Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Författarna vill erkänna National Health and Medical Research Council (Grant no. GNT1111694 och GNT1141602) och Australian Research Council (Grant no. FT180100417, FL150100060 och CE14100036). Författarna vill uppmärksamma den biomedicinska bildbehandlingsanläggningen vid University of New South Wales. Figurer skapades med Biorender.com, Adobe Photoshop och Adobe Illustrator och har exporterats under en betald prenumeration.

1. Tillverkning av benbläck
<ol><li>Syntes av α-tricalciumfosfat<ol><li>Väg upp kalciumvätefosfat (CaHPO4) och kalciumkarbonat (CaCO3) pulver i ett molförhållande på 3:2 Ca:P. Använd en spatel och homogenisera de två pulverna noggrant.</li>
		<li>Tillsätt kalciumvätefosfat-kalciumkarbonatpulverblandningen till en zirkoniumdegel så att den inte är mer än 75% full. OBS: För att undvika kontaminering, använd en ny degel eller en degel som tidigare använts för att...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

3D-utskriftstekniken COBICS utvecklades för att möjliggöra tillverkning av mineraliserade benliknande strukturer via extrudering till en tvärbindbar mikrogelsuspension innehållande levande celler. Tekniken har tillämpats på en nedbrytbar mikrogelsuspension, och celler visar god livskraft, spridning och osteogen differentieringsförmåga inom systemet11. En viktig faktor för framgången för konstruktioner som skapats med denna teknik är korrekt syntes av det α-TCP-baserade benbläcket. F...

Ben har anmärkningsvärda regenereringsförmågor som en av få strukturer i kroppen som kan läka genom att återskapa sin normala cellulära sammansättning, orientering och mekaniska styrka fram till en kritisk defektstorlek, när endogen läkningskapacitet äventyras1. Ben, tillsammans med brosk och ligament, stöder och underlättar kroppens rörelse, samtidigt som det lagrar mineraler och fetter och producerar blodkroppar. Som en hård, tät bindväv består ben huvudsakligen av en oorganisk fas, vatten och organiskt material som huvudsakligen består av kollagenfibrer2. Celler är inbäddade i denna mycket mineraliserade matris av kollagen I-fibrer och hydroxiapatitkristaller (HA) och bildar en hierarkisk struktur3.
Den komplexa organisationen av denna vävnad gör tillverkningen av syntetiska alternativ för att replikera de heterogena benmikro- och nanomiljöerna exceptionellt utmanande3. För detta ändamål har en mängd olika material, inklusive biokeramik, cellbelastade hydrogeler och syntetiska material föreslagits som lösningar för att skapa benmatriser. Bland byggnadsställningstillverkningsteknikerna har 3D-utskriftsbaserade tekniker nyligen dykt upp och fått mycket uppmärksamhet från vävnadstekniksamhället på grund av deras anmärkningsvärda förmåga att möjliggöra tillverkning av mycket sofistikerade och exakta strukturer med stort löfte om patientspecifik behandling 4,5,6 . Hydrogeler har varit det mest populära valet av matrishärmningar och biobläck eftersom de kan skrivas ut tillsammans med celler och bioaktiva molekyler, vilket genererar funktionella konstruktioner6. Hydrogeler saknar emellertid de funktionella egenskaperna hos ben, såsom mekanisk hållfasthet och en mycket förkalkad, oorganisk fas innehållande metaboliskt aktiva celler.
3D-tryckta keramiska byggnadsställningar kräver vanligtvis efterbehandlingssteg, inklusive sintring, högtemperaturbehandlingar eller användning av hårda kemikalier som måste tvättas noggrant före in vitro - eller in vivo-applikationer 5. För att ta itu med dessa begränsningar utvecklade Lode et al.7 nyligen en α-tricalciumfosfatbaserad pasta bildad av hydroxiapatit, som kan skrivas ut och ställas in under fysiologiska förhållanden. Detta material kan emellertid fortfarande inte skrivas ut tillsammans med levande celler eftersom det kräver efterbehandling i fuktig miljö och efterföljande nedsänkning av vattenlösning under en lång period.
Alternativt har cellbelastade hydrogeler med oorganiska partiklar införlivade föreslagits som ersättning för 3D-benmatris 8,9. Trots sin stora förmåga att stödja cellviabilitet kan de inte rekapitulera den tätt mineraliserade benvävnadsmiljön. Thrivikarman et al.10 antog ett biomimetiskt tillvägagångssätt där ett övermättat kalcium- och fosfatmedium användes med en icke-kollagenös proteinanalog för att bättre efterlikna apatitavsättningen i nanoskala. Men deras konstruktioner kan fortfarande inte generera styva 3D-konstruktioner med mikro- och makroskalaarkitektur som liknar ben.
Denna studie adresserar dessa brister genom utvecklingen av en tryckstrategi för att tillverka benliknande konstruktioner, i oorganiska och organiska faser, som kan integrera både celler och tillväxtfaktorer11. COBICS rekapitulerar unikt benets mineral- och cellstruktur med hjälp av en mikrogelbaserad bioprintningsteknik. Protokollet häri beskriver processen att syntetisera de keramiska benbläck- och gelatinbaserade mikrogelerna och sedan kombinera celler som möjliggör COBICS. Processen börjar med syntesen av benbläckets huvudsakliga prekursormaterial. Den tvärbindande hydrogelen syntetiseras sedan och formas till mikrogeler. Slutligen avsätts benbläcket rundstrålande i ett stödbad av mikrogelerna lastade med celler (figur 1).
Benbläcket kan skrivas ut i vilken suspension som helst av mikrogeler som har lämpliga utbytesspänningsegenskaper, det vill säga förmågan att fluidisera med en specifik skjuvhastighet och därefter stödja den avsatta strukturen. Två flexibla tillvägagångssätt har påvisats: en suspension bestående av gelatinmikrogeler och en suspension bestående av gelatinmetakrylatmikrogeler (GelMA). Den förstnämnda suspensionen löses upp när temperaturen höjs till 37 °C, den reversibla friformsinbäddningen av suspenderade hydrogeler (FRESH) teknik12, medan den senare kan fotokorskopplas efter utskrift, effektivt "sy" ihop mikrogelerna och låsa det tryckta benbläcket på plats. Den aktuella studien fokuserar på att använda GelMA som matris eftersom det ger den unika fördelen att kunna stödja celltillväxt med in situ-utskrift av komplexa benmimetiska strukturer. I slutändan möjliggör detta tillvägagångssätt generering av komplexa vävnadsmodeller med höga nivåer av biomimik och breda konsekvenser för sjukdomsmodellering, läkemedelsupptäckt och regenerativ teknik.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> Bild 1: Schematisk bild av arbetsflödet . (A) Ben-bläcket syntetiseras med utgångspunkt från α-tricalciumfosfatsyntes och dess efterföljande kombination med glycerol, polysorbat 80 och ammoniumfosfat dibasisk. (B) GelMA-mikrogeler tillverkas med vatten-i-olja-emulsionsmetoden. De erhållna mikrogelerna hydratiseras sedan (C) och (D) kombineras med celler. Cell-mikrogelkompositer används sedan som ett granulärt bad där benbläcket deponeras. (E) Hela konstruktionen är sedan UV-tvärbunden och överförs till inkubatorn för odling. Förkortningar: α-TCP = α-tricalciumfosfat; GelMA =gelatinmetakrylat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

