Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer ao Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (Grant no. GNT1111694 e GNT1141602) e ao Australian Research Council (Grant no. FT180100417, FL150100060 e CE14100036). Os autores gostariam de agradecer o Biomedical Imaging Facility da Universidade de Nova Gales do Sul. As figuras foram criadas com Biorender.com, Adobe Photoshop e Adobe Illustrator e foram exportadas sob uma assinatura paga.

1. Fabricação de tinta de osso
<ol><li>Síntese de fosfato α-tricálcico<ol><li>Pesar os pós de hidrogenofosfato de cálcio (CaHPO4) e carbonato de cálcio (CaCO 3) numa proporção molar de Ca:P de3:2. Usando uma espátula, homogeneize completamente os dois pós.</li>
		<li>Adicione a mistura de hidrogenofosfato de cálcio e carbonato de cálcio em pó a um cadinho de zircônia de modo que não esteja mais do que 75% cheio. NOTA: Para evitar a contaminação, utilizar um c...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

A técnica de impressão 3D COBICS foi desenvolvida para permitir a fabricação de estruturas mineralizadas semelhantes a ossos por extrusão em uma suspensão de microgel reticulável contendo células vivas. A técnica tem sido aplicada a uma suspensão de microgel degradável, e as células apresentam boa viabilidade, disseminação e capacidade de diferenciação osteogênica dentro do sistema11. Um determinante chave do sucesso de construções criadas usando essa técnica é a síntese adeq...

O osso tem notáveis habilidades de regeneração como uma das poucas estruturas do corpo que podem cicatrizar recriando sua composição celular normal, orientação e força mecânica até um tamanho de defeito crítico, quando a capacidade de cicatrização endógena é comprometida1. O osso, juntamente com a cartilagem e o ligamento, suporta e facilita o movimento do corpo, além de armazenar minerais e gorduras e produzir células sanguíneas. Como um tecido conjuntivo duro e denso, o osso é composto principalmente de uma fase inorgânica, água e material orgânico composto principalmente de fibras colágenas2. As células estão embutidas dentro dessa matriz altamente mineralizada de fibras colágenas I e cristais de hidroxiapatita (HA), formando uma estrutura hierárquica3.
A complexa organização desse tecido torna a fabricação de alternativas sintéticas para replicar os heterogêneos micro e nanoambientes ósseos excepcionalmente desafiadores3. Para este propósito, uma variedade de materiais, incluindo biocerâmica, hidrogéis carregados de células e materiais sintéticos foram propostos como soluções para criar matrizes ósseas. Entre as técnicas de fabricação de andaimes, as técnicas baseadas em impressão 3D surgiram recentemente e receberam muita atenção da comunidade de engenharia de tecidos devido à sua notável capacidade de permitir a fabricação de estruturas altamente sofisticadas e precisas com grande promessa de tratamento específico do paciente 4,5,6 . Os hidrogéis têm sido a escolha mais popular de mímicos de matriz e biotintas, uma vez que podem ser impressos em conjunto com células e moléculas bioativas, gerando construtos funcionais6. No entanto, os hidrogéis não possuem as propriedades funcionais do osso, como resistência mecânica e uma fase inorgânica altamente calcificada contendo células metabolicamente ativas.
Os andaimes cerâmicos impressos em 3D normalmente requerem etapas de pós-processamento, incluindo sinterização, tratamentos a alta temperatura ou o uso de produtos químicos agressivos que devem ser cuidadosamente lavados antes de aplicações in vitro ou in vivo 5. Para abordar essas limitações, Lode et al.7 desenvolveram recentemente uma pasta à base de fosfato α-tricálcico formada por hidroxiapatita, que pode ser impressa e ajustada em condições fisiológicas. No entanto, este material ainda não pode ser impresso em conjunto com células vivas, pois requer pós-tratamento em um ambiente úmido e subsequente imersão em solução aquosa por um longo período.
Alternativamente, hidrogéis carregados de células com partículas inorgânicas incorporadas têm sido propostos como substitutos da matriz óssea 3D 8,9. Apesar de sua grande capacidade de suportar a viabilidade celular, eles não são capazes de recapitular o ambiente de tecido ósseo densamente mineralizado. Thrivikarman et al.10 adotaram uma abordagem biomimética na qual um meio supersaturado de cálcio e fosfato foi utilizado com um análogo proteico não colagenoso para melhor mimetizar a deposição de apatita em nanoescala. No entanto, suas construções ainda não podem gerar construções 3D rígidas com arquitetura de micro e macroescala semelhante a ossos.
O presente estudo aborda essas deficiências por meio do desenvolvimento de uma estratégia de impressão para fabricar construtos que imitam ossos, em fases inorgânica e orgânica, que sejam capazes de integrar tanto células quanto fatores de crescimento11. O COBICS recapitula exclusivamente a estrutura mineral e celular do osso usando uma técnica de bioimpressão baseada em microgel. O protocolo aqui descrito descreve o processo de síntese dos microgéis cerâmicos à base de tinta óssea e gelatina e, em seguida, a combinação de células que permitem o COBICS. O processo começa com a síntese do principal material precursor da tinta óssea. O hidrogel reticulável é então sintetizado e formado em microgéis. Por fim, a tinta óssea é depositada omnidirecionalmente em um banho de suporte dos microgéis carregados de células (Figura 1).
A tinta óssea pode ser impressa em qualquer suspensão de microgéis que tenham as características apropriadas de tensão de rendimento, ou seja, a capacidade de fluidizar a uma taxa de cisalhamento específica e, posteriormente, apoiar a estrutura depositada. Foram demonstradas duas abordagens flexíveis: uma suspensão constituída por microgéis de gelatina e uma suspensão constituída por microgéis de metacrilato de gelatina (GelMA). A primeira suspensão dissolve-se quando a temperatura é elevada para 37 °C, a forma livre de incorporação reversível de hidrogéis suspensos (FRESH) técnica12, enquanto a última pode ser fotoreticulada após a impressão, efetivamente "costurando" os microgéis juntos e travando a tinta óssea impressa no lugar. O presente estudo se concentra no uso de GelMA como matriz, pois fornece a vantagem única de ser capaz de suportar o crescimento celular com impressão in situ de estruturas miméticas ósseas complexas. Em última análise, essa abordagem permite a geração de modelos de tecidos complexos com altos níveis de biomimética e amplas implicações para a modelagem de doenças, descoberta de medicamentos e engenharia regenerativa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho . (A) A tinta óssea é sintetizada a partir da síntese de fosfato α-tricálcico e sua subsequente combinação com glicerol, polissorbato 80 e fosfato de amônio dibásico. (B) Os microgéis GelMA são fabricados pelo método de emulsão de água em óleo. Os microgéis obtidos são então (C) hidratados e (D) combinados com células. Os compósitos de célula-microgel são então usados como um banho granular no qual a tinta óssea é depositada. (E) Toda a construção é então reticulada por UV e transferida para a incubadora para cultura. Abreviaturas: α-TCP = fosfato α-tricálcico; GelMA = metacrilato de gelatina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

