Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Los autores desean reconocer al Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (Grant no. GNT1111694 y GNT1141602) y al Consejo Australiano de Investigación (Grant no. FT180100417, FL150100060 y CE14100036). Los autores desean reconocer el Centro de Imágenes Biomédicas de la Universidad de Nueva Gales del Sur. Las figuras se crearon con Biorender.com, Adobe Photoshop y Adobe Illustrator y se han exportado bajo una suscripción paga.

1. Fabricación de tinta de hueso
<ol><li>Síntesis de fosfato α-tricálcico<ol><li>Pesar los polvos de hidrogenofosfato de calcio (CaHPO4) y carbonato de calcio (CaCO 3) en una relación molar de Ca:P de3:2. Usando una espátula, homogeneice bien los dos polvos.</li>
		<li>Agregue la mezcla de polvo de fosfato de hidrógeno y carbonato de calcio a un crisol de zirconia de tal manera que no esté más del 75% lleno. NOTA: Para evitar la contaminación, utilice un crisol nuevo ...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

La técnica de impresión 3D COBICS se desarrolló para permitir la fabricación de estructuras óseas mineralizadas mediante extrusión en una suspensión de microgel reticulable que contiene células vivas. La técnica ha sido aplicada a una suspensión de microgel degradable, y las células muestran buena viabilidad, diseminación y capacidad de diferenciación osteogénica dentro del sistema11. Un determinante clave del éxito de las construcciones creadas utilizando esta técnica es la sínte...

El hueso tiene notables capacidades de regeneración como una de las pocas estructuras en el cuerpo que puede sanar recreando su composición celular normal, orientación y resistencia mecánica hasta un tamaño de defecto crítico, cuando la capacidad de curación endógena se ve comprometida1. El hueso, junto con el cartílago y el ligamento, apoya y facilita el movimiento del cuerpo, al tiempo que almacena minerales y grasas y produce células sanguíneas. Como tejido conectivo duro y denso, el hueso está compuesto principalmente de una fase inorgánica, agua y material orgánico compuesto principalmente de fibras de colágeno2. Las células están incrustadas dentro de esta matriz altamente mineralizada de fibras de colágeno I y cristales de hidroxiapatita (HA), formando una estructura jerárquica3.
La compleja organización de este tejido hace que la fabricación de alternativas sintéticas para replicar los micro y nanoambientes óseos heterogéneossea excepcionalmente desafiante 3. Para este propósito, se han propuesto una variedad de materiales, incluyendo biocerámicas, hidrogeles cargados de células y materiales sintéticos como soluciones para crear matrices óseas. Entre las técnicas de fabricación de andamios, las técnicas basadas en la impresión 3D han surgido recientemente y han recibido mucha atención de la comunidad de ingeniería de tejidos debido a su notable capacidad para permitir la fabricación de estructuras altamente sofisticadas y precisas con una gran promesa de tratamiento específico para el paciente 4,5,6 . Los hidrogeles han sido la opción más popular de imitadores de matrices y biotintas, ya que pueden imprimirse junto con células y moléculas bioactivas, generando construcciones funcionales6. Sin embargo, los hidrogeles carecen de las propiedades funcionales del hueso, como la resistencia mecánica y una fase inorgánica altamente calcificada que contiene células metabólicamente activas.
Los andamios cerámicos impresos en 3D generalmente requieren pasos de posprocesamiento, incluida la sinterización, los tratamientos a alta temperatura o el uso de productos químicos agresivos que deben lavarse a fondo antes de las aplicaciones in vitro o in vivo 5. Para abordar estas limitaciones, Lode et al.7 desarrollaron recientemente una pasta a base de fosfato α-tricálcico formada por hidroxiapatita, que puede imprimirse y fijarse en condiciones fisiológicas. Sin embargo, este material todavía no se puede imprimir junto con células vivas, ya que requiere un tratamiento posterior en un ambiente húmedo y una posterior inmersión en solución acuosa durante un largo período.
Alternativamente, se han propuesto hidrogeles cargados de células con partículas inorgánicas incorporadas como reemplazo de la matriz ósea 3D 8,9. A pesar de su gran capacidad para apoyar la viabilidad celular, no son capaces de recapitular el entorno de tejido óseo densamente mineralizado. Thrivikarman et al.10 adoptaron un enfoque biomimético en el que se utilizó un medio sobresaturado de calcio y fosfato con un análogo de proteína no colágena para imitar mejor la deposición de apatita a nanoescala. Sin embargo, sus construcciones aún no pueden generar construcciones 3D rígidas con una arquitectura a micro y macroescala que se asemeje al hueso.
El presente estudio aborda estas deficiencias a través del desarrollo de una estrategia de impresión para fabricar construcciones que imitan los huesos, en fases inorgánicas y orgánicas, que son capaces de integrar tanto células como factores de crecimiento11. COBICS recapitula de manera única la estructura mineral y celular del hueso utilizando una técnica de bioimpresión basada en microgeles. El protocolo aquí describe el proceso de síntesis de la tinta de hueso cerámico y los microgeles a base de gelatina y luego la combinación de células que permiten COBICS. El proceso comienza con la síntesis del principal material precursor de la tinta de hueso. El hidrogel reticulado se sintetiza y se forma en microgeles. Por último, la tinta ósea se deposita omnidireccionalmente en un baño de soporte de los microgeles cargados de células (Figura 1).
La tinta de hueso puede imprimirse en cualquier suspensión de microgeles que tengan las características apropiadas de tensión de fluencia, es decir, la capacidad de fluidificar a una velocidad de cizallamiento específica y posteriormente soportar la estructura depositada. Se han demostrado dos enfoques flexibles: una suspensión que consiste en microgeles de gelatina y una suspensión que consiste en microgeles de metacrilato de gelatina (GelMA). La primera suspensión se disuelve cuando la temperatura se eleva a 37 °C, la técnica de incrustación reversible de hidrogeles suspendidos (FRESH) de forma libre12, mientras que la segunda puede ser reticulada después de la impresión, "cosiendo" efectivamente los microgeles juntos y bloqueando la tinta de hueso impresa en su lugar. El presente estudio se centra en el uso de GelMA como matriz, ya que proporciona la ventaja única de poder apoyar el crecimiento celular con la impresión in situ de estructuras miméticas óseas complejas. En última instancia, este enfoque permite la generación de modelos de tejidos complejos con altos niveles de biomímesis y amplias implicaciones para el modelado de enfermedades, el descubrimiento de fármacos y la ingeniería regenerativa.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> Figura 1: Esquema del flujo de trabajo . (A) La tinta ósea se sintetiza a partir de la síntesis de fosfato α-tricálcico y su posterior combinación con glicerol, polisorbato 80 y fosfato de amonio dibásico. (B) Los microgeles GelMA se fabrican mediante el método de emulsión de agua en aceite. Los microgeles obtenidos son entonces (C) hidratados y (D) combinados con células. Los compuestos de microgel celular se utilizan como un baño granular en el que se deposita la tinta ósea. (E) Todo el constructo se reticula a los rayos UV y se transfiere a la incubadora para su cultivo. Abreviaturas: α-TCP = fosfato α-tricálcico; GelMA = metacrilato de gelatina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

