Name: ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs
Uploaded: 2022-08-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Yazarlar, Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi'ne (Hibe no. GNT1111694 ve GNT1141602) ve Avustralya Araştırma Konseyi'ne (Hibe no. FT180100417, FL150100060 ve CE14100036) teşekkür etmek istemektedir. Yazarlar, New South Wales Üniversitesi'ndeki Biyomedikal Görüntüleme Tesisi'ne teşekkür etmek istiyor. Rakamlar Biorender.com, Adobe Photoshop ve Adobe Illustrator ile oluşturulmuştur ve ücretli bir abonelik altında dışa aktarılmıştır.

1. Kemik-mürekkep üretimi
<ol><li>α-trikalsiyum fosfat sentezi<ol><li>Kalsiyum hidrojen fosfat (CaHPO4) ve kalsiyum karbonat (CaCO 3) tozlarını3:2 Ca:P molar oranında tartın. Bir spatula kullanarak, iki tozu iyice homojenize edin.</li>
		<li>Kalsiyum hidrojen fosfat-kalsiyum karbonat tozu karışımını bir zirkonya potasına% 75'ten fazla dolu olmayacak şekilde ekleyin. NOT: Kirlenmeyi önlemek için, aynı malzemeyi yapmak için daha önce kullanılmış yeni bir pot...

<ol>
	<li>Bates, P., Ramachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+injury,+healing+and+grafting.">Bone injury, healing and grafting.</a> Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bone+extracellular+matrix+in+bone+formation+and+regeneration.">The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration.</a> Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).</li><li>Reznikov, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+materials+science+vision+of+extracellular+matrix+mineralization.">A materials science vision of extracellular matrix mineralization.</a> Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).</li><li>Kang, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+bioprinting+system+to+produce+human-scale+tissue+constructs+with+structural+integrity.">A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity.</a> Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).</li><li>Lin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+printing+of+bioceramic+scaffolds-Barriers+to+the+clinical+translation:+From+promise+to+reality,+and+future+perspectives.">3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives.</a> Materials. 12 (17), 2660 (2019).</li><li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-dimensional+printing+for+bone+tissue+engineering.">Multi-dimensional printing for bone tissue engineering.</a> Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).</li><li>Lode, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+porous+scaffolds+by+three-dimensional+plotting+of+a+pasty+calcium+phosphate+bone+cement+under+mild+conditions.">Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).</li><li>Bernal, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Volumetric+bioprinting+of+complex+living-tissue+constructs+within+seconds.">Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds.</a> Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).</li><li>Diloksumpan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+multi-scale+3D+printing+technologies+to+engineer+reinforced+hydrogel-ceramic+interfaces.">Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces.</a> Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).</li><li>Thrivikraman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+fabrication+of+vascularized+and+innervated+cell-laden+bone+models+with+biomimetic+intrafibrillar+collagen+mineralization.">Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization.</a> Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).</li><li>Romanazzo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+bone-like+structures+through+omnidirectional+ceramic+bioprinting+in+cell+suspensions.">Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions.</a> Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).</li><li>Hinton, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+printing+of+complex+biological+structures+by+freeform+reversible+embedding+of+suspended+hydrogels.">Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels.</a> Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).</li><li>Phromsopha, T., Baimark, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+starch/gelatin+blend+microparticles+by+a+water-in-oil+emulsion+method+for+controlled+release+drug+delivery.">Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery.</a> International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).</li><li>Moreno, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-state+synthesis+of+alpha+tricalcium+phosphate+for+cements+used+in+biomedical+applications.">Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications.</a> Bolet&#237;n de la Sociedad Espa&#241;ola de Cer&#225;mica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).</li></ol>

3D baskı tekniği COBICS, mineralize kemik benzeri yapıların ekstrüzyon yoluyla canlı hücreler içeren çapraz bağlanabilir bir mikrojel süspansiyonuna üretilmesini sağlamak için geliştirilmiştir. Teknik, parçalanabilir bir mikrojel süspansiyonuna uygulanmıştır ve hücreler sistem içinde iyi canlılık, yayılma ve osteojenik farklılaşma yeteneği gösterir11. Bu teknik kullanılarak oluşturulan yapıların başarısının önemli bir belirleyicisi, α-TCP tabanlı kemik mür...

