordern in der Regel Nachbearbeitungsschritte, einschließlich Sintern, Hochtemperaturbehandlungen oder die Verwendung aggressiver Chemikalien, die vor In-vitro - oder In-vivo-Anwendungen gründlich gewaschen werden müssen5. Um diese Einschränkungen zu beheben, haben Lode et al.7 kürzlich eine α-Tricalciumphosphat-basierte Paste entwickelt, die aus Hydroxylapatit gebildet wird und unter physiologischen Bedingungen gedruckt und fixiert werden kann. Dieses Material kann jedoch immer noch nicht zusammen mit lebenden Zellen gedruckt werden, da es eine Nachbehandlung in einer feuchten Umgebung und ein anschließendes Eintauchen in wässrige Lösung über einen langen Zeitraum erfordert.
Alternativ wurden zellbeladene Hydrogele mit eingearbeiteten anorganischen Partikeln als Ersatz für die 3D-Knochenmatrix 8,9 vorgeschlagen. Trotz ihrer großen Fähigkeit, die Zelllebensfähigkeit zu unterstützen, sind sie nicht in der Lage, die dicht mineralisierte Knochengewebeumgebung zu rekapitulieren. Thrivikarman et al.10 verfolgten einen biomimetischen Ansatz, bei dem ein übersättigtes Calcium- und Phosphatmedium mit einem nicht-kollagenen Proteinanalogon verwendet wurde, um die nanoskalige Apatitablagerung besser nachzuahmen. Ihre Konstrukte können jedoch immer noch keine starren 3D-Konstrukte mit einer Architektur im Mikro- und Makromaßstab erzeugen, die einem Knochen ähnelt.
Die vorliegende Studie befasst sich mit diesen Mängeln durch die Entwicklung einer Druckstrategie zur Herstellung knochennachahmender Konstrukte in anorganischen und organischen Phasen, die in der Lage sind, sowohl Zellen als auch Wachstumsfaktoren zu integrieren11. COBICS rekapituliert auf einzigartige Weise die mineralische und zelluläre Struktur des Knochens mit einer Mikrogel-basierten Bioprinting-Technik. Das hierin enthaltene Protokoll beschreibt den Prozess der Synthese der keramischen Knochentinte und Mikrogele auf Gelatinebasis und der anschließenden Kombination von Zellen, die COBICS ermöglichen. Der Prozess beginnt mit der Synthese des Hauptvorläufermaterials der Knochentinte. Das vernetzbare Hydrogel wird dann synthetisiert und zu Mikrogelen geformt. Schließlich wird die Knochentinte omnidirektional in einem Stützbad der mit Zellen beladenen Mikrogele abgeschieden (Abbildung 1).
Die Knochentinte kann in eine beliebige Suspension von Mikrogelen gedruckt werden, die die entsprechenden Fließspannungseigenschaften aufweisen, d. h. die Fähigkeit, mit einer bestimmten Schergeschwindigkeit zu fluidisieren und anschließend die abgeschiedene Struktur zu unterstützen. Es wurden zwei flexible Ansätze demonstriert: eine Suspension aus Gelatine-Mikrogelen und eine Suspension aus Gelatinemethacrylat-Mikrogelen (GelMA). Die erste Suspension löst sich auf, wenn die Temperatur auf 37 °C erhöht wird, die Freiform-Reversible-Einbettung von suspendierten Hydrogelen (FRESH) Technik12, während letztere nach dem Drucken photovernetzt werden kann, wodurch die Mikrogele effektiv "zusammengenäht" werden und die gedruckte Knochentinte an Ort und Stelle fixiert wird. Die vorliegende Studie konzentriert sich auf die Verwendung von GelMA als Matrix, da es den einzigartigen Vorteil bietet, das Zellwachstum durch In-situ-Druck komplexer knochenmimetischer Strukturen unterstützen zu können. Letztendlich ermöglicht dieser Ansatz die Erzeugung komplexer Gewebemodelle mit einem hohen Maß an Biomimikry und weitreichenden Auswirkungen auf die Krankheitsmodellierung, die Wirkstoffforschung und das regenerative Engineering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs . (A) Die Knochentinte wird ausgehend von der α-Tricalciumphosphat-Synthese und ihrer anschließenden Kombination mit Glycerin, Polysorbat 80 und Ammoniumphosphat dibasisch synthetisiert. (B) GelMA-Mikrogele werden nach dem Wasser-in-Öl-Emulsionsverfahren hergestellt. Die erhaltenen Mikrogele werden dann (C) hydratisiert und (D) mit Zellen kombiniert. Zell-Mikrogel-Verbundwerkstoffe werden dann als körniges Bad verwendet, in dem die Knochentinte abgeschieden wird. (E) Das gesamte Konstrukt wird dann UV-vernetzt und in den Inkubator für Kultur überführt. Abkürzungen: α-TCP = α-Tricalciumphosphat; GelMA = Gelatinemethacrylat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