Strukturellt är benvävnad en oorganisk-organisk komposit som innehåller metaboliskt aktiva celler inbäddade i en hierarkisk, mycket mineraliserad matris. Den här organisationen är utmanande att replikera på grund av den heterogena miljön i ben. Keramisk rundstrålande bioprinting i cellsuspensioner (COBICS) är en mikrogelbaserad bioprintningsteknik som unikt replikerar benets mineral- och cellstruktur. COBICS skriver ut komplexa, biologiskt relevanta konstruktioner utan behov av offerstödmaterial eller hårda efterbehandlingssteg (t.ex. strålning och högtemperatursintring), som är två av de största utmaningarna vid additiv tillverkning av benmimetiska konstruktioner. Denna teknik möjliggörs genom friformsextrudering av ett nytt kalciumfosfatbaserat bläck i en gelatinbaserad mikrogelsuspension. Suspensionens utbytesspänningsegenskaper möjliggör avsättning och stöder den tryckta benstrukturen. UV-tvärbindning och nanoprecipitation "låser" den sedan på plats. Förmågan att skriva ut nanostrukturerad benmimetisk keramik i cellbelastade biomaterial ger spatiotemporal kontroll över makro- och mikroarkitektur och underlättar tillverkning i realtid av komplexa benkonstruktioner i kliniska miljöer.

COBICS skriver ut komplexa, biologiskt relevanta konstruktioner utan behov av offerstödmaterial eller hårda efterbehandlingssteg (t.ex. strålning och högtemperatursintring) som är två av de största utmaningarna vid additiv tillverkning av benmimetiska konstruktioner. För att demonstrera COBICS-bildning av komplexa benstrukturer och samtryck av celler i mikrogelsuspensioner togs representativa bilder av benliknande kompositer gjorda av benbläcket och en semikvantitativ analys av ADSC-viabilitet i COBICS i upp til...

Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Detta protokoll beskriver en 3D-utskriftsteknik för att tillverka benliknande strukturer genom att deponera ett kalciumfosfatbläck i ett gelatinbaserat granulärt stöd. Tryckta benanaloger deponeras i friform, med flexibilitet för direkt skörd av utskriften eller tvärbindningen i en levande cellmatris för multifasiska konstruktioner.