Kemik, endojen iyileşme kapasitesinin tehlikeye girdiği kritik bir kusur boyutuna kadar normal hücresel bileşimini, oryantasyonunu ve mekanik gücünü yeniden yaratarak iyileşebilen vücuttaki birkaç yapıdan biri olarak olağanüstü rejenerasyon yeteneklerine sahiptir1. Kemik, kıkırdak ve bağ ile birlikte, vücut hareketini destekler ve kolaylaştırırken, aynı zamanda mineralleri ve yağları depolar ve kan hücreleri üretir. Sert, yoğun bir bağ dokusu olarak, kemik esas olarak inorganik bir fazdan, sudan ve esas olarak kollajen liflerinden oluşan organik malzemedenoluşur 2. Hücreler, kollajen I liflerinin ve hidroksiapatit (HA) kristallerinin bu yüksek mineralize matrisine gömülür ve hiyerarşik bir yapı oluşturur3.
Bu dokunun karmaşık organizasyonu, heterojen kemik mikro ve nano ortamlarını çoğaltmak için sentetik alternatiflerin üretilmesini son derece zorluhale getirir 3. Bu amaçla, biyoseramikler, hücre yüklü hidrojeller ve sentetik malzemeler de dahil olmak üzere çeşitli malzemeler, kemik matrisleri oluşturmak için çözümler olarak önerilmiştir. İskele imalat teknikleri arasında, 3D baskı tabanlı teknikler son zamanlarda ortaya çıkmış ve hastaya özgü tedavi vaadi ile son derece sofistike ve hassas yapıların üretilmesine izin verme konusundaki olağanüstü yetenekleri nedeniyle doku mühendisliği topluluğundan çok dikkat çekmiştir 4,5,6 . Hidrojeller, matris taklitlerinin ve biyo-mürekkeplerin en popüler seçimi olmuştur, çünkü hücreler ve biyoaktif moleküllerle birlikte basılabildikleri için fonksiyonel yapılar oluştururlar6. Bununla birlikte, hidrojeller, mekanik mukavemet ve metabolik olarak aktif hücreler içeren yüksek kalsifiye, inorganik bir faz gibi kemiğin fonksiyonel özelliklerinden yoksundur.
3D baskılı seramik iskeleler tipik olarak sinterleme, yüksek sıcaklık işlemleri veya in vitro veya in vivo uygulamalardan önce iyice yıkanması gereken sert kimyasalların kullanılması dahil olmak üzere işlem sonrası adımlar gerektirir5. Bu sınırlamaları ele almak için, Lode ve ark.7 yakın zamanda hidroksiapatit tarafından oluşturulan, fizyolojik koşullar altında basılabilen ve ayarlanabilen α-trikalsiyum fosfat bazlı bir macun geliştirdi. Bununla birlikte, bu malzeme nemli bir ortamda işlem sonrası işlem ve ardından uzun süre sulu çözelti daldırma gerektirdiğinden canlı hücrelerle birlikte basılamaz.
Alternatif olarak, inorganik parçacıkların dahil edildiği hücre yüklü hidrojeller, 3D kemik matrisi 8,9'un yerine önerilmiştir. Hücre canlılığını destekleme konusundaki büyük yeteneklerine rağmen, yoğun mineralize kemik dokusu ortamını özetleyemezler. Thrivikarman ve ark.10, nano ölçekli apatit birikimini daha iyi taklit etmek için kollajenöz olmayan bir protein analoğu ile aşırı doymuş bir kalsiyum ve fosfat ortamının kullanıldığı biyomimetik bir yaklaşım benimsemiştir. Bununla birlikte, yapıları hala kemiğe benzeyen mikro ve makro ölçekli mimariye sahip katı 3B yapılar üretemez.
Bu çalışma, bu eksiklikleri, hem hücreleri hem de büyüme faktörlerini entegre edebilen inorganik ve organik fazlarda kemik taklit eden yapılar üretmek için bir baskı stratejisinin geliştirilmesi yoluyla ele almaktadır11. COBICS, mikrojel bazlı bir biyobaskı tekniği kullanarak kemiğin mineral ve hücresel yapısını benzersiz bir şekilde özetler. Buradaki protokol, seramik kemik mürekkebi ve jelatin bazlı mikrojellerin sentezlenmesi ve daha sonra COBICS'i etkinleştiren hücrelerin birleştirilmesi sürecini açıklamaktadır. İşlem, kemik mürekkebinin ana öncü malzemesinin sentezi ile başlar. Çapraz bağlanabilir hidrojel daha sonra sentezlenir ve mikrojeller halinde oluşturulur. Son olarak, kemik mürekkebi, hücrelerle yüklü mikrojellerin bir destek banyosunda çok yönlü olarak biriktirilir (Şekil 1).