Estruturalmente, o tecido ósseo é um composto inorgânico-orgânico contendo células metabolicamente ativas embutidas dentro de uma matriz hierárquica e altamente mineralizada. Essa organização é difícil de replicar devido ao ambiente heterogêneo do osso. A bioimpressão omnidirecional cerâmica em suspensões celulares (COBICS) é uma técnica de bioimpressão baseada em microgel que replica exclusivamente a estrutura mineral e celular do osso. A COBICS imprime construções complexas e biologicamente relevantes sem a necessidade de materiais de suporte sacrificiais ou etapas severas de pós-processamento (por exemplo, radiação e sinterização a alta temperatura), que são dois dos maiores desafios na fabricação aditiva de construções miméticas ósseas. Esta técnica é habilitada através da extrusão de forma livre de uma nova tinta à base de fosfato de cálcio dentro de uma suspensão de microgel à base de gelatina. As propriedades de rendimento-tensão da suspensão permitem a deposição e suportam a estrutura óssea impressa. A reticulação UV e a nanoprecipitação então a "bloqueiam" no lugar. A capacidade de imprimir cerâmicas miméticas ósseas nanoestruturadas em biomateriais carregados de células fornece controle espaço-temporal sobre macro e microarquitetura e facilita a fabricação em tempo real de construções ósseas complexas em ambientes clínicos.

A COBICS imprime construções complexas e biologicamente relevantes sem a necessidade de materiais de suporte sacrificiais ou etapas severas de pós-processamento (por exemplo, radiação e sinterização a alta temperatura), que são dois dos maiores desafios na fabricação aditiva de construções miméticas ósseas. Para demonstrar a formação de COBICS de estruturas ósseas complexas e a co-impressão de células em suspensões de microgel, foram obtidas imagens representativas de compósitos ósseos feitos de tin...

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Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Este protocolo descreve uma técnica de impressão 3D para fabricar estruturas semelhantes a ossos, depositando uma tinta de fosfato de cálcio em um suporte granular à base de gelatina. Os análogos ósseos impressos são depositados em forma livre, com flexibilidade para a colheita direta da impressão ou reticulação dentro de uma matriz celular viva para construções multifásicas.

