Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Авторы хотели бы отметить Национальный совет по здравоохранению и медицинским исследованиям (грант No GNT1111694 и GNT1141602) и Австралийский исследовательский совет (грант No FT180100417, FL150100060 и CE14100036). Авторы хотели бы отметить Центр биомедицинской визуализации в Университете Нового Южного Уэльса. Рисунки были созданы с помощью Biorender.com, Adobe Photoshop и Adobe Illustrator и были экспортированы по платной подписке.

1. Изготовление костяных чернил
<ol><li>Синтез α-трикальцийфосфата<ol><li>Взвешивайте порошки гидрофосфата кальция (CaHPO4) и карбоната кальция (CaCO3) в молярном соотношении 3:2 Ca:P. С помощью шпателя тщательно гомогенизируйте два порошка.</li>
		<li>Добавьте смесь порошка гидрофос...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

Технология 3D-печати COBICS была разработана для изготовления минерализованных костно-подобных структур путем экструзии в сшиваемую микрогелевую суспензию, содержащую живые клетки. Метод был применен к разлагаемой микрогелевой суспензии, и клетки демонстрируют хорошую жизнеспособност?...

Кость обладает замечательными способностями к регенерации как одна из немногих структур в организме, которая может исцеляться, воссоздавая свой нормальный клеточный состав, ориентацию и механическую прочность вплоть до критического размера дефекта, когда эндогенная способность заживления скомпрометирована1. Кость, вместе с хрящом и связкой, поддерживает и облегчает движение тела, а также хранит минералы и жиры и производит клетки крови. Как твердая, плотная соединительная ткань, кость в основном состоит из неорганической фазы, воды и органического материала, состоящего в основном из коллагеновых волокон2. Клетки встроены в эту высокоминерализованную матрицу из коллагеновых волокон I и кристаллов гидроксиапатита (ГК), образуя иерархическую структуру3.
Сложная организация этой ткани делает изготовление синтетических альтернатив для репликации гетерогенных костных микро- и наносред исключительно сложным3. Для этой цели в качестве решений для создания костных матриц были предложены различные материалы, включая биокерамику, насыщенные клетками гидрогели и синтетические материалы. Среди методов изготовления строительных лесов недавно появились методы на основе 3D-печати, которые получили большое внимание со стороны сообщества тканевой инженерии благодаря их замечательной способности позволять изготавливать очень сложные и точные структуры с большими перспективами лечения для конкретного пациента 4,5,6 . Гидрогели были самым популярным выбором матричной имитации и биочернил, поскольку они могут быть напечатаны вместе с клетками и биологически активными молекулами, генерируя функциональные конструкции6. Однако гидрогелям не хватает функциональных свойств кости, таких как механическая прочность и сильно кальцинированная, неорганическая фаза, содержащая метаболически активные клетки.
3D-печатные керамические каркасы обычно требуют этапов постобработки, включая спекание, высокотемпературную обработку или использование агрессивных химических веществ, которые должны быть тщательно вымыты перед применением in vitro или in vivo 5. Чтобы устранить эти ограничения, Lode et al.7 недавно разработали пасту на основе α-трикальцийфосфата, образованную гидроксиапатитом, которая может быть напечатана и установлена в физиологических условиях. Однако этот материал все еще не может быть напечатан вместе с живыми клетками, поскольку он требует постобработки во влажной среде и последующего погружения водного раствора в течение длительного периода.
В качестве альтернативы в качестве замены 3D-костной матрицы 8,9 были предложены нагруженные клетками гидрогели с включенными неорганическими частицами. Несмотря на их большую способность поддерживать жизнеспособность клеток, они не способны рекапитулировать плотно минерализованную среду костной ткани. Thrivikarman et al.10 приняли биомиметический подход, в котором перенасыщенная кальциевая и фосфатная среда использовалась с аналогом неколлагенового белка, чтобы лучше имитировать наноразмерное осаждение апатита. Однако их конструкции все еще не могут генерировать жесткие 3D-конструкции с микро- и макромасштабной архитектурой, напоминающей кость.
Настоящее исследование устраняет эти недостатки путем разработки стратегии печати для изготовления имитирующих кости конструкций в неорганической и органической фазах, которые способны интегрировать как клетки, так и факторы роста11. COBICS уникально резюмирует минеральную и клеточную структуру кости с использованием метода биопечати на основе микрогелей. Протокол в настоящем описании процесса синтеза керамических микрогелей на основе костных чернил и желатина и последующего объединения клеток, которые обеспечивают COBICS. Процесс начинается с синтеза основного материала-предшественника костных чернил. Затем сшиваемый гидрогель синтезируется и формируется в микрогели. Наконец, костные чернила осаждаются всенаправленно в поддерживающей ванне микрогелей, нагруженных клетками (рисунок 1).
Костные чернила могут быть напечатаны в любой суспензии микрогелей, которые имеют соответствующие характеристики пределов текучести, то есть способность текучесть с определенной скоростью сдвига и впоследствии поддерживать осажденную структуру. Были продемонстрированы два гибких подхода: суспензия, состоящая из желатиновых микрогелей, и суспензия, состоящая из микрогелей желатина метакрилата (GelMA). Первая суспензия растворяется при повышении температуры до 37 °C, обратимое встраивание свободной формы взвешенных гидрогелей (FRESH) по методу12, в то время как последнее может быть сшито после печати, эффективно «сшивая» микрогели вместе и фиксируя напечатанные костные чернила на месте. Настоящее исследование фокусируется на использовании GelMA в качестве матрицы, поскольку оно обеспечивает уникальное преимущество, заключающееся в способности поддерживать рост клеток с помощью печати in situ сложных костных миметических структур. В конечном счете, этот подход позволяет генерировать сложные тканевые модели с высоким уровнем биомимикрии и широкими последствиями для моделирования заболеваний, открытия лекарств и регенеративной инженерии.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> Рисунок 1: Схема рабочего процесса. (А) Костно-чернила синтезируют, начиная с синтеза α-трикальцийфосфата и его последующей комбинации с глицерином, полисорбатом 80 и диосновным фосфатом аммония. (B) Микрогели GelMA изготавливаются методом эмульсии «вода в масле». Полученные микрогели затем (С) гидратируют и (D) объединяют с клетками. Клеточно-микрогелевые композиты затем используются в качестве гранулированной ванны, в которой откладываются костные чернила. (E) Затем вся конструкция сшивается УФ-излучением и переносится в инкубатор для культивирования. Сокращения: α-TCP = α-трикальцийфосфат; GelMA = желатин метакрилат. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

