Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Forfatterne ønsker å anerkjenne National Health and Medical Research Council (Grant nr. GNT1111694 og GNT1141602) og Australian Research Council (Grant nr. FT180100417, FL150100060 og CE14100036). Forfatterne ønsker å anerkjenne Biomedical Imaging Facility ved University of New South Wales. Figurene ble opprettet med Biorender.com, Adobe Photoshop og Adobe Illustrator og har blitt eksportert under et betalt abonnement.

1. Produksjon av beinblekk
<ol><li>Syntese av α-tricalciumfosfat<ol><li>Vei ut kalsiumhydrogenfosfat (CaHPO4) og kalsiumkarbonat (CaCO 3) pulver i et3: 2 Ca: P molforhold. Bruk en slikkepott, homogeniser de to pulverene grundig.</li>
		<li>Tilsett kalsiumhydrogenfosfat-kalsiumkarbonatpulverblandingen til en zirkoniumdigel slik at den ikke er mer enn 75% full. MERK: For å unngå forurensning, bruk en ny smeltedigel eller en smeltedigel som tidligere ble brukt til å lage det s...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

3D-utskriftsteknikken COBICS ble utviklet for å muliggjøre fremstilling av mineraliserte beinlignende strukturer via ekstrudering til en tverrbindingsbar mikrogelsuspensjon som inneholder levende celler. Teknikken har blitt brukt på en nedbrytbar mikrogelsuspensjon, og celler viser god levedyktighet, spredning og osteogen differensieringsevne i systemet11. En viktig determinant for suksessen til konstruksjoner opprettet ved hjelp av denne teknikken er riktig syntese av α-TCP-basert beinblekk. ...