Bioimpressão Cerâmica Omnidirecional em Suspensões Carregadas de Células para a Geração de Análogos Ósseos

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Este protocolo permite a fabricação de análogos ósseos sem a necessidade de aquecimento ou produtos químicos tóxicos. Desta forma, as estruturas ósseas são formadas com o potencial de reparar um defeito ósseo em ambientes clínicos usando as próprias células de um paciente. A principal vantagem da técnica é que a tinta óssea pode ser impressa com células vivas para formar qualquer estrutura óssea complexa e direcionar a diferenciação para a linhagem formadora óssea.Além disso, as drogas podem ser carregadas na tinta do osso para melhorar simultaneamente a cicatrização de feridas, a regeneração óssea e tratar patologias como o câncer. Demonstrando o procedimento estarão Gagan Jalandhra, um candidato a PhD no meu laboratório, e a Dra. Sara Romanazzo, que trabalhou comigo e com a Dra. Jalandhra em vários projetos, incluindo o desenvolvimento dessa tecnologia. Comece adicionando a mistura de hidrogenofosfato de cálcio e carbonato de cálcio em pó a um cadinho de zircônia de tal forma que não esteja mais do que 75% cheio.Transfira o cadinho para um forno, aqueça-o a 1.400 graus Celsius a uma taxa de cinco graus Celsius por minuto e segure por três horas. Apague a reação removendo o cadinho do forno e deixando em um topo de bloco refratário. Deixe esfriar completamente antes de manusear.Use uma argamassa e pilão para quebrar e moer o bolo de fosfato alfa-tricálcico de tal forma que os grânulos resultantes tenham um tamanho máximo de 200 micrômetros. Adicione três bolas de zircônia estabilizadas por ítria milimétrica à mistura moída, seguidas de etanol a 100%. Prenda a tampa e triture por duas horas a 180 rotações por minuto.Recolha a suspensão e separe as esferas, utilizando etanol a 100% para a lavagem. Seque a suspensão em forno a 120 graus Celsius por 24 horas. Adicione o pó seco aos frascos de moagem com bolas de zircônia de um milímetro e etanol a 100% nas mesmas proporções de peso do primeiro estágio.Moer por duas horas a 180 rotações por minuto. Em seguida, separe e seque no forno. Retire a amostra do forno.Para fazer a tinta óssea, adicione 630 microlitros de glicerol e 130 microlitros de polissorbato 80 a um frasco de bola mil. Em seguida, adicione 100 miligramas de fosfato de amônio dibásico e dois gramas de pó de fosfato alfa-tricálcico à solução e mexa continuamente com uma espátula para combinar. Adicione uma bola de zircônia de 25 milímetros, prenda a tampa e coloque-a dentro de um moinho planetário por 60 minutos a 180 rotações por minuto, parando no meio do caminho para raspar as laterais do frasco com uma espátula usando uma espátula.Carregue a tinta numa seringa de um mililitro. Fazer uma solução a 10% de gelatina tipo A em PBS 1X conforme descrito no manuscrito do texto. Colocar o balão cónico no agitador.Em seguida, adicione 5.796 mililitros de anidrido metacrílico e continue mexendo no escuro a 50 graus Celsius por 90 minutos. Apagar a reacção diluindo o conteúdo dos frascos cónicos duas vezes com PBS. Decant em tubos de 50 mililitros e remover o anidrido metacrílico não reagido por centrifugação a 3000 RCF à temperatura ambiente durante três minutos e recolha do sobrenadante.Dialise o sobrenadante dentro de tubos de diálise de celulose de corte de 14 quilodalton contra água deionizada a 40 graus Celsius por cinco dias enquanto mexe suavemente. Substitua a água deionizada todos os dias. Prepare-se para o armazenamento decantando em tubos de 50 mililitros, prendendo a tampa e colocando-a na geladeira por 12 horas.Em seguida, congele as amostras usando nitrogênio líquido e imediatamente liofilize por cinco dias a menos 54 graus Celsius e 0,4 milibares. Armazene a espuma resultante em um freezer a menos 20 graus Celsius. Para sintetizar microgéis GelMA, faça uma solução GelMA a 10% a peso em PBS pesando o GelMA liofilizado, adicionando-o a um tubo com PBS e aquecendo em banho-maria a 50 graus Celsius até ficar totalmente hidratado.Adicione 37 mililitros de óleo por um mililitro de solução de GelMA a um copo, garantindo que não esteja mais do que 65% cheio. Configure um sistema de copo duplo em uma placa quente com agitação magnética, colocando o copo contendo óleo dentro de um copo maior. Aqueça a 40 graus Celsius enquanto mexe.Carregue a solução de GelMA numa seringa e adicione-a gota a gota ao óleo de agitação através de um filtro de 0,45 micrómetros. Deixe a emulsão se equilibrar por 10 minutos. Reduza a temperatura da emulsão para 15 graus Celsius para termicamente.Estabilize as esferas adicionando gelo triturado no espaço entre os dois béqueres. Adicione acetona à emulsão GelMA giratória. Decantar o conteúdo do copo em tubos de 50 mililitros, certificando-se de lavar as paredes do copo com acetona.Deixe descansar por 20 minutos para permitir que os microgéis desidratados se depositem no fundo. Rejeitar o