Strukturell ist Knochengewebe ein anorganisch-organisches Komposit mit metabolisch aktiven Zellen, die in eine hierarchische, hochmineralisierte Matrix eingebettet sind. Diese Organisation ist aufgrund der heterogenen Umgebung des Knochens schwierig zu replizieren. Ceramic omnidirectional Bioprinting in Cell-Suspensions (COBICS) ist eine Mikrogel-basierte Bioprinting-Technik, die die mineralische und zelluläre Struktur des Knochens auf einzigartige Weise repliziert. COBICS druckt komplexe, biologisch relevante Konstrukte ohne opfernde Trägermaterialien oder harte Nachbearbeitungsschritte (z.B. Bestrahlung und Hochtemperatursintern), die zwei der größten Herausforderungen bei der additiven Fertigung von knochenmimetischen Konstrukten darstellen. Diese Technik wird durch die Freiformextrusion einer neuartigen Tinte auf Calciumphosphatbasis in einer Mikrogelsuspension auf Gelatinebasis ermöglicht. Die Fließspannungseigenschaften der Suspension ermöglichen die Ablagerung und unterstützen die gedruckte Knochenstruktur. UV-Vernetzung und Nanopräzipitation "verriegeln" es dann. Die Fähigkeit, nanostrukturierte knochenmimetische Keramiken in zellbeladenen Biomaterialien zu drucken, bietet eine raumzeitliche Kontrolle über Makro- und Mikroarchitektur und erleichtert die Echtzeitherstellung komplexer Knochenkonstrukte in klinischen Umgebungen.

COBICS druckt komplexe, biologisch relevante Konstrukte ohne Opfermaterialien oder harte Nachbearbeitungsschritte (z.B. Strahlungs- und Hochtemperatursintern), die zwei der größten Herausforderungen bei der additiven Fertigung von knochenmimetischen Konstrukten darstellen. Um die COBICS-Bildung komplexer Knochenstrukturen und den Co-Druck von Zellen in Mikrogelsuspensionen zu demonstrieren, wurden repräsentative Bilder von knochenartigen Kompositen aus der Knochentinte aufgenommen und eine semiquantitative Analyse der...

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Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Dieses Protokoll beschreibt eine 3D-Drucktechnik zur Herstellung knochenähnlicher Strukturen durch Abscheiden einer Calciumphosphat-Tinte in einem körnigen Träger auf Gelatinebasis. Gedruckte Knochenanaloga werden in Freiform abgeschieden, mit Flexibilität für die direkte Ernte des Drucks oder die Vernetzung innerhalb einer lebenden Zellmatrix für mehrphasige Konstrukte.

