Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

저자는 국립 보건 및 의학 연구위원회 (보조금 번호. GNT1111694 및 GNT1141602) 및 호주 연구위원회 (보조금 번호. FT180100417, FL150100060 및 CE14100036). 저자는 뉴 사우스 웨일즈 대학의 생물 의학 이미징 시설을 인정하고자합니다. 피규어는 Biorender.com, 어도비 포토샵, 어도비 일러스트레이터로 제작되었으며 유료 구독으로 내보내졌습니다.

1. 뼈 잉크 제작
<ol><li>α-인산삼칼슘의 합성<ol><li>인산 수소 칼슘 (CaHPO4)과 탄산 칼슘 (CaCO 3) 분말을3 : 2 Ca:P 몰비로 계량합니다. 주걱을 사용하여 두 분말을 완전히 균질화하십시오.</li>
		<li>인산 수소 칼슘-탄산 칼슘 분말 혼합물을 지르코니아 도가니에 첨가하여 75 % 이하가되도록합니다. 알림: 오염을 방지하려면 새 도가니 또는 이전에 동일한 재료를 만드는 데 사...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

3D 프린팅 기술 COBICS는 압출을 통해 살아있는 세포를 포함하는 가교 결합 가능한 마이크로 겔 현탁액으로 광물화 된 뼈와 같은 구조를 제조 할 수 있도록 개발되었습니다. 상기 기술은 분해가능한 마이크로겔 현탁액에 적용되었고, 세포는 시스템(11) 내에서 양호한 생존력, 확산 및 골형성 분화 능력을 나타낸다. 이 기술을 사용하여 생성 된 구문의 성공을 결정하는 핵심 요소는 α...