Estructuralmente, el tejido óseo es un compuesto inorgánico-orgánico que contiene células metabólicamente activas incrustadas dentro de una matriz jerárquica altamente mineralizada. Esta organización es difícil de replicar debido al entorno heterogéneo del hueso. La bioimpresión omnidireccional cerámica en suspensiones celulares (COBICS) es una técnica de bioimpresión basada en microgeles que replica de forma única la estructura mineral y celular del hueso. COBICS imprime construcciones complejas y biológicamente relevantes sin la necesidad de materiales de soporte de sacrificio o pasos de posprocesamiento severos (por ejemplo, radiación y sinterización a alta temperatura), que son dos de los mayores desafíos en la fabricación aditiva de construcciones miméticas óseas. Esta técnica se habilita a través de la extrusión de forma libre de una nueva tinta a base de fosfato de calcio dentro de una suspensión de microgel a base de gelatina. Las propiedades de límite elástico de la suspensión permiten la deposición y soportan la estructura ósea impresa. La reticulación UV y la nanoprecipitación luego lo "bloquean" en su lugar. La capacidad de imprimir cerámicas nanoestructuradas miméticas óseas dentro de biomateriales cargados de células proporciona control espaciotemporal sobre la macro y microarquitectura y facilita la fabricación en tiempo real de construcciones óseas complejas en entornos clínicos.

COBICS imprime construcciones complejas y biológicamente relevantes sin la necesidad de materiales de soporte de sacrificio o pasos de posprocesamiento severos (por ejemplo, radiación y sinterización a alta temperatura), que son dos de los mayores desafíos en la fabricación aditiva de construcciones miméticas óseas. Para demostrar la formación de COBICS de estructuras óseas complejas y la coimpresión de células en suspensiones de microgel, se tomaron imágenes representativas de compuestos similares a hueso he...

Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Este protocolo describe una técnica de impresión 3D para fabricar estructuras similares a huesos depositando una tinta de fosfato de calcio en un soporte granular a base de gelatina. Los análogos óseos impresos se depositan en forma libre, con flexibilidad para la recolección directa de la impresión o la reticulación dentro de una matriz de células vivas para construcciones multifásicas.