Keramisches omnidirektionales Bioprinting in zellbeladenen Suspensionen zur Erzeugung von Knochenanaloga

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Herstellung von Knochenanaloga, ohne dass Erhitzung oder toxische Chemikalien erforderlich sind. Auf diese Weise entstehen Knochenstrukturen, die das Potenzial haben, einen Knochendefekt im klinischen Umfeld mit patienteneigenen Zellen zu reparieren. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass die Knochentinte mit lebenden Zellen gedruckt werden kann, um eine komplexe knochenähnliche Struktur zu bilden und die Differenzierung in Richtung knochenbildender Linie zu lenken.Darüber hinaus können Medikamente in die Knochentinte geladen werden, um gleichzeitig die Wundheilung, die Knochenregeneration und die Behandlung von Krankheiten wie Krebs zu verbessern. Gagan Jalandhra, ein Doktorand in meinem Labor, und Dr. Sara Romanazzo, die mit mir und Dr. Jalandhra an verschiedenen Projekten gearbeitet hat, einschließlich der Entwicklung dieser Technologie, werden das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit der Zugabe der Mischung aus Calciumhydrogenphosphat und Calciumcarbonatpulver zu einem Zirkonoxidtiegel, so dass er nicht mehr als 75% gefüllt ist.Den Tiegel in einen Ofen überführen, auf 1.400 Grad Celsius mit einer Geschwindigkeit von fünf Grad Celsius pro Minute erhitzen und drei Stunden halten. Die Reaktion wird abgeschreckt, indem der Tiegel aus dem Ofen genommen und oben auf dem feuerfesten Block belassen wird. Lassen Sie es vor der Handhabung vollständig abkühlen.Verwenden Sie einen Mörser und einen Stößel, um den Alpha-Tricalciumphosphat-Kuchen zu brechen und zu mahlen, so dass das resultierende Granulat eine maximale Größe von 200 Mikrometern hat. Geben Sie drei Millimeter Yttrium-stabilisierte Zirkonoxidkugeln zu der gemahlenen Mischung, gefolgt von 100% Ethanol. Sichern Sie den Deckel und schleifen Sie ihn zwei Stunden lang mit 180 Umdrehungen pro Minute.Sammeln Sie die Suspension und trennen Sie die Kugeln mit 100% Ethanol zum Waschen. Trocknen Sie die Suspension im Ofen bei 120 Grad Celsius für 24 Stunden. Geben Sie das getrocknete Pulver in die Mahlgläser mit einem Millimeter Zirkonia-Kugeln und 100% Ethanol im gleichen Gewichtsverhältnis wie in der ersten Stufe.Mahlen Sie zwei Stunden lang mit 180 Umdrehungen pro Minute. Dann trennen und im Ofen trocknen. Nehmen Sie die Probe aus dem Ofen.Um die Knochentinte herzustellen, geben Sie 630 Mikroliter Glycerin und 130 Mikroliter Polysorbat 80 in ein Kugelglas. Dann geben Sie 100 Milligramm Ammoniumphosphat zweibasisch und zwei Gramm Alpha-Tricalciumphosphat-Pulver in die Lösung und rühren Sie kontinuierlich mit einem Spatel um, um zu vermischen. Fügen Sie eine 25-Millimeter-Zirkonia-Kugel hinzu, befestigen Sie den Deckel und legen Sie ihn für 60 Minuten mit 180 Umdrehungen pro Minute in eine Planetenmühle, wobei Sie auf halbem Weg pausieren, um die Seiten des Glases mit einem Spatel mit einem Spatel mit einem Spatel abzukratzen.Legen Sie die Tinte in eine Ein-Milliliter-Spritze. Machen Sie eine 10%ige Lösung von Gelatine Typ A in 1X PBS, wie im Textmanuskript beschrieben. Setzen Sie den Erlenmeyerkolben auf den Rührer.Dann 5,796 Milliliter Methacrylanhydrid zugeben und im Dunkeln bei 50 Grad Celsius 90 Minuten weiterrühren. Die Reaktion wird abgeschreckt, indem der Inhalt des Erlenmeyerkolbens mit PBS zweifach verdünnt wird. In 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen