Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare il National Health and Medical Research Council (Grant no. GNT1111694 e GNT1141602) e l'Australian Research Council (Grant no. FT180100417, FL150100060 e CE14100036). Gli autori vorrebbero riconoscere la Biomedical Imaging Facility presso l'Università del New South Wales. Le figure sono state create con Biorender.com, Adobe Photoshop e Adobe Illustrator e sono state esportate con un abbonamento a pagamento.

1. Fabbricazione di inchiostro osseo
<ol><li>Sintesi del fosfato α-tricalcico<ol><li>Pesare le polveri di idrogeno fosfato di calcio (CaHPO4) e carbonato di calcio (CaCO 3) in un rapporto molare Ca:P di3:2. Usando una spatola, omogeneizzare accuratamente le due polveri.</li>
		<li>Aggiungere la miscela di polvere di calcio idrogeno fosfato-carbonato di calcio in un crogiolo di zirconia in modo che non sia pieno più del 75%. NOTA: Per evitare contaminazioni, utilizzare un nuov...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

La tecnica di stampa 3D COBICS è stata sviluppata per consentire la fabbricazione di strutture simili a ossa mineralizzate tramite estrusione in una sospensione di microgel reticolabile contenente cellule vive. La tecnica è stata applicata a una sospensione di microgel degradabile e le cellule mostrano una buona vitalità, diffusione e capacità di differenziazione osteogenica all'interno del sistema11. Un fattore determinante per il successo dei costrutti creati utilizzando questa tecnica è la...

L'osso ha notevoli capacità di rigenerazione come una delle poche strutture del corpo che può guarire ricreando la sua normale composizione cellulare, l'orientamento e la forza meccanica fino a una dimensione critica del difetto, quando la capacità di guarigione endogena è compromessa1. L'osso, insieme alla cartilagine e al legamento, supporta e facilita il movimento del corpo, immagazzinando anche minerali e grassi e producendo cellule del sangue. Come tessuto connettivo duro e denso, l'osso è composto principalmente da una fase inorganica, acqua e materiale organico composto principalmente da fibre di collagene2. Le cellule sono incorporate all'interno di questa matrice altamente mineralizzata di fibre di collagene I e cristalli di idrossiapatite (HA), formando una struttura gerarchica3.
La complessa organizzazione di questo tessuto rende eccezionalmenteimpegnativa la fabbricazione di alternative sintetiche per replicare i micro e nano-ambienti ossei eterogenei 3. A tale scopo, una varietà di materiali, tra cui bioceramiche, idrogel carichi di cellule e materiali sintetici sono stati proposti come soluzioni per creare matrici ossee. Tra le tecniche di fabbricazione degli scaffold sono recentemente emerse tecniche basate sulla stampa 3D che hanno ricevuto molta attenzione dalla comunità dell'ingegneria tissutale grazie alla loro notevole capacità di consentire la fabbricazione di strutture altamente sofisticate e precise con grandi promesse di trattamento specifico per il paziente 4,5,6 . Gli idrogel sono stati la scelta più popolare di imitazioni a matrice e bio-inchiostri poiché possono essere stampati insieme a cellule e molecole bioattive, generando costrutti funzionali6. Tuttavia, gli idrogel mancano delle proprietà funzionali dell'osso, come la resistenza meccanica e una fase altamente calcificata e inorganica contenente cellule metabolicamente attive.
Gli scaffold ceramici stampati in 3D richiedono in genere fasi di post-elaborazione, tra cui sinterizzazione, trattamenti ad alta temperatura o utilizzo di sostanze chimiche aggressive che devono essere accuratamente lavate prima delle applicazioni in vitro o in vivo 5. Per ovviare a queste limitazioni, Lode et al.7 hanno recentemente sviluppato una pasta a base di fosfato α-tricalcico formata da idrossiapatite, che può essere stampata e impostata in condizioni fisiologiche. Tuttavia, questo materiale non può ancora essere stampato insieme a cellule vive in quanto richiede un post-trattamento in un ambiente umido e la successiva immersione in soluzione acquosa per un lungo periodo.
In alternativa, sono stati proposti idrogel carichi di cellule con particelle inorganiche incorporate in sostituzione della matrice ossea 3D 8,9. Nonostante la loro grande capacità di supportare la vitalità cellulare, non sono in grado di ricapitolare l'ambiente densamente mineralizzato del tessuto osseo. Thrivikarman et al.10 hanno adottato un approccio biomimetico in cui è stato utilizzato un mezzo supersaturo di calcio e fosfato con un analogo proteico non collagenoso per imitare meglio la deposizione di apatite su scala nanometrica. Tuttavia, i loro costrutti non possono ancora generare costrutti 3D rigidi con un'architettura su micro e macro scala simile all'osso.
Il presente studio affronta queste carenze attraverso lo sviluppo di una strategia di stampa per fabbricare costrutti che imitano l'osso, in fasi inorganiche e organiche, che sono in grado di integrare sia le cellule che i fattori di crescita11. COBICS ricapitola in modo univoco la struttura minerale e cellulare dell'osso utilizzando una tecnica di bioprinting basata su microgel. Il protocollo qui descritto descrive il processo di sintesi dell'inchiostro ceramico e dei microgel a base di gelatina e quindi la combinazione di cellule che abilitano COBICS. Il processo inizia con la sintesi del principale materiale precursore dell'inchiostro osseo. L'idrogel reticolabile viene quindi sintetizzato e formato in microgel. Infine, l'inchiostro osseo viene depositato omnidirezionalmente in un bagno di supporto dei microgel carichi di cellule (Figura 1).
L'inchiostro osseo può essere stampato in qualsiasi sospensione di microgel che hanno le appropriate caratteristiche di snervamento, cioè la capacità di fluidizzare ad una specifica velocità di taglio e successivamente sostenere la struttura depositata. Sono stati dimostrati due approcci flessibili: una sospensione costituita da microgel di gelatina e una sospensione costituita da microgel di gelatina metacrilato (GelMA). La prima sospensione si dissolve quando la temperatura viene portata a 37 °C, l'incorporazione reversibile a forma libera di idrogel sospesi (FRESH) tecnica12, mentre la seconda può essere fotoreticolata dopo la stampa, "cucendo" efficacemente i microgel insieme e bloccando l'inchiostro osseo stampato in posizione. Il presente studio si concentra sull'utilizzo di GelMA come matrice in quanto offre il vantaggio unico di essere in grado di supportare la crescita cellulare con la stampa in situ di strutture mimetiche ossee complesse. In definitiva, questo approccio consente la generazione di modelli tissutali complessi con alti livelli di biomimetica e ampie implicazioni per la modellazione delle malattie, la scoperta di farmaci e l'ingegneria rigenerativa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> Figura 1: Schema del flusso di lavoro . (A) L'inchiostro osseo viene sintetizzato a partire dalla sintesi del fosfato α-tricalcico e dalla sua successiva combinazione con glicerolo, polisorbato 80 e fosfato di ammonio bibasico. (B) I microgel GelMA sono fabbricati con il metodo dell'emulsione acqua-in-olio. I microgel ottenuti sono quindi (C) idratati e (D) combinati con le cellule. I compositi di microgel cellulare vengono quindi utilizzati come bagno granulare in cui viene depositato l'inchiostro osseo. (E) L'intero costrutto viene quindi reticolato UV e trasferito all'incubatore per la cultura. Abbreviazioni: α-TCP = fosfato α-tricalcico; GelMA = metacrilato di gelatina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