뼈는 내인성 치유능력이 손상되었을 때 치명적인 결함 크기까지 정상적인 세포 구성, 방향 및 기계적 강도를 재현하여 치유할 수 있는 신체의 몇 안 되는 구조 중 하나로서 놀라운 재생 능력을 가지고 있습니다1. 뼈는 연골 및 인대와 함께 신체 움직임을 지원하고 촉진하는 동시에 미네랄과 지방을 저장하고 혈액 세포를 생성합니다. 단단하고 조밀 한 결합 조직으로서 뼈는 주로 무기상, 물 및 콜라겐 섬유로 주로 구성된 유기 물질로 구성됩니다2. 세포는 콜라겐 I 섬유와 수산화인회석(HA) 결정의 고도로 광물화된 매트릭스 내에 내장되어 계층적 구조3를 형성합니다.
이 조직의 복잡한 조직은 이질적인 뼈 마이크로 및 나노 환경을 복제하기 위한 합성 대안의 제조를 매우 어렵게 만듭니다3. 이를 위해 바이오 세라믹, 세포 함유 하이드로 겔 및 합성 재료를 포함한 다양한 재료가 뼈 매트릭스를 만드는 솔루션으로 제안되었습니다. 비계 제조 기술 중 3D 프린팅 기반 기술이 최근에 등장하여 환자 맞춤형 치료의 큰 가능성을 가진 매우 정교하고 정밀한 구조의 제조를 허용하는 놀라운 능력으로 인해 조직 공학 커뮤니티에서 많은 관심을 받았습니다.4,5,6 . 하이드로겔은 매트릭스 모조물 및 바이오잉크의 가장 인기 있는 선택이었으며, 이는 이들이 세포 및 생리활성 분자와 함께 인쇄되어 기능적 구축물6을 생성할 수 있기 때문이다. 그러나 하이드로겔은 기계적 강도와 대사 활성 세포를 포함하는 고도로 석회화된 무기상과 같은 뼈의 기능적 특성이 부족합니다.
3D 인쇄 된 세라믹 스캐 폴드는 일반적으로 소결, 고온 처리 또는 시험관 내 또는 생체 내 응용 프로그램 전에 철저히 세척해야하는 가혹한 화학 물질 사용을 포함한 후 처리 단계가 필요합니다5. 이러한 한계를 해결하기 위해 Lode et al.7 은 최근 생리적 조건에서 인쇄 및 설정할 수 있는 하이드록시아파타이트로 형성된 α-인산삼칼슘 기반 페이스트를 개발했습니다. 그러나 이 물질은 습한 환경에서 후처리가 필요하고 장기간 수용액에 담가야 하기 때문에 여전히 살아있는 세포와 함께 인쇄할 수 없습니다.
대안적으로, 무기 입자가 혼입된 세포 함유 하이드로겔이 3D 뼈 매트릭스 8,9의 대체물로서 제안되었다. 세포 생존력을 지원하는 뛰어난 능력에도 불구하고 조밀하게 광물화된 뼈 조직 환경을 요약할 수 없습니다. Thrivikarman et al.10은 나노 스케일 아파타이트 침착을 더 잘 모방하기 위해 비 콜라겐 단백질 유사체와 함께 과포화 칼슘 및 인산염 배지를 사용하는 생체 모방 접근법을 채택했다. 그러나 이들의 구조는 여전히 뼈대와 유사한 마이크로 및 매크로 스케일 아키텍처를 가진 견고한 3D 구조를 생성할 수 없습니다.
본 연구는 세포와 성장 인자11을 모두 통합 할 수있는 무기 및 유기 단계에서 뼈 모방 구조물을 제조하기위한 인쇄 전략의 개발을 통해 이러한 단점을 해결합니다. COBICS는 마이크로젤 기반 바이오프린팅 기술을 사용하여 뼈의 미네랄 및 세포 구조를 독특하게 요약합니다. 본원의 프로토콜은 세라믹 본-잉크 및 젤라틴-기반 마이크로겔을 합성하고, 이어서 COBICS를 가능하게 하는 세포를 조합하는 과정을 설명한다. 이 공정은 뼈 잉크의 주요 전구체 물질의 합성으로 시작됩니다. 그런 다음 가교성 하이드로겔을 합성하여 마이크로겔로 형성합니다. 마지막으로, 뼈 잉크는 세포가 담긴 마이크로젤의 지지 수조에 전방향으로 증착됩니다(그림 1).
본-잉크는 적절한 항복-응력 특성, 즉 특정 전단 속도에서 유동화하고 후속적으로 증착된 구조를 지지하는 능력을 갖는 마이크로겔의 임의의 현탁액에 인쇄될 수 있다. 두 가지 유연한 접근법이 입증되었습니다 : 젤라틴 마이크로 겔로 구성된 현탁액과 젤라틴 메타 크릴 레이트 (GelMA) 마이크로 겔로 구성된 현탁액. 전자의 현탁액은 온도가 37°C로 상승될 때, 부유된 하이드로겔의 자유형 가역적 임베딩(FRESH) 기술(12)에서 용해되는 반면, 후자는 인쇄 후에 광가교결합될 수 있고, 마이크로겔을 효과적으로 "스티칭"하고 인쇄된 뼈-잉크를 제자리에 고정시킬 수 있다. 본 연구는 복잡한 뼈 모방 구조의 현장 인쇄로 세포 성장을 지원할 수 있다는 독특한 이점을 제공하기 때문에 GelMA를 매트릭스로 사용하는 데 중점을 둡니다. 궁극적으로 이 접근 방식은 질병 모델링, 약물 발견 및 재생 공학에 대한 높은 수준의 생체 모방과 광범위한 영향을 가진 복잡한 조직 모델의 생성을 가능하게 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> 그림 1: 워크플로의 개략도 . (A) 뼈 잉크는 α-인산 삼칼슘 합성과 글리세롤, 폴리소르베이트 80 및 인산이염기성 암모늄과의 후속 조합에서 시작하여 합성됩니다. (B) GelMA 마이크로젤은 유중수 에멀젼 방법으로 제조됩니다. 수득 된 마이크로 겔은 (C) 수화되고 (D) 세포와 결합된다. 세포-마이크로겔 복합체는 뼈-잉크가 증착되는 과립 욕조로 사용됩니다. (E) 그런 다음 전체 구축물을 UV 가교하여 배양을 위해 인큐베이터로 옮깁니다. 약어 : α-TCP = α- 인산 삼 칼슘; 겔마 = 젤라틴 메타크릴레이트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