sobrenadante e lavar os microgéis duas vezes com acetona. Consolide em um tubo, recarregue com acetona e sonicate por 10 segundos.Novamente, lave-o com acetona duas vezes. Conservar em acetona à temperatura ambiente até ser necessário para impressão. Para preparar a suspensão de microgel GelMA para impressão, formule uma solução ponderal a 1% de GelMA em DMEM conforme descrito no manuscrito do texto.Evaporar a acetona dos microgéis desidratados e pesar o pó resultante num tubo. Adicione acetona e transfira para um ambiente estéril. Para formar a suspensão de microgel, evapore a acetona do pó dentro do gabinete de biossegurança.Após a evaporação, adicionar DMEM, solução de 1%GelMA em DMEM e solução iniciadora de LAP a 2,5% para obter uma fração de embalagem final de 30%Deixe hidratar totalmente por pelo menos 12 horas à temperatura ambiente. Cultivar as células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo em DMEM de baixa glicose suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até ser confluente. Remover as células estaminais mesenquimais derivadas do tecido adiposo do balão de cultura de tecidos, removendo o meio e lavando com PBS estéril.Pellet as células por centrifugação a 150 RCF à temperatura ambiente durante cinco minutos. Conte as células e calcule pelo menos 5 x 10 para as cinco células para cada mililitro de microgéis GelMA. Aloque o volume necessário da suspensão da célula a um tubo e pellet separados, conforme demonstrado anteriormente.Retire cuidadosamente o máximo de sobrenadante possível usando uma pipeta, deixando apenas a pastilha celular. Adicione o volume necessário de suspensão de microgel ao pellet e pipete suavemente para cima e para baixo para garantir uma distribuição uniforme. Carregar a célula carregada em suspensão de microgel em um reator usando uma pipeta.Usando uma seringa de um mililitro equipada com uma agulha de calibre 23, deposite a tinta óssea, faça a ligação cruzada da célula e do microgel GelMA carregado de tinta óssea com uma lâmpada reticulante UV a 405 nanômetros por 90 segundos. Transfira imediatamente a suspensão de microgel para uma placa de poço de tamanho adequado contendo DMEM completo. Incubar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Substitua o meio de cultura após 24 horas e, em seguida, a cada 48 a 72 horas, conforme necessário. A tinta óssea foi analisada por microscopia eletrônica de varredura para determinar sua microestrutura, que mostrou a formação de cristal de hidroxiapatita após a configuração da tinta, particularmente visível em condições secas. Neste estudo, as células foram misturadas com microgéis GelMA e mantidas em cultura por até cinco dias, seja apenas em suspensão de microgel ou no sistema COBICS.As células apresentaram boa viabilidade na presença da tinta óssea, tanto no primeiro dia quanto no quinto dia, confirmando que os produtos de lixiviação da tinta não foram prejudiciais às células. É crucial controlar a velocidade do stirrig enquanto sintetiza o microgel, pois uma ligeira mudança de agitação pode causar diferenças de tamanho. Também é importante garantir a distribuição homogênea das células dentro da suspensão de microgel.O mesmo protocolo pode ser usado para imprimir dentro de suspensões de microgel de gelatina, que atuam como suportes de sacrifício, deixando para trás construções ósseas autônomas. Mas o uso do GelMA abre caminho para construções multifásicas de um pote, como interfaces osteocondrais ou tendinosas ósseas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Geração de espessura completa tridimensional Pele Equivalente e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioengenharia

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting celularizado Constrói Usando um específico do tecido Hidrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradiente de pressão Chip para estimulantes comportamentos celulares em hidrogel de célula-carregado

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Técnica Automated Robotic dispensação de Orientação da superfície e bioprinting de Células

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularizado de microfluidic Bioprinting para a engenharia de tecidos e Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting da cartilagem e Analogs de tecido de pele utilizando um romance passiva unidade técnica de mistura para Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

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The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Bioink extracelular derivado da matriz de tecido sipâncreas para a impressão de construções de tecidopanpático 3D Carregadas de células

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Medindo kinemática de ombro 3D in vivo usando videoradiografia biplanar

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Bioimpressão 3D de astrócitos cortical de murina para engenharia de tecido neural

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