Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות למועצה הלאומית לבריאות ולמחקר רפואי (מענק מס' GNT1111694 ו-GNT1141602) ולמועצת המחקר האוסטרלית (מענק מס' FT180100417, FL150100060 ו-CE14100036). המחברים מבקשים להודות למתקן ההדמיה הביו-רפואית באוניברסיטת ניו סאות' ויילס. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender.com, Adobe Photoshop ו-Adobe Illustrator ויוצאו תחת מנוי בתשלום.

1. ייצור דיו עצם
<ol><li>סינתזה של α-טריקלציום פוספט<ol><li>שקלו אבקות סידן מימן פוספט (CaHPO4) וסידן פחמתי (CaCO 3) ביחס טוחן Ca:P של3:2. באמצעות מרית, הומוגניות יסודית של שתי האבקות.</li>
		<li>הוסיפו את תערובת אבקת הסידן מימן פוספט-סידן פחמתי לכור היתוך זירקוניה, כך שהוא לא יותר מ-75% מלא. ?...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

טכניקת ההדפסה התלת-ממדית COBICS פותחה כדי לאפשר ייצור של מבנים דמויי עצם שעברו מינרליזציה באמצעות שחול לתוך תרחיף מיקרוג'ל הניתן להצלבה המכיל תאים חיים. הטכניקה יושמה על תרחיף מיקרוג'ל מתכלה, והתאים מראים יכולת כדאיות, התפשטות והתמיינות אוסטאוגנית טובה בתוך המערכת11. גורם מרכזי ?...