Keramisk rundstrålande bioprinting i cellbelastade suspensioner för generering av benanaloger

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Detta protokoll tillåter tillverkning av benanaloger utan att kräva uppvärmning eller giftiga kemikalier. På detta sätt bildas benstrukturer med potential att reparera en bendefekt i kliniska miljöer med hjälp av patientens egna celler. Den största fördelen med tekniken är att benbläcket kan skrivas ut med levande celler för att bilda vilken komplex benliknande struktur som helst och för att rikta differentiering mot benbildande härstamning.Vidare kan läkemedel laddas i benbläcket för att samtidigt förbättra sårläkning, benregenerering och för att behandla patologier som cancer. Att demonstrera proceduren kommer att vara Gagan Jalandhra, doktorand i mitt laboratorium, och Dr.Sara Romanazzo, som har arbetat med mig och Dr.Jalandhra på olika projekt, inklusive utveckling av denna teknik. Börja med att tillsätta kalciumvätefosfat och kalciumkarbonatpulverblandning till en zirkoniumdegel så att den inte är mer än 75% full.Överför degeln till en ugn, värm den till 1 400 grader Celsius med en hastighet av fem grader Celsius per minut och håll i tre timmar. Släck reaktionen genom att ta bort degeln från ugnen och lämna på toppen av eldfast block. Låt den svalna helt innan du hanterar den.Använd en mortel och stöt för att bryta och slipa alfa-tricalciumfosfatkakan så att de resulterande granulerna har en maximal storlek på 200 mikrometer. Tillsätt tre millimeter yttriastabiliserade zirkoniumkulor till den slipade blandningen, följt av 100% etanol. Säkra locket och slipa i två timmar vid 180 varv per minut.Samla suspensionen och separera bollarna med 100% etanol för tvätt. Torka suspensionen i en ugn vid 120 grader Celsius i 24 timmar. Tillsätt det torkade pulvret i fräsburkarna med en millimeter zirkoniumkulor och 100% etanol i samma viktförhållanden som i det första steget.Slipa i två timmar vid 180 varv per minut. Separera sedan och torka i ugnen. Ta ut provet ur ugnen.För att göra benbläcket, tillsätt 630 mikroliter glycerol och 130 mikroliter polysorbat 80 till en bollmilburk. Tillsätt sedan 100 milligram ammoniumfosfatdibasiskt och två gram alfa-trikalciumfosfatpulver till lösningen och rör om kontinuerligt med en spatel för att kombinera. Tillsätt en 25 millimeter zirkoniumoxidkula, säkra locket och placera det i en planetkvarn i 60 minuter vid 180 varv per minut, pausa halvvägs för att skrapa ner sidorna på burken med en spatel med en spatel.Ladda bläcket i en en milliliter spruta. Gör en 10% lösning av gelatin typ A i 1X PBS enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Placera den koniska kolven på omröraren.Tillsätt sedan 5.796 ml metakrylanhydrid och fortsätt omrörningen i mörkret vid 50 grader Celsius i 90 minuter. Släck reaktionen genom att späda ut innehållet i de E-kolvar två gånger med PBS. Dekantera i 50 ml rör och ta bort den oreagerade metakrylanhydriden genom centrifugering vid 3000 RCF vid rumstemperatur i tre minuter och samla supernatanten.Dialysera supernatanten inuti 14 kilodalton avskurna cellulosadialysrör mot avjoniserat vatten vid 40 grader Celsius i fem dagar under försiktig omrörning. Byt ut det avjoniserade vattnet varje dag. Förbered för förvaring genom att dekantera i 50 ml rör, säkra locket och placera det i kylskåpet i 12 timmar.Frys sedan proverna med flytande kväve och frystorka omedelbart i fem dagar vid minus 54 grader Celsius och 0,4 millibar. Förvara det resulterande skummet i en frys vid minus 20 grader Celsius. För att syntetisera GelMA-mikrogeler, gör en 10% vikt i vikt GelMA-lösning i PBS genom att väga den frystorkade GelMA, tillsätt den till ett rör med PBS och värm i ett vattenbad vid 50 grader Celsius tills den är helt hydratiserad.Tillsätt 37 ml olja per en milliliter GelMA-lösning till en bägare, så att den inte är mer än 65% full. Sätt upp ett dubbelbägaresystem på en värmeplatta med magnetisk omrörning genom att placera bägaren som innehåller olja i en större bägare. Värm till 40 grader Celsius under omrörning.Ladda GelMA-lösningen i en spruta och tillsätt den droppvis i omrörningsoljan genom ett 0,45 mikrometerfilter. Låt emulsionen balansera i 10 minuter. Sänk emulsionens temperatur till 15 grader Celsius till termiskt.Stabilisera sfärerna genom att lägga till krossad is i utrymmet mellan de två bägarna. Tillsätt aceton till den snurrande GelMA-emulsionen. Dekantera innehållet i bägaren i 50 ml rör, se till att tvätta bägarens väggar med aceton.Låt den vila i 20 minuter så att de uttorkade mikrogelerna sätter sig i botten. Kassera supernatanten och tvätta mikrogelerna två