Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

著者らは、国立保健医療研究評議会(助成金番号GNT1111694およびGNT1141602)およびオーストラリア研究評議会(助成金番号FT180100417、FL150100060、およびCE14100036)に感謝したいと思います。著者らは、ニューサウスウェールズ大学の生物医学画像施設に感謝したいと思います。図は Biorender.com、Adobe Photoshop、Adobe Illustratorで作成され、有料サブスクリプションでエクスポートされています。

1. 骨墨加工
<ol><li>リン酸α-三カルシウムの合成<ol><li>リン酸水素カルシウム(CaHPO4)と炭酸カルシウム(CaCO3)粉末を3:2のCa:Pモル比で計量します。スパチュラを使用して、2つの粉末を完全に均質化します。</li>
		<li>リン酸水素カルシウム-炭酸カルシウム粉末混合物をジルコニアるつぼに、75%以下になるように加えます。 注意: 汚染を避けるために、新しいるつぼま...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

3D印刷技術COBICSは、生細胞を含む架橋可能なミクロゲル懸濁液への押し出しによる石灰化骨様構造の製造を可能にするために開発されました。この技術は、分解性ミクロゲル懸濁液に適用されており、細胞は、系11内で良好な生存率、拡散性、および骨形成分化能を示す。この手法を使用して作成されたコンストラクトの成功の重要な決定要因は、α-TCPベースのボーンインク...

骨は、内因性の治癒能力が損なわれる重大な欠陥サイズまで、正常な細胞組成、配向、および機械的強度を再現することによって治癒できる体内で数少ない構造の1つとして、顕著な再生能力を持っています1。骨は、軟骨や靭帯とともに、体の動きをサポートおよび促進すると同時に、ミネラルや脂肪を貯蔵し、血球を生成します。硬くて緻密な結合組織として、骨は主に無機相、水、およびコラーゲン線維を主成分とする有機材料で構成されています2。細胞は、コラーゲンI繊維とハイドロキシアパタイト(HA)結晶のこの高度にミネラル化されたマトリックス内に埋め込まれ、階層構造を形成します3。
この組織の複雑な構成は、不均一な骨のマイクロおよびナノ環境を再現するための合成代替物の製造を非常に困難にします3。この目的のために、バイオセラミックス、細胞を含んだヒドロゲル、合成材料など、さまざまな材料が骨マトリックスを作成するためのソリューションとして提案されています。足場製造技術の中で、3D印刷ベースの技術が最近登場し、患者固有の治療の大きな可能性を備えた高度に洗練された精密な構造の製造を可能にする優れた能力により、組織工学コミュニティから多くの注目を集めています4,5,6.ヒドロゲルは、細胞および生理活性分子と一緒に印刷して機能的構築物を生成することができるため、マトリックス模倣物およびバイオインクの最も一般的な選択肢である6。しかしながら、ヒドロゲルは、機械的強度および高度に石灰化された代謝活性細胞を含む無機相などの骨の機能的特性を欠いている。
3Dプリントされたセラミックスキャフォールドは通常、焼結、高温処理、またはin vitro または in vivo アプリケーションの前に徹底的に洗浄する必要がある過酷な化学物質の使用を含む後処理ステップを必要とします5。これらの制限に対処するために、Lodeら7 は最近、ハイドロキシアパタイトによって形成されたα-リン酸三カルシウムベースのペーストを開発し、生理学的条件下で印刷および設定することができます。ただし、この材料は、湿度の高い環境での後処理とそれに続く長期間の水溶液浸漬を必要とするため、生細胞と一緒に印刷することはできません。
あるいは、無機粒子が組み込まれた細胞を含んだヒドロゲルが、3D骨マトリックス8,9の代替物として提案されている。細胞の生存率をサポートする優れた能力にもかかわらず、高密度に石灰化した骨組織環境を再現することはできません。Thrivikarman et al.10は、ナノスケールのアパタイト堆積をよりよく模倣するために、過飽和カルシウムおよびリン酸媒体を非コラーゲン性タンパク質類似体と共に使用する生体模倣アプローチを採用した。しかし、それらの構造は、骨に似たミクロおよびマクロスケールのアーキテクチャを持つ剛性のある3D構造を生成することはできません。
本研究は、細胞と成長因子の両方を統合することができる無機相と有機相で骨模倣構造を製造するための印刷戦略の開発を通じて、これらの欠点に対処します11。COBICSは、ミクロゲルベースのバイオプリンティング技術を使用して、骨のミネラルおよび細胞構造を独自に再現します。本明細書のプロトコルは、セラミック骨インクおよびゼラチンベースのミクロゲルを合成し、次いでCOBICSを可能にする細胞を組み合わせるプロセスを記載する。このプロセスは、ボーンインクの主な前駆体材料の合成から始まります。次いで、架橋性ヒドロゲルを合成し、ミクロゲルに形成する。最後に、ボーンインクは、細胞を積んだミクロゲルの支持浴に全方向に堆積されます(図1)。
ボーンインクは、適切な降伏 - 応力特性、すなわち特定の剪断速度で流動化し、続いて堆積構造を支持する能力を有するミクロゲルの任意の懸濁液に印刷され得る。2つの柔軟なアプローチが実証されている:ゼラチンミクロゲルからなる懸濁液およびゼラチンメタクリレート(GelMA)ミクロゲルからなる懸濁液。前者の懸濁液は、温度が37°Cに上昇すると溶解し、懸濁ヒドロゲルの自由形状可逆包埋(FRESH)技術12であり、後者は印刷後に光架橋することができ、効果的に「ステッチ」して、印刷されたボーンインクを所定の位置にロックします。本研究では、複雑な骨模倣構造の in situ 印刷で細胞増殖をサポートできるという独自の利点を提供するため、GelMAをマトリックスとして使用することに焦点を当てています。最終的に、このアプローチにより、高レベルの生体模倣と疾患モデリング、創薬、再生工学に幅広い影響を与える複雑な組織モデルの生成が可能になります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> 図1:ワークフローの概略図。 (A)骨インクは、α-リン酸三カルシウムの合成とそれに続くグリセロール、ポリソルベート80、リン酸二アンモニウムとの併用から開始して合成されます。(B)GelMAミクロゲルは、油中水型エマルジョン法により作製される。得られたミクロゲルは、次いで、(C)水和され、(D)細胞と結合される。次に、セル-ミクロゲル複合材料は、骨インクが堆積する粒状浴として使用されます。(E)次いで、構築物全体をUV架橋し、培養のためにインキュベーターに移す。略語:α-TCP =α-リン酸三カルシウム;GelMA=ゼラチンメタクリレート。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