לעצם יש יכולות התחדשות יוצאות דופן כאחד המבנים הבודדים בגוף שיכולים להחלים על ידי שחזור ההרכב התאי הרגיל שלה, האוריינטציה והחוזק המכני עד לגודל פגם קריטי, כאשר יכולת הריפוי האנדוגנית נפגעת1. העצם, יחד עם הסחוס והרצועות, תומכת ומקלה על תנועת הגוף, תוך אחסון מינרלים ושומנים וייצור תאי דם. כרקמת חיבור קשה וצפופה, העצם מורכבת בעיקר משלב אנאורגני, מים וחומר אורגני המורכב בעיקר מסיבי קולגן2. תאים מוטבעים בתוך מטריצה מינרלית מאוד זו של סיבי קולגן I וגבישי הידרוקסיאפטיט (HA), ויוצרים מבנה היררכי3.
הארגון המורכב של רקמה זו הופך את הייצור של חלופות סינתטיות כדי לשכפל את סביבות המיקרו והננו-סביבה ההטרוגניות של העצם למאתגרות במיוחד3. לשם כך הוצעו מגוון חומרים, כולל ביו-קרמיקה, הידרוג'לים עמוסי תאים וחומרים סינתטיים כפתרונות ליצירת מטריצות עצם. בין טכניקות ייצור הפיגומים, טכניקות מבוססות הדפסה תלת-ממדית התפתחו לאחרונה וקיבלו תשומת לב רבה מקהילת הנדסת הרקמות בשל יכולתן יוצאת הדופן לאפשר ייצור של מבנים מתוחכמים ומדויקים ביותר עם הבטחה גדולה לטיפול ספציפי למטופל 4,5,6 . הידרוג'לים הם הבחירה הפופולרית ביותר של חיקויים של מטריקס וביו-דיו מכיוון שניתן להדפיס אותם יחד עם תאים ומולקולות ביו-אקטיביות, וליצור מבנים פונקציונליים6. עם זאת, הידרוג'לים חסרים את התכונות הפונקציונליות של העצם, כגון חוזק מכני ופאזה אנאורגנית מאוד מסולסלת המכילה תאים פעילים מטבולית.
פיגומים קרמיים מודפסים בתלת-ממד דורשים בדרך כלל שלבים לאחר העיבוד, כולל סינטר, טיפולים בטמפרטורות גבוהות או שימוש בכימיקלים קשים שיש לשטוף ביסודיות לפני יישומי in vitro או in vivo 5. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, Lode et al.7 פיתחו לאחרונה משחה מבוססת α טריקלציום פוספט שנוצרה על ידי הידרוקסיאפטיט, שניתן להדפיס ולהגדיר בתנאים פיזיולוגיים. עם זאת, חומר זה עדיין לא יכול להיות מודפס יחד עם תאים חיים כפי שהוא דורש לאחר הטיפול בסביבה לחה ולאחר מכן טבילת תמיסה מימית במשך תקופה ארוכה.
לחלופין, הידרוג'ל עמוס תאים עם חלקיקים אנאורגניים ששולבו הוצע כתחליף למטריצת עצם תלת-ממדית 8,9. למרות יכולתם הרבה לתמוך בחיוניות התאים, הם אינם מסוגלים לשחזר את סביבת רקמת העצם המינרלית הצפופה. Thrivikarman et al.10 אימצו גישה ביומימטית שבה נעשה שימוש במדיום סידן ופוספט על-רווי עם אנלוגיה של חלבון שאינו קולגן כדי לחקות טוב יותר את תצהיר האפטיט הננומטרי. עם זאת, המבנים שלהם עדיין לא יכולים ליצור מבנים תלת-ממדיים קשיחים עם ארכיטקטורה בקנה מידה של מיקרו ומאקרו הדומה לעצם.
המחקר הנוכחי מטפל בליקויים אלה באמצעות פיתוח אסטרטגיית הדפסה לייצור מבנים מחקי עצם, בפאזה אנאורגנית ואורגנית, המסוגלים לשלב הן תאים והן גורמי גדילה11. COBICS משחזר באופן ייחודי את המבנה המינרלי והתאי של העצם באמצעות טכניקת הדפסה ביולוגית מבוססת מיקרוג'ל. הפרוטוקול שלהלן מתאר את תהליך הסינתזה של מיקרו-ג'לים מבוססי דיו עצם וג'לטין ולאחר מכן שילוב תאים המאפשרים COBICS. התהליך מתחיל בסינתזה של החומר המבשר העיקרי של דיו העצם. לאחר מכן, ההידרוג'ל הניתן לקישור צולב מסונתז ונוצר למיקרו-ג'לים. לבסוף, דיו העצם מופקד באופן רב-כיווני באמבט תמיכה של המיקרו-ג'לים העמוסים בתאים (איור 1).
ניתן להדפיס את דיו העצם לתוך כל השעיה של microgels שיש להם את המאפיינים המתאימים תשואה מתח, כלומר, את היכולת fluidize בקצב גזירה מסוים ולאחר מכן לתמוך במבנה המופקד. שתי גישות גמישות הודגמו: תרחיף המורכב ממיקרו-ג'ל ג'לטין ותרחיף המורכב ממיקרו-ג'ל ג'לטין מתקרילט (GelMA). ההשעיה הראשונה מתמוססת כאשר הטמפרטורה עולה ל -37 מעלות צלזיוס, ההטבעה ההפיכה החופשית של טכניקת הידרוג'לים תלויים (FRESH)12, בעוד שהאחרונה יכולה לעבור פוטוקרוסלינק לאחר ההדפסה, למעשה "לתפור" את המיקרוג'לים יחד ולנעול את דיו העצם המודפס במקומו. המחקר הנוכחי מתמקד בשימוש ב-GelMA כמטריצה, שכן הוא מספק את היתרון הייחודי של היכולת לתמוך בצמיחת תאים עם הדפסה באתרה של מבנים מימטיים מורכבים של העצם. בסופו של דבר, גישה זו מאפשרת יצירת מודלים מורכבים של רקמות עם רמות גבוהות של ביומימיקריה והשלכות רחבות על מידול מחלות, גילוי תרופות והנדסה רגנרטיבית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> איור 1: סכמטי של זרימת העבודה . (A) דיו העצם מסונתז החל מסינתזה של α-טריקלציום פוספט והשילוב הבא שלה עם גליצרול, פוליסורבט 80 ואמוניום פוספט דו-בסיסי. (B) מיקרו-ג'לים של GelMA מיוצרים בשיטת תחליב המים בשמן. המיקרו-ג'לים המתקבלים הם לאחר מכן (C) מיובשים ו-(D) משולבים עם תאים. לאחר מכן משתמשים בחומרים מרוכבים של תאים-מיקרוג'ל כאמבטיה גרגירית שבה מופקד דיו העצם. (E) המבנה כולו מועבר לאחר מכן להצלבת UV ומועבר לחממה לתרבית. קיצורים: α-TCP = α-טריקלציום פוספט; GelMA =ג'לטין מתקרילט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