Bioimpresión omnidireccional cerámica en suspensiones cargadas de células para la generación de análogos óseos

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Este protocolo permite la fabricación de análogos óseos sin necesidad de calentamiento o productos químicos tóxicos. De esta manera, las estructuras óseas se forman con el potencial de reparar un defecto óseo en entornos clínicos utilizando las propias células de un paciente. La principal ventaja de la técnica es que la tinta ósea se puede imprimir con células vivas para formar cualquier estructura ósea compleja y dirigir la diferenciación hacia el linaje de formación ósea.Además, los medicamentos se pueden cargar en la tinta de hueso para mejorar simultáneamente la cicatrización de heridas, la regeneración ósea y para tratar patologías como el cáncer. Demostrando el procedimiento estarán Gagan Jalandhra, un candidato a doctorado en mi laboratorio, y la Dra. Sara Romanazzo, que ha trabajado conmigo y con el Dr. Jalandhra en varios proyectos, incluido el desarrollo de esta tecnología. Comience agregando la mezcla de polvo de fosfato de hidrógeno de calcio y carbonato de calcio a un crisol de zirconia de tal manera que no esté más del 75% de su capacidad.Transfiera el crisol a un horno, caliéntelo a 1, 400 grados centígrados a una velocidad de cinco grados centígrados por minuto y manténgalo durante tres horas. Apague la reacción retirando el crisol del horno y dejándolo en una parte superior del bloque refractario. Deje que se enfríe completamente antes de manipularlo.Use un mortero para romper y moler la torta de fosfato alfa-tricálcico de tal manera que los gránulos resultantes tengan un tamaño máximo de 200 micrómetros. Agregue tres bolas de zirconia estabilizadas con itria a la mezcla molida, seguidas de etanol al 100%. Asegure la tapa y muele durante dos horas a 180 rotaciones por minuto.Recoger la suspensión y separar las bolas, utilizando etanol 100% para el lavado. Seque la suspensión en un horno a 120 grados centígrados durante 24 horas. Agregue el polvo seco a los frascos de molienda con bolas de zirconia de un milímetro y etanol al 100% en las mismas proporciones de peso que en la primera etapa.Moler durante dos horas a 180 rotaciones por minuto. Luego separar y secar en el horno. Retire la muestra del horno.Para hacer la tinta de hueso, agregue 630 microlitros de glicerol y 130 microlitros de polisorbato 80 a un frasco de bola. Luego agregue 100 miligramos de fosfato de amonio dibásico y dos gramos de polvo de fosfato alfa-tricálcico a la solución y revuelva continuamente con una espátula para combinar. Agregue una bola de zirconia de 25 milímetros, asegure la tapa y colóquela dentro de un molino planetario durante 60 minutos a 180 rotaciones por minuto, deteniéndose hasta la mitad para raspar los lados del frasco con una espátula usando una espátula.Cargue la tinta en una jeringa de un mililitro. Haga una solución al 10% de gelatina tipo A en 1X PBS como se describe en el texto manuscrito. Colocar el matraz cónico sobre el agitador.Luego agregue 5.796 mililitros de anhídrido metacrílico y continúe revolviendo en la oscuridad a 50 grados centígrados durante 90 minutos. Apague la reacción diluyendo el contenido de los matraces cónicos dos veces con PBS. Decantar en tubos de 50 mililitros y eliminar el anhídrido metacrílico sin reaccionar por centrifugación a 3000 RCF a temperatura ambiente durante tres minutos y recoger el sobrenadante.Dialice el sobrenadante dentro de los tubos de diálisis de celulosa de corte de 14 kilodalton contra agua desionizada a 40 grados centígrados durante cinco días mientras agita suavemente. Reemplace el agua desionizada todos los días. Prepárese para el almacenamiento decantando en tubos de 50 mililitros, asegurando la tapa y colocándola en el refrigerador durante 12 horas.Luego congele las muestras con nitrógeno líquido e inmediatamente liofilice durante cinco días a menos 54 grados centígrados y 0,4 milibares. Guarde la espuma resultante en un congelador a menos 20 grados centígrados. Para sintetizar microgeles GelMA, haga una solución de GelMA al 10% peso por peso en PBS pesando el GelMA liofilizado, agregándolo a un tubo con PBS y calentándolo en un baño maría a 50 grados centígrados hasta que esté completamente hidratado.Agregue 37 mililitros de aceite por mililitro de solución GelMA a un vaso de precipitados, asegurándose de que no esté más del 65% lleno. Configure un sistema de vaso doble en una placa caliente con agitación magnética colocando el vaso de precipitados que contiene aceite dentro de un vaso de precipitados más grande. Calentar a 40 grados centígrados mientras revuelve.Cargue la solución de GelMA en una jeringa y agréguela gota a gota en el aceite de agitación a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Deje que la emulsión se equilibre durante 10 minutos. Reduzca la temperatura de la emulsión a 15 grados centígrados a temperatura térmica.Estabilice las esferas agregando hielo picado en el espacio entre los dos vasos de precipitados. Agregue acetona a la emulsión GelMA giratoria. Decantar el contenido del vaso de precipitados en tubos de 50 mililitros, asegurándose de lavar las paredes del vaso de precipitados con acetona.Deje reposar durante 20 minutos para permitir que los micro geles deshidratados se asienten en el fondo. Deseche