構造的には、骨組織は、階層的で高度に石灰化されたマトリックス内に埋め込まれた代謝活性細胞を含む無機-有機複合体です。この組織は、骨の不均一な環境のために複製することは困難です。細胞懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング(COBICS)は、骨のミネラルおよび細胞構造を独自に複製するミクロゲルベースのバイオプリンティング技術である。COBICSは、骨模倣コンストラクトの積層造形における最大の課題の2つである犠牲サポート材料や過酷な後処理ステップ(放射線や高温焼結など)を必要とせずに、複雑で生物学的に関連するコンストラクトを印刷します。この技術は、ゼラチンベースのミクロゲル懸濁液内の新規リン酸カルシウムベースのインクの自由形状押出によって可能になります。懸濁液の降伏応力特性は、沈着を可能にし、印刷された骨構造を支持する。UV架橋とナノ沈殿は、それを所定の位置に「ロック」します。細胞を含んだ生体材料内にナノ構造の骨模倣セラミックを印刷する機能は、マクロおよびミクロアーキテクチャの時空間制御を提供し、臨床現場での複雑な骨構造のリアルタイム製造を容易にします。

COBICSは、骨模倣コンストラクトの積層造形における最大の課題の2つである犠牲サポート材料や過酷な後処理ステップ(放射線や高温焼結など)を必要とせずに、複雑で生物学的に関連するコンストラクトをプリントします。複雑な骨構造のCOBICS形成とミクロゲル懸濁液中の細胞のコプリンティングを実証するために、骨インクで作られた骨様複合材料の代表的な画像を撮影し、COBICにおけるADSC?...