Структурно костная ткань представляет собой неорганически-органический композит, содержащий метаболически активные клетки, встроенные в иерархическую, высокоминерализованную матрицу. Эту организацию сложно воспроизвести из-за гетерогенной среды кости. Керамическая всенаправленная биопечать в клеточных суспензиях (COBICS) - это метод биопечати на основе микрогелей, который уникально воспроизводит минеральную и клеточную структуру кости. COBICS печатает сложные, биологически значимые конструкции без необходимости в жертвенных вспомогательных материалах или жестких этапах постобработки (например, радиация и высокотемпературное спекание), которые являются двумя из самых больших проблем в аддитивном производстве костных миметических конструкций. Этот метод обеспечивается путем экструзии свободной формы новых чернил на основе фосфата кальция в микрогелевой суспензии на основе желатина. Свойства суспензии при пределе текучести позволяют накладываться и поддерживать печатную костную структуру. УФ-сшивание и нанопреципитация затем «блокируют» его на месте. Способность печатать наноструктурированную костно-миметическую керамику в клеточных биоматериалах обеспечивает пространственно-временный контроль над макро- и микроархитектурой и облегчает изготовление в режиме реального времени сложных костных конструкций в клинических условиях.

COBICS печатает сложные, биологически значимые конструкции без необходимости в жертвенных вспомогательных материалах или жестких этапах постобработки (например, радиация и высокотемпературное спекание), которые являются двумя из самых больших проблем в аддитивном производстве костных...

Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Этот протокол описывает технику 3D-печати для изготовления костеподобных структур путем осаждения чернил фосфата кальция в гранулированную опору на основе желатина. Печатные костные аналоги наносятся в свободной форме, с гибкостью для прямого сбора отпечатка или сшивания внутри матрицы живых клеток для многофазных конструкций.