und das nicht umgesetzte Methacrylanhydrid durch Zentrifugieren bei 3000 RCF bei Raumtemperatur für drei Minuten und Auffangen des Überstands entfernen.Dialysieren Sie den Überstand in 14 Kilodalton geschnittenen Zellulose-Dialyseröhrchen gegen deionisiertes Wasser bei 40 Grad Celsius für fünf Tage unter vorsichtigem Rühren. Ersetzen Sie das deionisierte Wasser jeden Tag. Bereiten Sie sich auf die Lagerung vor, indem Sie in 50-Milliliter-Röhrchen umfüllen, die Kappe befestigen und für 12 Stunden in den Kühlschrank stellen.Dann die Proben mit flüssigem Stickstoff einfrieren und sofort fünf Tage lang bei minus 54 Grad Celsius und 0,4 Millibar lyophilisieren. Lagern Sie den entstandenen Schaum in einem Gefrierschrank bei minus 20 Grad Celsius. Um GelMA-Mikrogele zu synthetisieren, stellen Sie eine GelMA-Lösung mit 10 Gewichtsprozent in PBS her, indem Sie das lyophilisierte GelMA wiegen, es in ein Röhrchen mit PBS geben und in einem Wasserbad bei 50 Grad Celsius erhitzen, bis es vollständig hydratisiert ist.Geben Sie 37 Milliliter Öl pro Milliliter GelMA-Lösung in ein Becherglas und stellen Sie sicher, dass es nicht mehr als 65% gefüllt ist. Stellen Sie ein Doppelbechersystem auf einer Heizplatte mit Magnetrühren auf, indem Sie das Becherglas mit Öl in ein größeres Becherglas legen. Unter Rühren auf 40 Grad Celsius erhitzen.Füllen Sie die GelMA-Lösung in eine Spritze und geben Sie sie durch einen 0,45-Mikrometer-Filter tropfenweise in das Rühröl. Lassen Sie die Emulsion 10 Minuten einwirken. Reduzieren Sie die Temperatur der Emulsion auf 15 Grad Celsius thermisch.Stabilisieren Sie die Kugeln, indem Sie zerstoßenes Eis in den Raum zwischen den beiden Bechergläsern geben. Fügen Sie der sich drehenden GelMA-Emulsion Aceton hinzu. Dekantieren Sie den Inhalt des Becherglases in 50-Milliliter-Röhrchen und waschen Sie die Wände des Becherglases mit Aceton.Lassen Sie es 20 Minuten ruhen, damit sich die dehydrierten Mikrogele auf dem Boden absetzen können. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie die Mikrogele zweimal mit Aceton. In einem Röhrchen konsolidieren, mit Aceton auffüllen und 10 Sekunden lang beschallen.Wieder zweimal mit Aceton waschen. In Aceton bei Raumtemperatur aufbewahren, bis es für den Druck benötigt wird. Um die GelMA-Mikrogel-Suspension für den Druck vorzubereiten, formulieren Sie eine 1 Gew.-%-Lösung von GelMA in DMEM, wie im Textmanuskript beschrieben.Verdampfen Sie das Aceton aus den dehydrierten Mikrogelen und wiegen Sie das resultierende Pulver in ein Röhrchen. Fügen Sie Aceton hinzu und geben Sie es in eine sterile Umgebung. Um die Mikrogel-Suspension zu bilden, verdampfen Sie das Aceton aus dem Pulver in der Biosicherheitswerkbank.Nach dem Verdampfen fügen Sie DMEM, 1% GelMA-Lösung in DMEM und 2,5% LAP-Initiatorlösung hinzu, um eine Endverpackungsfraktion von 30% zu erreichen. Kultur der aus Fett gewonnenen mesenchymalen Stammzellen in DMEM mit niedrigem Glukosegehalt, ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid bis zum Zusammenfluss. Entfernen Sie die aus Fett gewonnenen mesenchymalen Stammzellen aus dem Gewebekulturkolben, indem Sie das Medium entfernen und mit sterilem PBS waschen.Die Zellen werden fünf Minuten lang bei 150 RCF bei Raumtemperatur zentrifugiert. Zählen Sie die Zellen und berechnen Sie mindestens 5 x 10 bis fünf Zellen für jeden Milliliter GelMA-Mikrogele. Weisen Sie das erforderliche Volumen der Zellsuspension