구조적으로 뼈 조직은 계층적이고 고도로 광물화된 매트릭스 내에 내장된 대사 활성 세포를 포함하는 무기-유기 복합체입니다. 이 조직은 뼈의 이질적인 환경으로 인해 복제하기가 어렵습니다. 세포 현탁액의 세라믹 전 방향 바이오 프린팅 (COBICS)은 뼈의 미네랄 및 세포 구조를 독특하게 복제하는 마이크로 젤 기반 바이오 프린팅 기술입니다. COBICS는 뼈 모방 구조물의 적층 제조에서 가장 큰 두 가지 과제인 희생 지지 재료나 가혹한 후처리 단계(예: 방사선 및 고온 소결)가 필요 없이 복잡하고 생물학적으로 관련된 구조물을 인쇄합니다. 이 기술은 젤라틴 기반 마이크로겔 현탁액 내에서 새로운 인산칼슘 기반 잉크의 자유형 압출을 통해 가능합니다. 현탁액의 항복 응력 특성은 증착을 허용하고 인쇄된 뼈 구조를 지지합니다. UV 가교 및 나노 침전은 제자리에 "고정"됩니다. 세포가 함유된 생체 재료 내에서 나노 구조의 뼈 모방 세라믹을 인쇄하는 기능은 거시적 및 미시적 아키텍처에 대한 시공간 제어를 제공하고 임상 환경에서 복잡한 뼈 구조의 실시간 제조를 용이하게 합니다.

COBICS는 뼈 모방 구조물의 적층 제조에서 가장 큰 두 가지 과제인 희생 지지 재료나 가혹한 후처리 단계(예: 방사선 및 고온 소결)가 필요 없이 복잡하고 생물학적으로 관련된 구조물을 인쇄합니다. 복잡한 뼈 구조의 COBICS 형성 및 마이크로 겔 현탁액에서 세포의 공동 인쇄를 입증하기 위해 뼈 잉크로 만든 뼈 모양의 복합체의 대표 이미지를 취하고 최대 7 일 동안 COBICS에서 ADSC 생존력의 반 정량 분?...

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Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

이 프로토콜은 젤라틴 기반 과립 지지체에 인산 칼슘 잉크를 증착하여 뼈와 같은 구조를 제조하는 3D 프린팅 기술을 설명합니다. 인쇄된 뼈 유사체는 다상 구축물을 위한 살아있는 세포 매트릭스 내에서 인쇄물의 직접 수확 또는 가교를 위한 유연성과 함께 자유 형태로 증착됩니다.