Kemik mürekkebi, uygun akma gerilmesi özelliklerine sahip mikrojellerin herhangi bir süspansiyonuna, yani belirli bir kesme hızında akışkanlaştırma ve daha sonra biriken yapıyı destekleme yeteneğine sahip herhangi bir süspansiyona basılabilir. İki esnek yaklaşım gösterilmiştir: jelatin mikrojellerinden oluşan bir süspansiyon ve jelatin metakrilat (GelMA) mikrojellerinden oluşan bir süspansiyon. İlk süspansiyon, sıcaklık 37 ° C'ye yükseltildiğinde çözülür, askıya alınmış hidrojellerin (FRESH) serbest biçimli geri dönüşümlü gömülmesi tekniği12, ikincisi ise baskıdan sonra fotoçapraz bağlanabilir, mikrojelleri etkili bir şekilde "diker" ve basılı kemik mürekkebini yerine kilitler. Bu çalışma, karmaşık kemik mimetik yapılarının in situ baskısı ile hücre büyümesini destekleyebilmenin eşsiz avantajını sağladığı için GelMA'yı matris olarak kullanmaya odaklanmaktadır. Nihayetinde, bu yaklaşım, yüksek düzeyde biyomimikri ve hastalık modellemesi, ilaç keşfi ve rejeneratif mühendislik için geniş etkileri olan karmaşık doku modellerinin üretilmesini sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63943/63943fig01.jpg"> Şekil 1: İş akışının şeması . (A) Kemik mürekkebi, α-trikalsiyum fosfat sentezinden ve ardından gliserol, polisorbat 80 ve amonyum fosfat dibazik ile kombinasyonundan başlayarak sentezlenir. (B) GelMA mikrojelleri, yağda su emülsiyonu yöntemi ile üretilir. Elde edilen mikrojeller daha sonra (C) hidratlanır ve (D) hücrelerle birleştirilir. Hücre-mikrojel kompozitler daha sonra kemik-mürekkebin biriktirildiği granüler bir banyo olarak kullanılır. (E) Tüm yapı daha sonra UV çapraz bağlanır ve kültür için inkübatöre aktarılır. Kısaltmalar: α-TCP = α-trikalsiyum fosfat; GelMA = jelatin metakrilat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63943/63943fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3D Printer Extruder</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td>EMO-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>BDAA352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute Ethanol 100% Denatured</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>154871</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alumina crucible</td>
			<td>Coors</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A5764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autodesk Fusion 360</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet level 2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>239216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flasks</td>
			<td>Corning</td>
			<td></td>
			<td>various volumes used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5430R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3-16KL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispensing Tip, 23 G</td>
			<td>Nordson</td>
			<td>7018302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>11885084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elevator furnace</td>
			<td>Labec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Engine HR Multihead Printer</td>
			<td>Hyrel3D</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin type A, from porcine skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General Purpose Stainless Steel Tips</td>
			<td>Nordson EF</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human adipose derived stem cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-500-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal Microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus)</td>
			<td>Christ</td>
			<td>101541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic hot plate and stirrer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic anhydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>276685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini 2 Desktop 3D Printer</td>
			<td>LulzBot</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm sealing film</td>
			<td>Parafilm</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Planetary ball mill jar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Science Kimwipes Delicate Task Wipers</td>
			<td>Kimtech</td>
			<td>18813156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless steel standard test sieve</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunflower Oil</td>
			<td>Community Co</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA 0.25% phenol red</td>
			<td>Thermo FIsher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Microscope Software</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, low glucose, no phenol red </td>
			