einem separaten Röhrchen und Pellet zu, wie zuvor gezeigt.Entfernen Sie vorsichtig so viel Überstand wie möglich mit einer Pipette, so dass nur das Zellpellet übrig bleibt. Geben Sie die erforderliche Menge an Mikrogel-Suspension in das Pellet und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Laden Sie die mit Mikrogel-Suspension beladene Zelle mit einer Pipette in einen Reaktor.Scheiden Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze, die mit einer 23-Gauge-Nadel ausgestattet ist, die Knochentinte ab, vernetzen Sie die Zelle und die mit Knochentinte beladenen GelMA-Mikrogelkonstrukte mit einer UV-Vernetzerlampe bei 405 Nanometern für 90 Sekunden lang. Übertragen Sie die Mikrogel-Suspension sofort in eine Well-Platte mit entsprechender Größe, die vollständiges DMEM enthält. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.Tauschen Sie das Nährmedium nach 24 Stunden aus, danach je nach Bedarf alle 48 bis 72 Stunden. Die Knochentinte wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie analysiert, um ihre Mikrostruktur zu bestimmen, die die Bildung von Hydroxylapatitkristallen nach dem Abbinden der Tinte zeigte, die besonders unter trockenen Bedingungen sichtbar war. In dieser Studie wurden Zellen mit GelMA-Mikrogelen gemischt und bis zu fünf Tage in Kultur gehalten, entweder nur in Mikrogelsuspension oder im COBICS-System.Die Zellen zeigten sowohl am ersten als auch am fünften Tag eine gute Lebensfähigkeit in Gegenwart der Knochentinte, was bestätigte, dass die Auslaugungsprodukte der Tinte für die Zellen nicht schädlich waren. Es ist wichtig, die Rührgeschwindigkeit während der Synthese von Mikrogel zu kontrollieren, da eine geringfügige Veränderung des Rührens zu Größenunterschieden führen kann. Es ist auch wichtig, eine homogene Verteilung der Zellen innerhalb der Mikrogelsuspension zu gewährleisten.Das gleiche Protokoll kann verwendet werden, um in Gelatine-Mikrogel-Suspensionen zu drucken, die als Opferträger fungieren und eigenständige Knochenkonstrukte zurücklassen. Die Verwendung von GelMA eröffnet jedoch den Weg für mehrphasige Eintopfkonstrukte wie osteochondrale oder Knochensehnenschnittstellen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Erzeugung eines dreidimensionalen Vollhaut Equivalent und automatisierte Verwundung

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Forschung

Biotechnik

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting cellularized Konstruiert unter Verwendung eines gewebespezifischen Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradient Stamm Chip für anregende zellulären Verhaltensweisen in Zelle beladenen Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrofluidische Bioprinting für Engineering durchblutet, Gewebe und Organellen

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting von Knorpel und Haut-Gewebe-Analoga nutzen eine neuartige Passive Einheit Mischtechnik für Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Calvarial-Modell der Knochenvergrößerung bei Kaninchen zur Beurteilung des Knochenwachstums und der Neovaskularisation in Knochensubstitutionsmaterialien

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Messung der 3D-In-vivo-Schulterkinematik mittels biplanarer Videoradiographie

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D-Bioprinting von murinen kortikalen Astrozyten für die Entwicklung von neuralähnlichem Gewebe

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...