Strutturalmente, il tessuto osseo è un composito inorganico-organico contenente cellule metabolicamente attive incorporate all'interno di una matrice gerarchica altamente mineralizzata. Questa organizzazione è difficile da replicare a causa dell'ambiente eterogeneo dell'osso. Il bioprinting omnidirezionale ceramico in sospensioni cellulari (COBICS) è una tecnica di bioprinting basata su microgel che replica in modo univoco la struttura minerale e cellulare dell'osso. COBICS stampa costrutti complessi e biologicamente rilevanti senza la necessità di materiali di supporto sacrificali o fasi di post-elaborazione difficili (ad esempio, radiazioni e sinterizzazione ad alta temperatura), che sono due delle maggiori sfide nella produzione additiva di costrutti mimetici ossei. Questa tecnica è resa possibile tramite l'estrusione a forma libera di un nuovo inchiostro a base di fosfato di calcio all'interno di una sospensione di microgel a base di gelatina. Le proprietà di tensione di snervamento della sospensione consentono la deposizione e supportano la struttura ossea stampata. La reticolazione UV e la nanoprecipitazione lo "bloccano" in posizione. La capacità di stampare ceramiche nanostrutturate osseo-mimetiche all'interno di biomateriali carichi di cellule fornisce un controllo spaziotemporale sulla macro e micro-architettura e facilita la fabbricazione in tempo reale di complessi costrutti ossei in contesti clinici.

COBICS stampa costrutti complessi e biologicamente rilevanti senza la necessità di materiali di supporto sacrificali o fasi di post-elaborazione difficili (ad esempio, radiazioni e sinterizzazione ad alta temperatura) che sono due delle maggiori sfide nella produzione additiva di costrutti mimetici ossei. Per dimostrare la formazione di COBICS di strutture ossee complesse e la co-stampa di cellule in sospensioni di microgel, sono state prese immagini rappresentative di compositi ossei fatti con l'inchiostro osseo ed è ...