뼈 유사체 생성을 위한 세포 함유 현탁액의 세라믹 전방향 바이오프린팅

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

이 프로토콜을 사용하면 가열 또는 독성 화학 물질없이 뼈 유사체를 제조 할 수 있습니다. 이러한 방식으로 뼈 구조는 환자 자신의 세포를 사용하여 임상 환경에서 뼈 결함을 복구 할 수있는 가능성으로 형성됩니다. 이 기술의 주요 장점은 뼈 잉크를 살아있는 세포로 인쇄하여 복잡한 뼈와 같은 구조를 형성하고 뼈 형성 혈통으로 분화를 유도 할 수 있다는 것입니다.또한 약물을 뼈 잉크에 로드하여 상처 치유, 뼈 재생을 동시에 향상시키고 암과 같은 병리를 치료할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 박사 과정 후보자 인 Gagan Jalandhra와 저와 Jalandhra 박사와 함께이 기술의 개발을 포함한 다양한 프로젝트에서 일한 Sara Romanazzo 박사입니다. 인산 수소 칼슘과 탄산 칼슘 분말 혼합물을 지르코니아 도가니에 첨가하여 75 % 이하가되도록합니다.도가니를 용광로로 옮기고 분당 섭씨 5 도의 속도로 섭씨 1, 400도까지 가열하고 3 시간 동안 유지하십시오. 용광로에서 도가니를 제거하고 내화 블록의 상단에 남겨 두어 반응을 담금질하십시오. 취급하기 전에 완전히 식히십시오.박격포와 유봉을 사용하여 알파-인산 삼 칼슘 케이크를 깨고 갈아서 결과 과립의 최대 크기가 200 마이크로 미터가되도록합니다. 분쇄 된 혼합물에 3 밀리미터 이트리아 안정화 지르코니아 볼을 첨가 한 다음 100 % 에탄올을 첨가하십시오. 뚜껑을 단단히 닫고 분당 180 회전으로 2 시간 동안 분쇄하십시오.현탁액을 모으고 세척을 위해 100 % 에탄올을 사용하여 볼을 분리하십시오. 현탁액을 섭씨 120도의 오븐에서 24시간 동안 건조시킨다. 건조 된 분말을 1 밀리미터 지르코니아 볼과 100 % 에탄올로 분쇄 용기에 첫 번째 단계와 동일한 중량비로 첨가하십시오.분당 180 회전으로 2 시간 동안 분쇄하십시오. 그런 다음 오븐에서 분리하고 말리십시오. 오븐에서 샘플을 꺼냅니다.뼈 잉크를 만들려면 630 마이크로 리터의 글리세롤과 130 마이크로 리터의 폴리 소르 베이트 80을 볼 밀 병에 첨가하십시오. 그런 다음 이염 기성 인산 암모늄 100mg과 알파-인산 삼 칼슘 분말 2g을 용액에 넣고 주걱으로 계속 저어 결합합니다. 25mm 지르코니아 볼을 넣고 뚜껑을 단단히 고정하고 분당 180 회전으로 60 분 동안 유성 분쇄기에 넣고 중간에 멈춰 주걱을 사용하여 주걱으로 항아리의 측면을 긁어냅니다.1 밀리리터 주사기에 잉크를 넣으십시오. 텍스트 원고에 설명 된대로 1X PBS에서 젤라틴 유형 A의 10 % 용액을 만듭니다. 원뿔형 플라스크를 교반기에 놓습니다.그런 다음 5.796 밀리리터의 메타 크릴 산 무수물을 넣고 섭씨 50도에서 90 분 동안 어둠 속에서 계속 저어줍니다. 원뿔형 플라스크 내용물을 PBS로 2배 희석하여 반응을 켄칭한다. 50 밀리리터 튜브에 디캔트하고 실온에서 3000 RCF에서 3분 동안 원심분리하여 미반응 메타크릴산 무수물을 제거하고 상층액을 수집하였다.14 킬로달톤 컷오프 셀룰로스 투석관 내부의 상청액을 섭씨 40도에서 5일 동안 탈이온수에 대해 부드럽게 교반하면서 투석한다. 탈이온수를 매일 교체하십시오. 50 밀리리터 튜브로 디캔팅하고 캡을 고정하고 냉장고에 12 시간 동안 두어 보관할 준비를하십시오.그런 다음 액체 질소를 사용하여 샘플을 동결시키고 즉시 섭씨 영하 54도 및 0.4 밀리바에서 5 일 동안 동결 건조합니다. 생성 된 거품을 섭씨 영하 20 도의 냉동실에 보관하십시오. GelMA 마이크로젤을 합성하려면 동결건조된 GelMA의 무게를 측정하여 PBS에서 10중량%의 GelMA 용액을 만들고 PBS가 있는 튜브에 첨가하고 완전히 수화될 때까지 섭씨 50도의 수조에서 가열합니다.비커에 GelMA 용액 1밀리리터당 오일 37밀리리터를 추가하여 65%를 넘지 않도록 합니다. 더 큰 비커 내부에 오일이 포함된 비커를 배치하여 자석 교반이 가능한 핫 플레이트에 이중 비커 시스템을 설정합니다. 교반하면서 섭씨 40도까지 가열합니다.GelMA 용액을 주사기에 넣고 0.45 마이크로 미터 필터를 통해 교반 오일에 적가합니다. 에멀젼이 10 분 동안 평형을 이루도록하십시오. 에멀젼의 온도를 섭씨 15도까지 낮추어 열적으로 만듭니다.두 비커 사이의 공간에 분쇄 된 얼음을 추가하여 구를 안정화합니다. 방사하는 GelMA 에멀젼에 아세톤을 첨가하십시오. 비커의 내용물을 50 밀리리터 튜브에 넣고 비커의 벽을 아세톤으로 씻으십시오.탈수 된 마이크로 젤이 바닥에 정착 할 수 있도록 20 분 동안 그대로 두십시오. 상청액을 버리고 마이크로겔을 아세톤으로 두 번 세척한다. 하나의 튜브로 통합하고 아세톤으로 채우고 10 초 동안 초음파 처리합니다.다시 아세톤으로 두 번 씻으십시오. 인쇄에 필요할 때까지 실온에서 아세톤에 보관하십시오. 인쇄용 GelMA 마이크로겔 현탁액을 제조하기 위해, 텍스트 원고에 기재된 바와 같이 DMEM 중 GelMA의 1중량% 중량% 용액을 제형화한다.