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Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

このプロトコルは、ゼラチンベースの顆粒支持体にリン酸カルシウムインクを堆積させることによって骨様構造を作製する3D印刷技術を説明する。印刷された骨類似体は自由形態で寄託され、多相構築物用の生細胞マトリックス内で印刷物を直接採取したり架橋したりするための柔軟性を備えています。

骨類似体の生成のための細胞内懸濁液中のセラミック全方向性バイオプリンティング

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

このプロトコルは、加熱または有毒化学物質を必要とせずに骨類似体の製造を可能にする。このようにして、患者自身の細胞を使用して臨床現場で骨欠損を修復する可能性のある骨構造が形成されます。この技術の主な利点は、骨インクを生細胞で印刷して、複雑な骨様構造を形成し、骨形成系統に分化させることができることです。さらに、薬物を骨インクに装填して、創傷治癒、骨再生を同時に増強し、癌などの病状を治療することができます。手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の候補者であるGagan Jalandhraと、この技術の開発を含むさまざまなプロジェクトで私とJalandhra博士と協力してきたSara Romanazzo博士です。リン酸水素カルシウムと炭酸カルシウム粉末の混合物をジルコニアるつぼに75%以下になるように添加することから始めます。るつぼを炉に移し、毎分5°Cの割合で1, 400°Cに加熱し、3時間保持します。るつぼを炉から取り出し、耐火物ブロックの上部に残して反応を急冷します。取り扱う前に完全に冷ましてください。乳鉢と乳棒を使用して、得られた顆粒の最大サイズが200マイクロメートルになるようにアルファリン酸三カルシウムケーキを破って粉砕します。粉砕混合物に3ミリメートルのイットリア安定化ジルコニアボールを加え、続いて100%エタノールを加えます。蓋をしっかり固定し、毎分180回転で2時間粉砕します。懸濁液を収集し、洗浄に100%エタノールを使用してボールを分離します。懸濁液を摂氏120度のオーブンで24時間乾燥させます。乾燥粉末を、1ミリメートルのジルコニアボールと100%エタノールを第1段階と同じ重量比で粉砕ジャーに加える。毎分180回転で2時間粉砕します。その後、分離してオーブンで乾かします。オーブンからサンプルを取り出します。骨インクを作るには、630マイクロリットルのグリセロールと130マイクロリットルのポリソルベート80をボールミルジャーに加えます。次に、100ミリグラムのリン酸二アンモニウムと2グラムのアルファ - リン酸三カルシウム粉末を溶液に加え、スパチュラで連続的に攪拌して混ぜ合わせます。25ミリメートルのジルコニアボールを追加し、蓋を固定し、毎分180回転で60分間遊星ミルの中に置き、ヘラを使用してヘラで瓶の側面をこすり落とすために途中で一時停止します。インクを1ミリリットルのシリンジに入れます。テキスト原稿に記載されているように、1X PBSでゼラチンタイプAの10%溶液を作ります。円錐形のフラスコをスターラーの上に置きます。次に、5.796ミリリットルの無水メタクリル酸塩を加え、摂氏50度の暗所で90分間攪拌を続けます。円錐フラスコ内容物をPBSで2倍に希釈して反応を消光する。50ミリリットルチューブにデカントし、室温で3分間、3000RCFで遠心分離することにより未反応のメタクリル酸無水物を除去し、上清を回収した。14キロダルトンカットオフセルロース透析チューブ内の上清を、穏やかに攪拌しながら、摂氏40度の脱イオン水に対して5日間透析します。脱イオン水を毎日交換してください。50ミリリットルのチューブにデカントし、キャップを固定して冷蔵庫に12時間入れて、保管の準備をします。次に、液体窒素を使用してサンプルを凍結し、すぐに摂氏マイナス54度、0.4ミリバールで5日間凍結乾燥します。得られた泡をマイナス20°Cの冷凍庫に保管します。GelMAミクロゲルを合成するには、凍結乾燥されたGelMAを秤量し、PBSを含むチューブに加え、完全に水和するまで摂氏50度の水浴中で加熱することにより、PBS中の10重量%のGelMA溶液を作ります。ビーカーにGelMA溶液1ミリリットルあたり37ミリリットルのオイルを加え、65%以下になるようにします。大きなビーカーの中に油を含むビーカーを入れて、磁気攪拌しながらホットプレートにダブルビーカーシステムをセットアップします。攪拌しながら摂氏40度に加熱する。GelMA溶液をシリンジに入れ、0.45マイクロメートルのフィルターを通して攪拌油に滴下します。エマルジョンを10分間平衡化させます。エマルジョンの温度を摂氏15度に下げて熱的にします。2つのビーカーの間のスペースに砕いた氷を追加して、球体を安定させます。紡糸GelMAエマルジョンにアセトンを加える。