מבחינה מבנית, רקמת העצם היא תרכובת אנאורגנית-אורגנית המכילה תאים פעילים מטבולית המוטבעים בתוך מטריצה היררכית ומינרלית מאוד. ארגון זה מאתגר לשכפול בשל הסביבה ההטרוגנית של העצם. הדפסה ביולוגית רב-כיוונית קרמית במתלי תאים (COBICS) היא טכניקת הדפסה ביולוגית מבוססת מיקרוג'ל המשכפלת באופן ייחודי את המבנה המינרלי והתאי של העצם. COBICS מדפיסה מבנים מורכבים ורלוונטיים ביולוגית ללא צורך בחומרי תמיכה להקרבה או בשלבים קשים לאחר העיבוד (למשל, קרינה וסינטר בטמפרטורה גבוהה), שהם שניים מהאתגרים הגדולים ביותר בייצור תוספים של מבנים מחקים עצם. טכניקה זו מתאפשרת באמצעות שחול חופשי של דיו חדשני על בסיס סידן פוספט בתוך תרחיף מיקרוג'ל על בסיס ג'לטין. תכונות עקת התשואה של התרחיף מאפשרות תצהיר ותומכות במבנה העצם המודפס. UV crosslinking וננו-משקעים ואז "נועלים" אותו במקומו. היכולת להדפיס קרמיקה ננו-מובנית של עצם-חיקוי בתוך ביו-חומרים עמוסי תאים מספקת שליטה מרחבית-טמפורלית על ארכיטקטורת מאקרו ומיקרו ומקלה על ייצור בזמן אמת של מבני עצם מורכבים בסביבות קליניות.

COBICS מדפיסה מבנים מורכבים ורלוונטיים מבחינה ביולוגית ללא צורך בחומרי תמיכה להקרבה או בשלבים קשים לאחר העיבוד (למשל, קרינה וסינטר בטמפרטורה גבוהה) שהם שניים מהאתגרים הגדולים ביותר בייצור תוספים של מבנים מחקים עצם. כדי להדגים היווצרות COBICS של מבני עצם מורכבים והדפסה משותפת של תאים במתלי מיקר...

Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדפסה תלת-ממדית לייצור מבנים דמויי עצם על ידי הפקדת דיו סידן פוספט בתמיכה גרעינית מבוססת ג'לטין. אנלוגי עצם מודפסים מופקדים בצורה חופשית, עם גמישות לקציר ישיר של ההדפסה או crosslinking בתוך מטריצת תא חי עבור מבנים multiphasic.