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Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Questo protocollo descrive una tecnica di stampa 3D per fabbricare strutture simili all'osso depositando un inchiostro di fosfato di calcio in un supporto granulare a base di gelatina. Gli analoghi ossei stampati sono depositati in forma libera, con flessibilità per la raccolta diretta della stampa o la reticolazione all'interno di una matrice cellulare vivente per costrutti multifasici.

Bioprinting omnidirezionale ceramico in sospensioni caricate di cellule per la generazione di analoghi ossei

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Questo protocollo consente la fabbricazione di analoghi ossei senza richiedere riscaldamento o sostanze chimiche tossiche. In questo modo, si formano strutture ossee con il potenziale per riparare un difetto osseo in contesti clinici utilizzando le cellule di un paziente. Il vantaggio principale della tecnica è che l'inchiostro osseo può essere stampato con cellule viventi per formare qualsiasi struttura complessa simile all'osso e per dirigere la differenziazione verso il lignaggio di formazione ossea.Inoltre, i farmaci possono essere caricati nell'inchiostro osseo per migliorare contemporaneamente la guarigione delle ferite, la rigenerazione ossea e per trattare patologie come il cancro. A dimostrare la procedura saranno Gagan Jalandhra, un dottorando nel mio laboratorio, e la dottoressa Sara Romanazzo, che ha lavorato con me e la dottoressa Jalandhra su vari progetti, incluso lo sviluppo di questa tecnologia. Inizia aggiungendo la miscela di polvere di calcio idrogeno fosfato e carbonato di calcio a un crogiolo di zirconia in modo che non sia pieno più del 75%.Trasferire il crogiolo in una fornace, riscaldarlo a 1.400 gradi Celsius ad una velocità di cinque gradi Celsius al minuto e tenere premuto per tre ore. Estinguere la reazione rimuovendo il crogiolo dal forno e lasciandolo in cima al blocco refrattario. Lasciare raffreddare completamente prima di manipolarlo.Utilizzare un mortaio e un pestello per rompere e macinare la torta di fosfato alfa-tricalcico in modo che i granuli risultanti abbiano una dimensione massima di 200 micrometri. Aggiungere tre palline di zirconia stabilizzate all'ittrio millimetriche alla miscela macinata, seguite da etanolo al 100%. Chiudere il coperchio e macinare per due ore a 180 rotazioni al minuto.Raccogliere la sospensione e separare le palline, utilizzando etanolo al 100% per il lavaggio. Asciugare la sospensione in forno a 120 gradi Celsius per 24 ore. Aggiungere la polvere essiccata ai barattoli di macinazione con sfere di zirconia da un millimetro e etanolo al 100% negli stessi rapporti di peso del primo stadio.Macinare per due ore a 180 rotazioni al minuto. Quindi separare e asciugare nel forno. Togliere il campione dal forno.Per fare l'inchiostro all'osso, aggiungere 630 microlitri di glicerolo e 130 microlitri di polisorbato 80 in un barattolo di palline mil. Quindi aggiungere 100 milligrammi di fosfato bibasico di ammonio e due grammi di polvere di fosfato alfa-tricalcico alla soluzione e mescolare continuamente con una spatola per combinare. Aggiungere una sfera di zirconia da 25 millimetri, fissare il coperchio e posizionarlo all'interno di un mulino planetario per 60 minuti a 180 rotazioni al minuto, fermandosi a metà strada per raschiare i lati del barattolo con una spatola usando una spatola.Caricare l'inchiostro in una siringa da un millilitro. Preparare una soluzione al 10% di gelatina di tipo A in 1X PBS come descritto nel manoscritto testuale. Posizionare il matraccio conico sull'agitatore.Quindi aggiungere 5.796 millilitri di anidride metacrilica e continuare a mescolare al buio a 50 gradi Celsius per 90 minuti. Estinguere la reazione diluendo il contenuto dei palloni conici due volte con PBS. Decantare in tubi da 50 millilitri e rimuovere l'anidride metacrilica non reagita mediante centrifugazione a 3000 RCF a temperatura ambiente per tre minuti e raccogliendo il surnatante.Dializzare il surnatante all'interno di tubi di dialisi di cellulosa tagliati da 14 kilodalton contro acqua deionizzata a 40 gradi Celsius per cinque giorni mescolando delicatamente. Sostituire l'acqua deionizzata ogni giorno. Preparare per la conservazione travasando in tubi da 50 millilitri, fissando il tappo e mettendolo in frigorifero per 12 ore.Quindi congelare i campioni utilizzando azoto liquido e immediatamente liofilizzare per cinque giorni a meno 54 gradi Celsius e 0,4 millibar. Conservare la schiuma risultante in un congelatore a meno 20 gradi Celsius. Per sintetizzare i microgel GelMA, fare una soluzione di GelMA del 10% peso in peso in PBS pesando il GelMA liofilizzato, aggiungendolo a un tubo