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11054020</td>
<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ceramic omnidirectional bioprinting in cell-laden suspensions for the generation of bone analogs

Yapısal olarak, kemik dokusu, hiyerarşik, yüksek mineralize bir matris içine gömülü metabolik olarak aktif hücreler içeren inorganik-organik bir kompozittir. Bu organizasyonun, kemiğin heterojen ortamı nedeniyle çoğaltılması zordur. Hücre süspansiyonlarında seramik çok yönlü biyobaskı (COBICS), kemiğin mineral ve hücresel yapısını benzersiz bir şekilde kopyalayan mikrojel bazlı bir biyobaskı tekniğidir. COBICS, kemik mimetik yapılarının eklemeli üretimindeki en büyük zorluklardan ikisi olan fedakarlık destek malzemelerine veya zorlu son işlem adımlarına (örneğin, radyasyon ve yüksek sıcaklıkta sinterleme) ihtiyaç duymadan karmaşık, biyolojik olarak ilgili yapıları yazdırır. Bu teknik, jelatin bazlı bir mikrojel süspansiyon içinde yeni bir kalsiyum fosfat bazlı mürekkebin serbest biçimli ekstrüzyonu yoluyla sağlanır. Süspansiyonun akma gerilme özellikleri, birikmeye izin verir ve basılan kemik yapısını destekler. UV çapraz bağlama ve nanoçökeltme daha sonra yerine "kilitleyin". Hücre yüklü biyomalzemeler içinde nanoyapılı kemik-mimetik seramikler basma yeteneği, makro ve mikro mimari üzerinde mekansal zamansal kontrol sağlar ve klinik ortamlarda karmaşık kemik yapılarının gerçek zamanlı olarak üretilmesini kolaylaştırır.

COBICS, kemik mimetik yapılarının katkısal üretimindeki en büyük zorluklardan ikisi olan fedakarlık destek malzemelerine veya zorlu son işlem adımlarına (örneğin, radyasyon ve yüksek sıcaklıkta sinterleme) ihtiyaç duymadan karmaşık, biyolojik olarak ilgili yapıları yazdırır. Karmaşık kemik yapılarının COBICS oluşumunu ve mikrojel süspansiyonlardaki hücrelerin birlikte baskılanmasını göstermek için, kemik-mürekkepten yapılmış kemik benzeri kompozitlerin temsili görüntüleri alınd...

Watch this Scientific Journal Video about Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs at JoVE.com

Ceramic Omnidirectional Bioprinting in Cell-Laden Suspensions for the Generation of Bone Analogs

Bu protokol, jelatin bazlı granüler bir destekte bir kalsiyum fosfat mürekkebi biriktirerek kemik benzeri yapılar üretmek için bir 3D baskı tekniğini açıklar. Baskılı kemik analogları, baskının doğrudan toplanması veya multifazik yapılar için canlı bir hücre matrisi içinde çapraz bağlanma esnekliği ile serbest formda biriktirilir.

Kemik Analoglarının Üretimi için Hücre Yüklü Süspansiyonlarda Seramik Çok Yönlü Biyobaskı

Structurally, bone tissue is an inorganic-organic composite containing metabolically active cells embedded within a hierarchical, highly mineralized ...