הדפסה ביולוגית רב-כיוונית קרמית במתלים עמוסי תאים ליצירת אנלוגים לעצם

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

פרוטוקול זה מאפשר ייצור של אנלוגים לעצם ללא צורך בחימום או כימיקלים רעילים. בדרך זו, מבנים עצם נוצרים עם פוטנציאל לתיקון פגם עצם במסגרות קליניות באמצעות התאים של המטופל עצמו. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא שניתן להדפיס את דיו העצם עם תאים חיים כדי ליצור כל מבנה מורכב דמוי עצם ולכוון את ההתמיינות לעבר שושלת יוצרת עצם.יתר על כן, ניתן להעמיס תרופות לתוך דיו העצם כדי לשפר בו זמנית את ריפוי הפצע, התחדשות העצם, ולטפל פתולוגיות כמו סרטן. מי שידגימו את ההליך יהיו גאגאן ג'לנדהרה, דוקטורנטית במעבדה שלי, וד"ר שרה רומנאצו, שעבדה איתי ועם ד"ר ג'לנדהרה על פרויקטים שונים, כולל פיתוח טכנולוגיה זו. התחל על ידי הוספת תערובת סידן מימן פוספט ואבקת סידן פחמתי לכור היתוך זירקוניה כך שהוא לא יותר מ 75% מלא.מעבירים את כור ההיתוך לכבשן, מחממים אותו ל-1, 400 מעלות צלזיוס בקצב של חמש מעלות צלזיוס לדקה ומחזיקים שלוש שעות. להרוות את התגובה על ידי הסרת כור ההיתוך מן הכבשן ולהשאיר בראש בלוק עקשן. תנו לו להתקרר לחלוטין לפני הטיפול.השתמש טיט ומזיק כדי לשבור ולטחון את עוגת אלפא טריקלציום פוספט, כך גרגירים וכתוצאה מכך יש גודל מקסימלי של 200 מיקרומטר. הוסיפו שלושה כדורי זירקוניה מיוצבים ביטריה לתערובת הטחונה, ואחריהם 100% אתנול. מהדקים את המכסה וטוחנים במשך שעתיים בקצב של 180 סיבובים לדקה.לאסוף את ההשעיה ולהפריד את הכדורים, באמצעות 100% אתנול לשטיפה. יבש את ההשעיה בתנור ב 120 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. מוסיפים את האבקה המיובשת לצנצנות הטחינה עם כדורי זירקוניה של מילימטר אחד ו-100% אתנול באותם יחסי משקל כמו בשלב הראשון.טוחנים במשך שעתיים ב 180 סיבובים לדקה. לאחר מכן להפריד ולייבש בתנור. מוציאים את הדגימה מהתנור.כדי ליצור את דיו העצם, להוסיף 630 מיקרוליטר של גליצרול ו 130 מיקרוליטר של polysorbate 80 לצנצנת מיל כדורית. לאחר מכן מוסיפים 100 מיליגרם של אמוניום פוספט דו-בסיסי ושני גרם אבקת אלפא-טריקלציום פוספט לתמיסה ומערבבים ברציפות עם מרית לשילוב. מוסיפים כדור זירקוניה בקוטר 25 מ"מ, מהדקים את המכסה ומניחים אותו בתוך טחנה פלנטרית למשך 60 דקות ב-180 סיבובים לדקה, תוך השהיה באמצע הדרך כדי לגרד את דפנות הצנצנת בעזרת מרית.טען את הדיו לתוך מזרק מיליליטר אחד. צור תמיסה של 10% של ג'לטין מסוג A ב- 1X PBS כמתואר בכתב היד של הטקסט. מניחים את הבקבוקון החרוטי על המערבל.לאחר מכן מוסיפים 5.796 מיליליטר של אנהידריד מתקרילי וממשיכים לערבב בחושך ב 50 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות. להרוות את התגובה על ידי דילול התוכן החרוטי פי שניים עם PBS. התמזגו לתוך צינורות של 50 מיליליטר והסירו את האנהידריד המתקרילי שלא הופעל על ידי צנטריפוגה ב-3000 RCF בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות ואיסוף הסופרנטנט.יש לדייק את הסופרנאטנט בתוך צינורות דיאליזה של תאית חתוכה במשקל 14 קילו-דלטון כנגד מים שעברו דה-יוניזציה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך חמישה ימים תוך ערבוב עדין. החלף את המים שעברו דה-יוניזציה מדי יום. היכונו לאחסון על ידי שקיעה לתוך צינורות 50 מיליליטר, אבטחת המכסה והכנסתו למקרר למשך 12 שעות.לאחר מכן להקפיא את הדגימות באמצעות חנקן נוזלי ומיד lyophilize במשך חמישה ימים במינוס 54 מעלות צלזיוס ו 0.4 מיליברס. אחסנו את הקצף המתקבל במקפיא בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. כדי לסנתז מיקרו-ג'לים של GelMA, הכינו תמיסת GelMA במשקל 10% לפי משקל ב-PBS על ידי שקילת ה-GelMA הליופילי, הוספתו לצינור עם PBS וחימום באמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עד לקבלת לחות מלאה.הוסף 37 מיליליטר שמן לכל מיליליטר אחד של תמיסת GelMA לכוס, וודא שהוא לא יותר מ-65% מלא. התקינו מערכת כפולה על פלטה חמה עם ערבוב מגנטי על ידי הנחת הכוס המכילה שמן בתוך גדולה יותר. מחממים ל-40 מעלות תוך כדי ערבוב.טען את תמיסת GelMA לתוך מזרק והוסף אותה טיפה לתוך שמן הערבוב דרך מסנן של 0.45 מיקרומטר. תנו לתחליב להתאזן למשך 10 דקות. להפחית את הטמפרטורה של תחליב ל 15 מעלות צלזיוס תרמית.