gånger med aceton. Konsolidera i ett rör, fyll på med aceton och sonika i 10 sekunder.Tvätta den igen med aceton två gånger. Förvara i aceton vid rumstemperatur tills det behövs för utskrift. För att förbereda GelMA-mikrogelsuspensionen för tryckning, formulera en 1% viktlösning av GelMA i DMEM enligt beskrivningen i textmanuskriptet.Indunsta acetonen från de uttorkade mikrogelerna och väg det resulterande pulvret i ett rör. Tillsätt aceton och överför till en steril miljö. För att bilda mikrogelsuspensionen, förånga acetonen från pulvret inuti biosäkerhetsskåpet.Efter avdunstning, tillsätt DMEM, 1% GelMA-lösning i DMEM och 2,5% LAP-initiatorlösning för att uppnå en slutlig förpackningsfraktion på 30% Låt hydrera helt i minst 12 timmar vid rumstemperatur. Odling av fett-härledda mesenkymala stamceller i låg glukos DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% penicillin-streptomycin vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid tills sammanflytande. Ta bort de fettbaserade mesenkymala stamcellerna från vävnadskolven genom att avlägsna mediet och tvätta med steril PBS.Pelletera cellerna genom att centrifugera vid 150 RCF vid rumstemperatur i fem minuter. Räkna cellerna och beräkna minst 5 x 10 till de fem cellerna för varje milliliter GelMA-mikrogeler. Fördela den erforderliga volymen av cellsuspensionen till ett separat rör och pellet som visats tidigare.Ta försiktigt bort så mycket supernatant som möjligt med en pipett och lämna endast cellpelleten. Tillsätt önskad volym mikrogelsuspension till pelleten och pipettera försiktigt upp och ner för att säkerställa jämn fördelning. Ladda den cellbelastade i mikrogelsuspension i en reaktor med hjälp av en pipett.Använd en enmilliliters spruta försedd med en 23 gauge nål, deponera benbläcket, tvärbinda cellen och benbläck lastad GelMA mikrogel konstruerar med en UV-tvärbindningslampa vid 405 nanometer i 90 sekunder. Överför omedelbart mikrogelsuspensionen till en brunnsplatta av lämplig storlek som innehåller komplett DMEM. Inkubera vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid.Byt ut odlingsmediet efter 24 timmar, sedan var 48: e till 72: e timme efter behov. Benbläcket analyserades genom svepelektronmikroskopi för att bestämma dess mikrostruktur, vilket visade bildandet av hydroxiapatitkristall efter bläckinställning, särskilt synlig under torra förhållanden. I denna studie blandades celler med GelMA-mikrogeler och hölls i odling i upp till fem dagar, antingen endast i mikrogelsuspension eller i COBICS-systemet.Cellerna visade god livskraft i närvaro av benbläcket, både på dag ett och dag fem, vilket bekräftade att bläckets utlakningsprodukter inte var skadliga för cellerna. Det är viktigt att kontrollera stigbygelhastigheten medan du syntetiserar mikrogel eftersom en liten förändring omrörning kan orsaka storleksskillnader. Det är också viktigt att säkerställa homogen fördelning av cellerna inom mikrogelsuspension.Samma protokoll kan användas för att skriva ut inuti gelatinmikrogelsuspensioner, som fungerar som offerstöd och lämnar efter sig fristående benkonstruktioner. Men med hjälp av GelMA öppnas avenyn för en kruka multifasiska konstruktioner, såsom osteokondrala eller bensengränssnitt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Generering av ett tredimensionellt Full Tjocklek hudekvivalent och automatiserade sårar

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting Cellularized Konstrukt användning av en vävnadsspecifik Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Gradient stam Chip för stimulera cellulära beteenden i Cell-lastad Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Automatiserad Robotic Doserings Teknik för Surface utvecklings- och Bioprinting av celler

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Simuleras Bioprinting för Engineering vaskulariserad vävnad och Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting av brosk och hud vävnad analoger utnyttja en roman passiv enhet blandningsteknik för Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Calvarial modell av ben förstärkning i kanin för bedömning av bentillväxt och kärlnybildning i ben ersättning material

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

Pankreasvävnad-härledda extracellulära matrix Bioink för utskrift 3D cell-lastat Pankreasvävnad konstruktioner

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Mätning av 3D In-vivo Shoulder Kinemas med biplanar videoradiografi

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

3D Bioprinting av Murine Cortical Astrocytes för engineering neural-liknande vävnad

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...