con PBS e riscaldandolo a bagnomaria a 50 gradi Celsius fino a completa idratazione.Aggiungere 37 millilitri di olio per un millilitro di soluzione GelMA a un becher, assicurandosi che non sia pieno più del 65%. Impostare un sistema a doppio becher su una piastra riscaldante con agitazione magnetica posizionando il becher contenente olio all'interno di un becher più grande. Riscaldare a 40 gradi Celsius mescolando.Caricare la soluzione di GelMA in una siringa e aggiungerla a goccia nell'olio di agitazione attraverso un filtro da 0,45 micrometri. Lasciare equilibrare l'emulsione per 10 minuti. Ridurre la temperatura dell'emulsione a 15 gradi Celsius a livello termico.Stabilizzare le sfere aggiungendo ghiaccio tritato nello spazio tra i due becher. Aggiungere acetone all'emulsione GelMA rotante. Decantare il contenuto del becher in tubi da 50 millilitri, assicurandosi di lavare le pareti del becher con acetone.Lasciate riposare per 20 minuti per permettere ai micro gel disidratati di depositarsi sul fondo. Scartare il surnatante e lavare i microgel due volte con acetone. Consolidare in un tubo, rabboccare con acetone e sonicare per 10 secondi.Ancora una volta, lavarlo con acetone due volte. Conservare in acetone a temperatura ambiente fino a quando necessario per la stampa. Per preparare la sospensione di microgel GelMA per la stampa, formulare una soluzione 1% peso/peso di GelMA in DMEM come descritto nel manoscritto testuale.Far evaporare l'acetone dai microgel disidratati e pesare la polvere risultante in un tubo. Aggiungere acetone e trasferire in un ambiente sterile. Per formare la sospensione di microgel, far evaporare l'acetone dalla polvere all'interno dell'armadio di biosicurezza.Dopo l'evaporazione, aggiungere DMEM, soluzione 1% GelMA in DMEM e 2,5% soluzione iniziatore LAP per ottenere una frazione finale di confezionamento del 30% Lasciare idratare completamente per almeno 12 ore a temperatura ambiente. Coltura delle cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo in DMEM a basso contenuto di glucosio integrate con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica fino a confluente. Rimuovere le cellule staminali mesenchimali di derivazione adiposa dal pallone di coltura tissutale rimuovendo il terreno e lavando con PBS sterile.Pellettare le celle centrifugando a 150 RCF a temperatura ambiente per cinque minuti. Contare le celle e calcolare almeno 5 x 10 alle cinque celle per ogni millilitro di microgel GelMA. Allocare il volume richiesto della sospensione cellulare a un tubo separato e pellet come dimostrato in precedenza.Rimuovere con attenzione quanto più surnatante possibile usando una pipetta, lasciando solo il pellet cellulare. Aggiungere il volume richiesto di sospensione di microgel al pellet e pipettare delicatamente su e giù per garantire una distribuzione uniforme. Caricare la sospensione di microgel carica di celle in un reattore usando una pipetta.Utilizzando una siringa da un millilitro dotata di un ago da 23 gauge, depositare l'inchiostro osseo, reticolare la cellula e i costrutti di microgel GelMA carichi di inchiostro osseo con una lampada reticolante UV a 405 nanometri per 90 secondi. Trasferire immediatamente la sospensione di microgel in una piastra del pozzetto di dimensioni appropriate contenente DMEM completo. Incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Sostituire il terreno di coltura dopo 24 ore, quindi ogni 48-72 ore secondo necessità. L'inchiostro osseo è stato analizzato mediante microscopia elettronica a scansione per determinare la sua microstruttura, che ha mostrato la formazione di cristalli di idrossiapatite dopo l'impostazione dell'inchiostro, particolarmente visibile in condizioni asciutte. In questo studio, le cellule sono state miscelate con microgel GelMA e mantenute in coltura per un massimo di cinque giorni, solo in sospensione di micro gel o nel sistema COBICS.Le cellule hanno mostrato una buona vitalità in presenza dell'inchiostro osseo, sia il primo giorno che il quinto giorno, confermando che i prodotti di lisciviazione dell'inchiostro non erano dannosi per le cellule. È fondamentale controllare la velocità dell'agitazione mentre sintetizza il microgel poiché un leggero cambiamento può causare differenze di dimensioni. È anche importante garantire una distribuzione omogenea delle cellule all'interno della sospensione di microgel.Lo stesso protocollo può essere utilizzato per stampare all'interno sospensioni di microgel di gelatina, che fungono da supporti sacrificali, lasciando dietro di sé costrutti ossei autonomi. Ma l'uso di GelMA apre la strada a costrutti multifasici di un piatto, come le interfacce osteocondrali o tendinee ossee.

Research

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