ייצוב הכדורים על ידי הוספת קרח כתוש לחלל שבין שתי הכוסות. הוסיפו אצטון לתחליב GelMA המסתובב. דנטשו את תוכן הכוס לצינורות של 50 מיליליטר, תוך הקפדה לשטוף את קירות הכוס באצטון.תן לו לנוח במשך 20 דקות כדי לאפשר מיקרו ג'לים מיובשים להתיישב לתחתית. השליכו את הסופר-נטנט ושטפו את המיקרוג'לים פעמיים באצטון. התאחדו לצינור אחד, הוסיפו אצטון וסוניק למשך 10 שניות.שוב, לשטוף אותו עם אצטון פעמיים. יש לאחסן באצטון בטמפרטורת החדר עד להצורך בהדפסה. כדי להכין את תרחיף המיקרוג'ל של GelMA להדפסה, גיבש תמיסה של 1% משקל לפי משקל של GelMA ב-DMEM כמתואר בכתב היד של הטקסט.מאדים את האצטון מהמיקרוג'לים המיובשים ושוקלים את האבקה המתקבלת לתוך צינור. מוסיפים אצטון ומעבירים לסביבה סטרילית. כדי ליצור את תרחיף המיקרוג'ל, יש לאדות את האצטון מהאבקה שבתוך ארון ה-biosafety.לאחר האידוי, יש להוסיף DMEM, תמיסת 1% GelMA ב-DMEM ותמיסת ייזום של 2.5% LAP כדי להשיג חלק אריזה סופי של 30% אפשר לחות מלאה למשך 12 שעות לפחות בטמפרטורת החדר. תרבית את תאי הגזע המזנכימליים שמקורם בשומן ב-DMEM דל גלוקוז בתוספת 10% FBS ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני עד למפגש. הסר את תאי הגזע המזנכימליים שמקורם בשומן מבקבוק תרבית הרקמה על ידי הסרת המדיום ושטיפה עם PBS סטרילי.גלולו את התאים על ידי צנטריפוגה ב-150 RCF בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. ספרו את התאים וחשבו לפחות 5 x 10 עד חמשת התאים עבור כל מיליליטר של מיקרו-ג'לים של GelMA. הקצה את הנפח הנדרש של מתלה התא לצינור נפרד וגלולה כפי שהודגם קודם לכן.בזהירות להסיר supernatant ככל האפשר באמצעות פיפטה, משאיר רק את גלולת התא. הוסף את הנפח הנדרש של תרחיף מיקרוג'ל לכדור ופיפטה עדינה למעלה ולמטה כדי להבטיח חלוקה אחידה. טען את התא עמוס ההשעיה במיקרוג'ל לתוך כור באמצעות פיפטה.באמצעות מזרק של מיליליטר אחד המצויד במחט של 23 מדים, הפקידו את דיו העצם, הצליבו את מבני המיקרוג'ל של GelMA עמוסי העצמות עם מנורת UV crosslinker בגודל 405 ננומטר למשך 90 שניות. העבירו מיד את תרחיף המיקרוג'ל לצלחת באר בגודל מתאים המכילה DMEM שלם. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.החלף את מדיום התרבות לאחר 24 שעות, ולאחר מכן כל 48 עד 72 שעות לפי הצורך. דיו העצם נותח על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סורק כדי לקבוע את מבנה המיקרו שלו, שהראה היווצרות גביש הידרוקסיאפטיט לאחר הגדרת הדיו, הנראה במיוחד בתנאי יובש. במחקר זה, התאים עורבבו עם מיקרו-ג'לים של GelMA ונשמרו בתרבית למשך עד חמישה ימים, בין אם בתרחיף מיקרו-ג'ל בלבד או במערכת COBICS.התאים הראו כדאיות טובה בנוכחות דיו העצם, הן ביום הראשון והן ביום החמישי, ואישרו כי תוצרי ההחלקה של הדיו לא היו מזיקים לתאים. חשוב לשלוט במהירות המיקסריג תוך סינתזה של המיקרוג'ל, שכן שינוי קל בערבוב עלול לגרום להבדלי גודל. חשוב גם להבטיח הפצה הומוגנית של התאים בתוך השעיית מיקרוג'ל.ניתן להשתמש באותו פרוטוקול כדי להדפיס בתוך מתלי מיקרוג'ל מג'לטין, המשמשים כתמיכות הקרבה, ומותירים אחריהם מבני עצם עצמאיים. אבל השימוש ב-GelMA פותח את הדרך למבנים רב-פאזיים של סיר אחד, כמו ממשקי אוסטאוכונדרל או גיד עצם.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

דור של עור בעובי מלא תלת ממדי Equivalent ואוטומטי פציעה

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized בונה בעזרת רקמות ספציפיות הידרוג&#39;ל Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

מעבר צבע למתח שבב עבור מגרה בהתנהגויות הסלולר של הידרוג עמוסי תא

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

מודל calvarial של הגדלת עצם בארנב להערכת צמיחת העצם ונינובאסקולריזציה בחומרים החלפת עצם

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

רקמת הלבלב הנגזר מטריקס Bioink עבור הדפסת 3D Cell לאדן רקמות הלבלב בנייה

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

מדידת 3D In-vivo כתף Kinematics באמצעות Videoradiography Biplanar

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

הדפסה ביולוגית תלת-ממדית של אסטרוציטים קליפת המוח מורין לרקמה דמוית עצב הנדסית

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...