Ben har bemerkelsesverdige regenereringsevner som en av de få strukturer i kroppen som kan helbrede ved å gjenskape sin normale cellulære sammensetning, orientering og mekaniske styrke frem til en kritisk defektstørrelse, når endogen helbredelseskapasitet er kompromittert1. Ben, sammen med brusk og leddbånd, støtter og letter kroppsbevegelse, samtidig som det lagrer mineraler og fett og produserer blodceller. Som et hardt, tett bindevev består bein hovedsakelig av en uorganisk fase, vann og organisk materiale som hovedsakelig består av kollagenfibre2. Celler er innebygd i denne svært mineraliserte matrisen av kollagen I-fibre og hydroksyapatitt (HA) krystaller, og danner en hierarkisk struktur3.
Den komplekse organiseringen av dette vevet gjør fremstillingen av syntetiske alternativer for å replikere de heterogene beinmikro- og nanomiljøene eksepsjonelt utfordrende3. Til dette formål har en rekke materialer, inkludert biokeramikk, cellebelastede hydrogeler og syntetiske materialer blitt foreslått som løsninger for å lage beinmatriser. Blant stillasfabrikasjonsteknikkene har 3D-utskriftsbaserte teknikker nylig dukket opp og fått mye oppmerksomhet fra vevsteknikkmiljøet på grunn av deres bemerkelsesverdige evne til å tillate fabrikasjon av svært sofistikerte og presise strukturer med stort løfte om pasientspesifikk behandling 4,5,6 . Hydrogeler har vært det mest populære valget av matrisehermere og bioblekk siden de kan skrives ut sammen med celler og bioaktive molekyler, og genererer funksjonelle konstruksjoner6. Hydrogeler mangler imidlertid de funksjonelle egenskapene til bein, som mekanisk styrke og en svært forkalket, uorganisk fase som inneholder metabolsk aktive celler.
3D-printede keramiske stillaser krever vanligvis etterbehandlingstrinn, inkludert sintring, høytemperaturbehandlinger eller bruk av sterke kjemikalier som må vaskes grundig før in vitro eller in vivo applikasjoner5. For å løse disse begrensningene utviklet Lode et al.7 nylig en α-tricalciumfosfatbasert pasta dannet av hydroksyapatitt, som kan skrives ut og settes under fysiologiske forhold. Dette materialet kan imidlertid fortsatt ikke skrives ut sammen med levende celler, da det krever etterbehandling i et fuktig miljø og påfølgende vandig løsning nedsenking i lang tid.
Alternativt har cellebelastede hydrogeler med uorganiske partikler innlemmet blitt foreslått som erstatning for 3D benmatrise 8,9. Til tross for deres store evne til å støtte cellens levedyktighet, er de ikke i stand til å rekapitulere det tett mineraliserte beinvevsmiljøet. Thrivikarman et al.10 vedtok en biomimetisk tilnærming der et overmettet kalsium- og fosfatmedium ble brukt med en ikke-kollagenøs proteinanalog for bedre å etterligne nanoskala apatittavsetningen. Imidlertid kan konstruksjonene deres fortsatt ikke generere stive 3D-konstruksjoner med mikro- og makroskala arkitektur som ligner bein.
Denne studien adresserer disse manglene gjennom utvikling av en utskriftsstrategi for å fremstille beinlignende konstruksjoner, i uorganiske og organiske faser, som er i stand til å integrere både celler og vekstfaktorer11. COBICS rekapitulerer unikt mineral- og cellestrukturen i bein ved hjelp av en mikrogelbasert bioprintingsteknikk. Protokollen her beskriver prosessen med å syntetisere keramiske beinblekk og gelatinbaserte mikrogeler og deretter kombinere celler som muliggjør COBICS. Prosessen begynner med syntesen av det viktigste forløpermaterialet til beinblekket. Den tverrbundne hydrogelen syntetiseres deretter og dannes til mikrogeler. Til slutt avsettes beinblekket omnidireksjonelt i et støttebad av mikrogelene lastet med celler (figur 1).
Benblekket kan skrives ut i en hvilken som helst suspensjon av mikrogeler som har de riktige utbyttespenningsegenskapene, det vil si evnen til å fluidisere ved en bestemt skjærhastighet og deretter støtte den avsatte strukturen. To fleksible tilnærminger har blitt demonstrert: en suspensjon bestående av gelatinmikrogeler og en suspensjon bestående av gelatinmetakrylat (GelMA) mikrogeler. Den førstnevnte suspensjonen oppløses når temperaturen heves til 37 °C, den reversible innebyggingen av suspenderte hydrogeler (FRESH) teknikk12, mens sistnevnte kan fotokrysbindes etter utskrift, effektivt "sy" mikrogelene sammen og låse det trykte beinblekket på plass. Denne studien fokuserer på å bruke GelMA som matrise, da den gir den unike fordelen av å kunne støtte cellevekst med in situ-utskrift av komplekse benmimetiske strukturer. Til syvende og sist muliggjør denne tilnærmingen generering av komplekse vevsmodeller med høye nivåer av biomimicry og brede implikasjoner for sykdomsmodellering, narkotikaforskning og regenerativ engineering.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk for arbeidsflyten . (A) Benblekket syntetiseres fra α-tricalciumfosfatsyntese og dets påfølgende kombinasjon med glyserol, polysorbat 80 og ammoniumfosfatdibasisk. (B) GelMA-mikrogeler fremstilles ved vann-i-olje-emulsjonsmetoden. De oppnådde mikrogelene blir deretter (C) hydrert og (D) kombinert med celler. Celle-mikrogelkompositter brukes deretter som et granulært bad der beinblekket blir avsatt. (E) Hele konstruksjonen blir deretter UV-tverrbundet og overført til inkubatoren for kultur. Forkortelser: α-TCP = α-tricalciumfosfat; GelMA = gelatinmetakrylat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