Керамическая всенаправленная биопечать в клеточных суспензиях для генерации костных аналогов

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Этот протокол позволяет изготавливать костные аналоги, не требуя нагрева или токсичных химических веществ. Таким образом, формируются костные структуры с потенциалом для восстановления костного дефекта в клинических условиях с использованием собственных клеток пациента. Основным преимуществом методики является то, что костные чернила могут быть напечатаны живыми клетками для формирования любой сложной костно-подобной структуры и для прямой дифференцировки в сторону костиобразующей линии.Кроме того, лекарства могут быть загружены в костные чернила для одновременного улучшения заживления ран, регенерации костей и для лечения таких патологий, как рак. Демонстрировать процедуру будут Гаган Джаландхра, кандидат наук в моей лаборатории, и доктор Сара Романаццо, которая работала со мной и доктором Джаландхрой над различными проектами, включая разработку этой технологии. Начните с добавления смеси порошка гидрофосфата кальция и карбоната кальция в тигель циркония таким образом, чтобы он был заполнен не более чем на 75%.Переложите тигель в печь, нагрейте его до 1 400 градусов Цельсия со скоростью пять градусов Цельсия в минуту и подержите три часа. Погасите реакцию, сняв тигель из печи и оставив на вершине огнеупорный блок. Дайте ему полностью остыть перед обработкой.Используйте ступку и пестик, чтобы разбить и измельчить альфа-трикальцийфосфатный жмых таким образом, чтобы полученные гранулы имели максимальный размер 200 микрометров. Добавьте в измельченную смесь три миллиметровых стабилизированных циркониевых шарика, а затем 100% этанол. Закрепите крышку и измельчите в течение двух часов со скоростью 180 оборотов в минуту.Соберите суспензию и отделите шарики, используя 100% этанол для промывки. Высушите суспензию в духовке при 120 градусах Цельсия в течение 24 часов. Добавьте высушенный порошок в банки для измельчения с одним миллиметром циркониевых шариков и 100% этанолом в тех же весовых соотношениях, что и на первом этапе.Измельчайте в течение двух часов со скоростью 180 оборотов в минуту. Затем отделить и высушить в духовке. Достаньте образец из духовки.Чтобы сделать костяные чернила, добавьте 630 микролитров глицерина и 130 микролитров полисорбата 80 в шаровую банку. Затем добавьте в раствор 100 миллиграммов двухосновного фосфата аммония и два грамма порошка альфа-трикальцийфосфата и непрерывно перемешайте шпателем, чтобы соединить. Добавьте 25-миллиметровый циркониевый шарик, закрепите крышку и поместите его внутрь планетарной мельницы на 60 минут со скоростью 180 оборотов в минуту, остановившись на полпути, чтобы соскрести по бокам банки шпателем с помощью шпателя.Загрузите чернила в шприц на один миллилитр. Внесите 10%-ный раствор желатина типа А в 1X PBS, как описано в тексте рукописи. Поместите коническую колбу на мешалку.Затем добавьте 5,796 миллилитров метакрилового ангидрида и продолжайте помешивать в темноте при 50 градусах Цельсия в течение 90 минут. Погасите реакцию, разбавляя содержимое конических колб в два раза PBS. Декантировать в 50 миллилитровые трубки и удалить непрореагировавший метакриловой ангидрид центрифугированием при 3000 RCF при комнатной температуре в течение трех минут и сбором супернатанта.Диализуйте супернатант внутри 14 килодалтонов, отрезав целлюлозные диализные трубки против деионизированной воды при температуре 40 градусов Цельсия в течение пяти дней, осторожно перемешивая. Заменяйте деионизированную воду каждый день. Подготовьте к хранению, декантируя в 50-миллилитровые трубки, закрепляя колпачок и помещая его в холодильник на 12 часов.Затем заморозьте образцы с использованием жидкого азота и немедленно лиофилизируйте в течение пяти дней при минус 54 градусах Цельсия и 0,4 миллибара. Храните полученную пену в морозильной камере при минус 20 градусах Цельсия. Чтобы синтезировать микрогели GelMA, сделайте 10% веса по весу раствор GelMA в PBS, взвесив лиофилизированный GelMA, добавив его в трубку с PBS и нагревая на водяной бане при 50 градусах Цельсия до полного увлажнения.Добавьте в стакан 37 миллилитров масла на один миллилитр раствора GelMA, убедившись, что он заполнен не более чем на 65%. Установите систему двойного стакана на конфорке с магнитным перемешиванием, поместив стакан, содержащий масло, внутрь большего стакана. Нагревать до 40 градусов Цельсия при перемешивании.Загрузите раствор GelMA в шприц и добавьте его по каплям в перемешивающее масло через фильтр 0,45 микрометра. Дайте эмульсии уравновеситься в течение 10 минут. Уменьшите температуру эмульсии до 15 градусов Цельсия до термической.Стабилизируйте сферы, добавив измельченный лед в пространство между двумя стаканами. Добавьте ацетон в вращающуюся эмульсию GelMA. Декантируйте содержимое стакана в 50-миллилитровые трубки, обязательно промыв стенки стакана ацетоном.