ビーカーの内容物を50ミリリットルのチューブにデカントし、ビーカーの壁をアセトンで洗ってください。脱水したマイクロゲルが底に沈殿するように20分間休ませます。上清を捨て、アセトンでミクロゲルを2回洗浄する。1本のチューブに統合し、アセトンを補充し、10秒間超音波処理します。繰り返しますが、アセトンで2回洗ってください。印刷が必要になるまで室温でアセトンで保管してください。印刷用のGelMAミクロゲル懸濁液を調製するために、テキスト原稿に記載されているようにDMEM中のGelMAの1重量%重量%溶液を処方する。脱水ミクロゲルからアセトンを蒸発させ、得られた粉末をチューブに秤量する。アセトンを加えて無菌環境に移します。ミクロゲル懸濁液を形成するには、バイオセーフティキャビネット内の粉末からアセトンを蒸発させます。蒸発後、DMEM、DMEM中の1%GelMA溶液、および2.5%LAP開始剤溶液を加えて、30%の最終充填率を達成し、室温で少なくとも12時間完全に水和させます。脂肪由来間葉系幹細胞を、10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した低グルコースDMEMで、摂氏37度と5%二酸化炭素でコンフルエントになるまで培養します。培地を除去し、滅菌PBSで洗浄することにより脂肪由来間葉系幹細胞を組織培養フラスコから取り出した。室温で150 RCFで5分間遠心分離することにより、細胞をペレット化します。細胞を数え、GelMAミクロゲルのミリリットルごとに少なくとも5 x 10から5つの細胞を計算します。前に示したように、必要量の細胞懸濁液を別のチューブとペレットに割り当てます。ピペットを使用してできるだけ多くの上清を慎重に取り除き、細胞ペレットのみを残します。必要量のミクロゲル懸濁液をペレットに加え、ゆっくりと上下にピペットで動かして、均一な分布を確保します。細胞を含んだミクロゲル懸濁液をピペットを用いて反応器に装填する。23ゲージの針を取り付けた1ミリリットルのシリンジを使用して、骨インクを堆積させ、細胞を架橋し、骨インクを含むGelMAミクロゲル構築物をUV架橋剤ランプで405ナノメートルで90秒間架橋します。直ちにミクロゲル懸濁液を、完全なDMEMを含む適切なサイズのウェルプレートに移します。摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。24時間後に培養液を交換し、必要に応じて48〜72時間ごとに交換します。骨インクを走査型電子顕微鏡で分析して微細構造を決定し、インク硬化後にハイドロキシアパタイト結晶の形成を示し、特に乾燥状態で可視でした。この研究では、細胞をGelMAミクロゲルと混合し、マイクロゲル懸濁液のみまたはCOBICSシステムのいずれかで最大5日間培養しました。細胞は、1日目と5日目の両方で骨インクの存在下で良好な生存率を示し、インクの浸出生成物が細胞に有害ではないことを確認しました。微妙な変化がサイズの違いを引き起こす可能性があるため、ミクロゲルを合成しながら攪拌速度を制御することが重要です。ミクロゲル懸濁液内の細胞の均一な分布を確保することも重要です。同じプロトコルを使用して、犠牲支持体として機能し、独立した骨構築物を残すゼラチンミクロゲル懸濁液の内部に印刷することができます。しかし、GelMAを使用すると、骨軟骨や骨腱の界面などのワンポット多相構造への道が開かれます。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting細胞化は、組織特異的ヒドロゲルBioinkを使用して構築します

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

細胞の表面のガイダンスとBioprintingための自動ロボット調剤技術

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

マイクロ流体工学バイオプリンティング血管組織や Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

軟骨と皮膚組織類縁ミキシング ユニット Bioink Precellularization の小説のパッシブ バイオプリンティング

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

骨置換材料における骨成長と新生血管の評価のためのウサギにおける骨増強の卵子モデル

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

ビプラナービデオラジオグラフィーを用いた3Dインビボショルダーキネマティクスの測定

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

ニューラル様組織の工学的なマウス皮質アストロサイトの3Dバイオプリンティング

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...