Strukturelt er beinvev en uorganisk-organisk kompositt som inneholder metabolsk aktive celler innebygd i en hierarkisk, høyt mineralisert matrise. Denne organisasjonen er utfordrende å replikere på grunn av det heterogene miljøet av bein. Keramisk omnidireksjonell bioprinting i cellesuspensjoner (COBICS) er en mikrogelbasert bioprintingsteknikk som unikt replikerer mineral- og cellestrukturen i bein. COBICS skriver ut komplekse, biologisk relevante konstruksjoner uten behov for offerstøttematerialer eller harde etterbehandlingstrinn (f.eks. stråling og høytemperatur sintring), som er to av de største utfordringene i additiv produksjon av benmimetiske konstruksjoner. Denne teknikken er aktivert via friformekstrudering av et nytt kalsiumfosfatbasert blekk i en gelatinbasert mikrogelsuspensjon. Suspensjonens utbyttespenningsegenskaper tillater avsetning og støtte den trykte beinstrukturen. UV-tverrbinding og nanoprecipitation "låser" den deretter på plass. Evnen til å skrive ut nanostrukturert bein-mimetisk keramikk i cellebelastede biomaterialer gir spatiotemporal kontroll over makro- og mikroarkitektur og letter sanntidsfabrikasjon av komplekse beinkonstruksjoner i kliniske omgivelser.

COBICS skriver ut komplekse, biologisk relevante konstruksjoner uten behov for offerstøttematerialer eller harde etterbehandlingstrinn (f.eks. stråling og høytemperatur sintring) som er to av de største utfordringene i additiv produksjon av benmimetiske konstruksjoner. For å demonstrere COBICS-dannelse av komplekse beinstrukturer og samtidig utskrift av celler i mikrogelsuspensjoner, ble det tatt representative bilder av beinlignende kompositter laget av beinblekk, og en semikvantitativ analyse av ADSC-levedyktighet...

Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Denne protokollen beskriver en 3D-utskriftsteknikk for å fremstille beinlignende strukturer ved å deponere et kalsiumfosfatblekk i en gelatinbasert granulær støtte. Trykte beinanaloger deponeres i friform, med fleksibilitet for direkte høsting av utskriften eller tverrbinding i en levende cellematrise for multifasiske konstruksjoner.

Keramisk omnidireksjonell bioprinting i cellebelastede suspensjoner for generering av beinanaloger