Дайте ему отдохнуть в течение 20 минут, чтобы обезвоженные микрогели осели на дно. Откажитесь от супернатанта и дважды промойте микрогели ацетоном. Залейте в одну трубку, доливайте ацетоном и обрабатывайте ультразвуком в течение 10 секунд.Опять же, дважды промыть его ацетоном. Хранить в ацетоне при комнатной температуре до тех пор, пока не потребуется печать. Чтобы подготовить микрогелевую суспензию GelMA к печати, сформулируйте 1% весовой раствор GelMA в DMEM, как описано в текстовой рукописи.Испарите ацетон из обезвоженных микрогелей и взвесьте полученный порошок в пробирку. Добавляют ацетон и переносят в стерильную среду. Чтобы сформировать микрогелевую суспензию, испарите ацетон из порошка внутри шкафа биобезопасности.После выпаривания добавляют DMEM, 1% раствор GelMA в DMEM и 2,5% раствор инициатора LAP для достижения окончательной фракции упаковки 30% Позволяет полностью гидратировать в течение не менее 12 часов при комнатной температуре. Культивируйте мезенхимальные стволовые клетки жирового происхождения в ДМЭМ с низким содержанием глюкозы, дополненные 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа до слияния. Удалите мезенхимальные стволовые клетки жирового происхождения из колбы культуры тканей, удалив среду и промыв стерильным PBS.Гранулируйте ячейки центрифугированием при 150 RCF при комнатной температуре в течение пяти минут. Подсчитайте клетки и рассчитайте, по крайней мере, от 5 х 10 до пяти клеток на каждый миллилитр микрогелей GelMA. Выделите необходимый объем клеточной суспензии в отдельную трубку и гранулу, как показано ранее.Осторожно удалите как можно больше супернатанта с помощью пипетки, оставив только ячейку гранулы. Добавьте необходимый объем микрогелевой суспензии в гранулу и аккуратно пипеткой вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение. Загрузите ячейку, нагруженную микрогелевой суспензией, в реактор с помощью пипетки.Используя один миллилитр шприц, оснащенный иглой 23 калибра, нанесите костные чернила, сшивите клетку и нагруженный костями микрогель GelMA с помощью ультрафиолетовой сшивающей лампы на 405 нанометров в течение 90 секунд. Немедленно переложите микрогелевую суспензию на пластину подходящего размера, содержащую полный DMEM. Инкубировать при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.Замените питательную среду через 24 часа, затем каждые 48-72 часа по мере необходимости. Костяные чернила были проанализированы методом сканирующей электронной микроскопии для определения их микроструктуры, которая показала образование кристалла гидроксиапатита после схватывания чернил, особенно заметного в сухих условиях. В этом исследовании клетки смешивали с микрогелями GelMA и держали в культуре до пяти дней, либо только в суспензии микрогеля, либо в системе COBICS.Клетки показали хорошую жизнеспособность в присутствии костных чернил, как в первый, так и в пятый день, подтверждая, что продукты выщелачивания чернил не наносят вреда клеткам. Крайне важно контролировать скорость перемешивания при синтезе микрогеля, так как небольшие изменения перемешивания могут вызвать различия в размерах. Также важно обеспечить однородное распределение клеток внутри микрогелевой суспензии.Тот же протокол может быть использован для печати внутри желатиновых микрогелевых суспензий, которые действуют как жертвенные опоры, оставляя после себя автономные костные конструкции. Но использование GelMA открывает путь для многофазных конструкций одного горшка, таких как остеохондральные или костные сухожильные интерфейсы.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Генерация трехмерной всю толщину кожи Эквивалент техники и автоматизированных Ранение

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Создаёт Использование Тканеспецифическая гидрогелевых Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Градиент штамм чип для стимулирования клеточных поведения в ячейке Ладена Гидрогель

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Роботизированная Дозирование Техника для ориентации поверхности и Bioprinting клеток

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic подложке для инженерных васкуляризированной ткани и Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Подложке хряща и аналогов ткани кожи, используя Роман пассивного смешивания единицы техники для Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Кальвариальная модель увеличения костей в кролике для оценки роста костей и неоваскуляризации в материалах замены костей

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Поджелудочная ткань-производные внеклеточной матрицы Bioink для печати 3D-клетки-Ладена поджелудочной железы Конструкции Конструкции

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Измерение 3D In-vivo Кинематика плеча с помощью бипланарной видеорадиографии

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D-биопечать мышиных кортикальные астроциты для инженерии невроходобной ткани

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...