el sobrenadante y lave los microgeles dos veces con acetona. Consolidar en un tubo, rellenar con acetona y sonicar durante 10 segundos.Nuevamente, lávelo con acetona dos veces. Conservar en acetona a temperatura ambiente hasta que sea necesario para la impresión. Para preparar la suspensión de microgel GelMA para la impresión, formule una solución de GelMA al 1% peso por peso en DMEM como se describe en el texto manuscrito.Evaporar la acetona de los microgeles deshidratados y pesar el polvo resultante en un tubo. Agregue acetona y transfiérala a un ambiente estéril. Para formar la suspensión de microgel, evapore la acetona del polvo dentro del gabinete de bioseguridad.Después de la evaporación, agregue DMEM, solución de GelMA al 1% en DMEM y solución iniciadora de LAP al 2,5% para lograr una fracción de empaque final de 30%Deje hidratar completamente durante al menos 12 horas a temperatura ambiente. Cultive las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo en DMEM bajo en glucosa suplementado con 10% FBS y 1% de penicilina-estreptomicina a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono hasta que sean confluentes. Extraer las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo del matraz de cultivo de tejidos retirando el medio y lavando con PBS estéril.Granular las células centrifugando a 150 RCF a temperatura ambiente durante cinco minutos. Cuente las células y calcule al menos 5 x 10 a las cinco células por cada mililitro de microgeles GelMA. Asigne el volumen requerido de la suspensión celular a un tubo y un pellet separados como se demostró anteriormente.Retire con cuidado la mayor cantidad posible de sobrenadante con una pipeta, dejando solo la bolita celular. Agregue el volumen requerido de suspensión de microgel al pellet y pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para garantizar una distribución uniforme. Cargue la suspensión de microgel cargada de células en un reactor utilizando una pipeta.Usando una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 23, deposite la tinta de hueso, entrecruze la célula y las construcciones de microgel GelMA cargadas de tinta ósea con una lámpara de reticulación UV a 405 nanómetros durante 90 segundos. Transfiera inmediatamente la suspensión de microgel a una placa de pozo del tamaño adecuado que contenga DMEM completo. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Reemplace el medio de cultivo después de 24 horas, luego cada 48 a 72 horas según sea necesario. La tinta ósea se analizó mediante microscopía electrónica de barrido para determinar su microestructura, que mostró la formación de cristal de hidroxiapatita después del ajuste de la tinta, particularmente visible en condiciones secas. En este estudio, las células se mezclaron con microgeles GelMA y se mantuvieron en cultivo durante un máximo de cinco días, ya sea solo en suspensión de microgel o en el sistema COBICS.Las células mostraron buena viabilidad en presencia de la tinta ósea, tanto en el día uno como en el día cinco, confirmando que los productos de lixiviación de la tinta no eran perjudiciales para las células. Es crucial controlar la velocidad de riego mientras se sintetiza microgel, ya que un ligero cambio de agitación puede causar diferencias de tamaño. También es importante asegurar una distribución homogénea de las células dentro de la suspensión de microgel.El mismo protocolo se puede utilizar para imprimir dentro de suspensiones de microgel de gelatina, que actúan como soportes de sacrificio, dejando atrás construcciones óseas independientes. Pero el uso de GelMA abre la vía para construcciones multifásicas de una olla, como las interfaces osteocondrales o tendinosas óseas.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generación de una tridimensional grosor de la piel completa y automatizada Equivalente Heridas

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Investigación

Bioingeniería

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Construye El uso de un Tejidos específicos de hidrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradiente de tensión Chip para estimulantes comportamientos celulares en hidrogel cargadas de celulares

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Técnica robótica automatizada de dispensación de Orientación de la superficie de las células y Bioprinting

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Vascularizado de Bioprinting de microfluidos para la ingeniería de tejidos y organitas

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting de cartílago y piel análogos de tejido utilizando un pasivo novela mezcla de unidad técnica de Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Modelo Calvarial de Aumento Óseo en Conejo para Evaluación del Crecimiento Óseo y Neovascularización en Materiales de Sustitución Ósea

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Bioink de matriz extracelular derivada del tejido pancreático para imprimir construcciones de tejido pancreático laden de células 3D

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Medición de la cinemática del hombro 3D in vivo mediante videorradiografía biplanar

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Bioimpresión 3D de astrocitos corticales murinos para la ingeniería de tejido neural

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...