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Denne protokollen tillater fabrikasjon av beinanaloger uten å kreve oppvarming eller giftige kjemikalier. På denne måten dannes beinstrukturer med potensial for å reparere en beindefekt i kliniske omgivelser ved hjelp av pasientens egne celler. Den største fordelen med teknikken er at beinblekket kan skrives ut med levende celler for å danne en kompleks beinlignende struktur og for å rette differensiering mot beindannende avstamning.Videre kan medisiner lastes inn i beinblekket for samtidig å forbedre sårheling, beinregenerering og å behandle patologier som kreft. Demonstrere prosedyren vil være Gagan Jalandhra, en ph.d.-kandidat i laboratoriet mitt, og Dr.Sara Romanazzo, som har jobbet med meg og Dr.Jalandhra på ulike prosjekter, inkludert utvikling av denne teknologien. Begynn med å tilsette kalsiumhydrogenfosfat- og kalsiumkarbonatpulverblandingen til en zirkoniumdigel slik at den ikke er mer enn 75% full.Overfør smeltedigelen til en ovn, varm den til 1.400 grader Celsius med en hastighet på fem grader Celsius per minutt og hold i tre timer. Slukk reaksjonen ved å fjerne smeltedigelen fra ovnen og forlate på toppen av ildfast blokk. La den avkjøles helt før håndtering.Bruk en mørtel og pistill for å bryte og male alfa-tricalciumfosfatkaken slik at de resulterende granulatene har en maksimal størrelse på 200 mikrometer. Tilsett tre millimeter yttria-stabiliserte zirkoniumkuler til den slipte blandingen, etterfulgt av 100% etanol. Fest lokket og slip i to timer med 180 rotasjoner per minutt.Samle suspensjonen og skill ballene, bruk 100% etanol til vask. Tørk suspensjonen i en ovn ved 120 grader Celsius i 24 timer. Tilsett det tørkede pulveret i freseglassene med en millimeter zirkoniumkuler og 100% etanol i samme vektforhold som i første trinn.Slip i to timer med 180 rotasjoner per minutt. Deretter skilles og tørkes i ovnen. Fjern prøven fra ovnen.For å lage bein-blekk, tilsett 630 mikroliter glyserol og 130 mikroliter polysorbat 80 til en ball mil krukke. Tilsett deretter 100 milligram ammoniumfosfatdibasisk og to gram alfa-tricalciumfosfatpulver til løsningen og rør kontinuerlig med en slikkepott for å kombinere. Legg til en 25 millimeter zirkoniumkule, fest lokket og plasser det inne i en planetmølle i 60 minutter ved 180 rotasjoner per minutt, og ta en pause halvveis for å skrape ned sidene av krukken med en slikkepott ved hjelp av en slikkepott.Legg blekket i en milliliter sprøyte. Lag en 10% løsning av gelatin type A i 1X PBS som beskrevet i tekstmanuskriptet. Plasser den koniske kolben på omrøreren.Tilsett deretter 5.796 ml metakrylanhydrid og fortsett å røre i mørket ved 50 grader Celsius i 90 minutter. Slukk reaksjonen ved å fortynne det koniske kolbeinnholdet to ganger med PBS. Decant i 50 milliliter rør og fjern det uomsatte metakrylanhydridet ved sentrifugering ved 3000 RCF ved romtemperatur i tre minutter og oppsamling av supernatanten.Dialyser supernatanten inne i 14 kilodalton cutoff cellulosedialyserør mot avionisert vann ved 40 grader Celsius i fem dager mens du forsiktig rører. Bytt ut det avioniserte vannet hver dag. Forbered deg på lagring ved å dekantere i 50 milliliter rør, sikre hetten og plassere den i kjøleskapet i 12 timer.Frys deretter prøvene ved hjelp av flytende nitrogen og lyofiliser umiddelbart i fem dager ved minus 54 grader Celsius og 0,4 millibar. Oppbevar det resulterende skummet i en fryser ved minus 20 grader Celsius. For å syntetisere GelMA-mikrogeler, lag en 10% vekt etter vekt GelMA-løsning i PBS ved å veie den lyofiliserte GelMA, legge den til et rør med PBS og varme opp i et vannbad ved 50 grader Celsius til den er fullt hydrert.Tilsett 37 milliliter olje per milliliter GelMA-løsning til et beger, slik at det ikke er mer enn 65% fullt. Sett opp et dobbelt begersystem på en kokeplate med magnetisk omrøring ved å plassere begeret som inneholder olje inne i et større beger. Varm opp til 40 grader Celsius under omrøring.Legg GelMA-oppløsningen i en sprøyte og tilsett den dråpevis i omrøringsoljen gjennom et filter på 0,45 mikrometer. La emulsjonen balansere i 10 minutter. Reduser temperaturen på emulsjonen til 15 grader Celsius til termisk.Stabiliser kulene ved å legge knust is inn i rommet mellom de to begerene. Tilsett aceton til den spinnende GelMA-emulsjonen. Decant innholdet i begeret i 50 milliliter rør, sørg for å vaske veggene i begeret med aceton.La det hvile i 20 minutter for å la de dehydrerte mikrogelene slå seg ned til