탈수 된 마이크로 겔에서 아세톤을 증발시키고 생성 된 분말을 튜브에 칭량합니다. 아세톤을 첨가하고 멸균 환경으로 옮깁니다. 마이크로겔 현탁액을 형성하려면 생물안전 캐비닛 내부의 분말에서 아세톤을 증발시킵니다.증발 후 DMEM, DMEM에 1%GelMA 용액 및 2.5%LAP 개시제 용액을 추가하여 30%의 최종 패킹 분율을 달성하여 실온에서 최소 12시간 동안 완전히 수화되도록 허용합니다. 지방 유래 중간엽 줄기세포를 합류할 때까지 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 10% FBS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 저혈당 DMEM에서 배양합니다. 지방유래 중간엽 줄기세포를 배지를 제거하고 멸균 PBS로 세척하여 조직배양 플라스크로부터 제거하였다.실온에서 150 RCF에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화한다. 세포를 세고 GelMA 마이크로젤의 각 밀리리터에 대해 5개의 세포에 대해 최소 5 x 10을 계산합니다. 필요한 부피의 세포 현탁액을 앞에서 설명한 대로 별도의 튜브와 펠릿에 할당합니다.피펫을 사용하여 가능한 한 많은 상청액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿 만 남겨 둡니다. 필요한 양의 마이크로젤 현탁액을 펠릿에 추가하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 균일한 분포를 보장합니다. 마이크로겔 현탁액에 담긴 세포를 피펫을 사용하여 반응기에 넣습니다.23 게이지 바늘이 장착 된 1 밀리리터 주사기를 사용하여 뼈 잉크를 증착하고 셀 및 뼈 잉크가 함유 된 GelMA 마이크로 겔 구조물을 405 나노 미터의 UV 가교 링커 램프로 90 초 동안 가교 결합시킵니다. 마이크로겔 현탁액을 완전한 DMEM을 포함하는 적절한 크기의 웰 플레이트로 즉시 옮깁니다. 섭씨 37도 및 5 % 이산화탄소에서 배양하십시오.배양 배지를 24시간 후에 교체한 다음, 필요에 따라 48 내지 72시간마다 교체한다. 뼈-잉크는 주사 전자 현미경으로 분석하여 미세 구조를 결정했으며, 이는 잉크 경화 후 수산화 인회석 결정의 형성을 보여 주었으며, 특히 건조한 조건에서 볼 수 있습니다. 이 연구에서 세포를 GelMA 마이크로 젤과 혼합하고 마이크로 겔 현탁액 만 또는 COBICS 시스템에서 최대 5 일 동안 배양 물에 보관했습니다.세포는 1 일과 5 일 모두 뼈 잉크가있는 상태에서 양호한 생존력을 보여 잉크의 침출 생성물이 세포에 해롭지 않다는 것을 확인했다. 교반 속도를 조절하는 것이 중요하며, 마이크로겔을 합성하는 것은 약간의 변화로 교반하면 크기 차이가 발생할 수 있기 때문입니다. 마이크로겔 현탁액 내에서 세포의 균질한 분포를 보장하는 것도 중요합니다.동일한 프로토콜을 사용하여 젤라틴 마이크로겔 현탁액 내부를 인쇄할 수 있으며, 이는 희생 지지체 역할을 하여 독립형 뼈 구조를 남깁니다. 그러나 GelMA를 사용하면 골 연골 또는 뼈 힘줄 인터페이스와 같은 하나의 냄비 다상 구조를위한 길을 열 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

연구

생체공학

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized는 조직 고유의 하이드로 겔 Bioink를 사용하여 구축

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

그라데이션 변형 칩 셀 라덴 히드로에 자극 세포 행동에 대 한

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

세포의 표면지도 및 Bioprinting에 대한 자동화 된 로봇 분배 기법

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

공학에 대 한 미세 Bioprinting 나가도록 조직 및 Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

연골과 피부 조직 아날로그 소설 수동 Bioink Precellularization에 대 한 단위 기술 혼합을 이용 하 여 Bioprinting

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

인쇄 3D 세포 -라덴 췌장 조직 구성을 인쇄를위한 췌장 조직 유래 세포 외 매트릭스 바이오 잉크

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

바이플러나 비디오 방사선 촬영을 사용하여 3D 생체 내 어깨 운동학 측정

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

신경과 같은 조직을 위한 Murine 피질 성상 세포의 3D 생물 인쇄

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...