bunnen. Kast supernatanten og vask mikrogelene to ganger med aceton. Konsolider i ett rør, fyll opp med aceton og sonikere i 10 sekunder.Igjen, vask det med aceton to ganger. Oppbevares i aceton ved romtemperatur til det er nødvendig for utskrift. For å klargjøre GelMA-mikrogelsuspensjonen for utskrift, formuler du en 1 vekt% vektløsning av GelMA i DMEM som beskrevet i tekstmanuskriptet.Fordamp acetonet fra dehydrerte mikrogeler og vei det resulterende pulveret inn i et rør. Tilsett aceton og overfør til et sterilt miljø. For å danne mikrogelsuspensjonen, fordamp acetonet fra pulveret inne i biosikkerhetsskapet.Etter fordampning, tilsett DMEM, 1% GelMA-løsning i DMEM og 2,5% LAP initiatorløsning for å oppnå en endelig pakningsfraksjon på 30% La den hydreres fullstendig i minst 12 timer ved romtemperatur. Kultur de fettavledede mesenkymale stamceller i lav glukose DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid til sammenløpende. Fjern de fettavledede mesenkymale stamcellene fra vevskulturkolben ved å fjerne mediet og vaske med steril PBS.Pellet cellene ved sentrifuging ved 150 RCF ved romtemperatur i fem minutter. Tell cellene og beregn minst 5 x 10 til de fem cellene for hver milliliter GelMA-mikrogeler. Allokere det nødvendige volumet av cellesuspensjonen til et separat rør og pellet som vist tidligere.Fjern forsiktig så mye supernatant som mulig ved hjelp av en pipette, og la bare cellepelleten være. Tilsett det nødvendige volumet av mikrogelsuspensjon til pelleten og forsiktig pipetter opp og ned for å sikre jevn fordeling. Legg cellebelastet i mikrogelsuspensjon i en reaktor ved hjelp av en pipette.Ved hjelp av en milliliter sprøyte utstyrt med en 23 gauge nål, sett inn bein-blekk, tverrbinding cellen og bein-blekk laden GelMA mikrogel konstruerer med en UV tverrbindingslampe på 405 nanometer i 90 sekunder. Overfør umiddelbart mikrogelsuspensjonen til en passende størrelse brønnplate som inneholder komplett DMEM. Inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Bytt ut kulturmediet etter 24 timer, deretter hver 48 til 72 timer etter behov. Benblekket ble analysert ved å skanne elektronmikroskopi for å bestemme mikrostrukturen, som viste dannelsen av hydroksyapatittkrystall etter blekkinnstilling, spesielt synlig under tørre forhold. I denne studien ble celler blandet med GelMA-mikrogeler og holdt i kultur i opptil fem dager, enten bare i mikrogelsuspensjon eller i COBICS-systemet.Cellene viste god levedyktighet i nærvær av beinblekk, både på dag én og dag fem, og bekreftet at utvaskingsproduktene til blekket ikke var skadelige for cellene. Det er avgjørende å kontrollere omrøringshastigheten mens du syntetiserer mikrogel, da en liten endring i omrøring kan forårsake størrelsesforskjeller. Det er også viktig å sikre homogen fordeling av cellene i mikrogelsuspensjonen.Den samme protokollen kan brukes til å skrive ut inne i gelatinmikrogelsuspensjoner, som fungerer som offerstøtter, og etterlater frittstående beinkonstruksjoner. Men ved hjelp av GelMA åpner veien for en pott multifasiske konstruksjoner, for eksempel osteokondral eller bein sene grensesnitt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av en Tredimensjonal Full Tykkelse hudekvivalent og Automated såret

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstruerer Ved hjelp av en Tissue-spesifikke hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradient belastning Chip for stimulerende cellulære atferd i celle-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Automatisert Robotic Leveringen Teknikk for Surface Veiledning og Bioprinting Celler

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Bioprinting for utvikling Stangeriaceae vev og Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting brusk og huden vev Analogs utnytte en roman passiv miksing enhet teknikk for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Calvarial modell av Ben styrking i kanin for vurdering av Bone vekst og Neovascularization i Bone substitusjon materialer

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Bukspyttkjertelen tissue-avledet ekstracellulære Matrix Bioink for utskrift 3D Cell-Laden bukspyttkjertelen vev konstruksjoner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Måling av 3D In-vivo skulderkinematikk ved hjelp av biplanet videoradiografi

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting av Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Lignende Vev

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...