Bu protokol, ısıtma veya toksik kimyasallar gerektirmeden kemik analoglarının üretilmesine izin verir. Bu şekilde, hastanın kendi hücrelerini kullanarak klinik ortamlarda bir kemik defektini onarma potansiyeli olan kemik yapıları oluşturulur. Tekniğin temel avantajı, kemik mürekkebinin herhangi bir karmaşık kemik benzeri yapı oluşturmak ve farklılaşmayı kemik oluşturan soya doğru yönlendirmek için canlı hücrelerle basılabilmesidir.Ayrıca, ilaçlar aynı anda yara iyileşmesini, kemik yenilenmesini arttırmak ve kanser gibi patolojileri tedavi etmek için kemik mürekkebine yüklenebilir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımda doktora adayı olan Gagan Jalandhra ve bu teknolojinin geliştirilmesi de dahil olmak üzere çeşitli projelerde benimle ve Dr. Jalandhra ile birlikte çalışan Dr. Sara Romanazzo olacak. Kalsiyum hidrojen fosfat ve kalsiyum karbonat tozu karışımını bir zirkonya potasına% 75'ten fazla dolu olmayacak şekilde ekleyerek başlayın.Potayı bir fırına aktarın, dakikada beş santigrat derece hızla 1.400 santigrat dereceye ısıtın ve üç saat bekletin. Potayı fırından çıkararak ve refrakter bloğun tepesinde bırakarak reaksiyonu söndürün. Kullanmadan önce tamamen soğumasını bekleyin.Alfa-trikalsiyum fosfat kekini kırmak ve öğütmek için bir harç ve havane kullanın, böylece elde edilen granüller maksimum 200 mikrometre büyüklüğüne sahip olacaktır. Öğütülmüş karışıma üç milimetre ittria stabilize zirkonya topu ekleyin, ardından% 100 etanol ekleyin. Kapağı sabitleyin ve dakikada 180 dönüşte iki saat boyunca taşlayın.Süspansiyonu toplayın ve yıkama için% 100 etanol kullanarak topları ayırın. Süspansiyonu 24 saat boyunca 120 santigrat derecede bir fırında kurutun. Kurutulmuş tozu öğütme kavanozlarına bir milimetre zirkonya bilyesi ve %100 etanol ile ilk aşamada olduğu gibi aynı ağırlık oranlarında ekleyin.Dakikada 180 dönüşte iki saat boyunca öğütün. Daha sonra fırında ayırın ve kurutun. Numuneyi fırından çıkarın.Kemik-mürekkebi yapmak için, bir top mil kavanoza 630 mikrolitre gliserol ve 130 mikrolitre polisorbat 80 ekleyin. Daha sonra çözeltiye 100 miligram amonyum fosfat dibazik ve iki gram alfa-trikalsiyum fosfat tozu ekleyin ve birleştirmek için bir spatula ile sürekli karıştırın. 25 milimetrelik bir zirkonya topu ekleyin, kapağı sabitleyin ve dakikada 180 dönüşte 60 dakika boyunca bir planet değirmenin içine yerleştirin, kavanozun kenarlarını spatula kullanarak bir spatula ile kazımak için yarıya kadar durun.Mürekkebi bir mililitrelik bir şırıngaya yükleyin. Metin makalesinde açıklandığı gibi 1X PBS'de% 10'luk bir jelatin tip A çözeltisi yapın. Konik şişeyi karıştırıcının üzerine yerleştirin.Daha sonra 5.796 mililitre metakrilik anhidrit ekleyin ve karanlıkta 90 dakika boyunca 50 santigrat derecede karıştırmaya devam edin. Konik şişe içeriğini PBS ile iki kat seyrelterek reaksiyonu söndürün. 50 mililitrelik tüplere boşaltın ve reaksiyona girmemiş metakrilik anhidriti oda sıcaklığında 3000 RCF'de santrifüjleme ile üç dakika boyunca çıkarın ve süpernatanı toplayın.14 kilodalton kesilmiş selüloz diyaliz tüplerinin içindeki süpernatantı beş gün boyunca 40 santigrat derecede deiyonize suya karşı hafifçe karıştırırken diyalize edin. Deiyonize suyu her gün değiştirin. 50 mililitrelik tüplere boşaltarak, kapağı sabitleyerek ve 12 saat boyunca buzdolabına koyarak depolamaya hazırlanın.Daha sonra numuneleri sıvı azot kullanarak dondurun ve eksi 54 santigrat derece ve 0.4 milibarda beş gün boyunca hemen liyofilize edin. Elde edilen köpüğü eksi 20 santigrat derecede bir dondurucuda saklayın. GelMA mikrojellerini sentezlemek için, liyofilize GelMA'yı tartarak, PBS'li bir tüpe ekleyerek ve tamamen nemlendirilene kadar 50 santigrat derecede bir su banyosunda ısıtarak PBS'de ağırlıkça% 10'luk bir GelMA çözeltisi yapın.Bir beher'e bir mililitre GelMA çözeltisi başına 37 mililitre yağ ekleyin ve% 65'ten fazla dolu olmadığından emin olun. Yağ içeren beheri daha büyük bir beherin içine yerleştirerek manyetik karıştırmalı bir sıcak plaka üzerine çift beher sistemi kurun. Karıştırırken 40 santigrat dereceye ısıtın.GelMA çözeltisini bir şırıngaya yükleyin ve 0.45 mikrometrelik bir filtreden karıştırma yağına damla damla ekleyin. Emülsiyonun 10 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Emülsiyonun sıcaklığını termal olarak 15 santigrat dereceye düşürün.İki beher arasındaki boşluğa ezilmiş buz ekleyerek küreleri stabilize edin. Eğirme GelMA emülsiyonuna aseton ekleyin. Beherin içeriğini 50 mililitrelik tüplere boşaltın, beherin duvarlarını asetonla yıkadığınızdan emin olun.Susuz mikro jellerin dibe çökmesine izin vermek için 20 dakika dinlendirin. Süpernatantı atın ve mikrojelleri asetonla iki kez yıkayın. Tek bir tüpte birleştirin, asetonla doldurun ve 10 saniye boyunca sonikasyon yapın.Yine, iki kez asetonla yıkayın. Baskı için gerekli olana kadar oda sıcaklığında asetonda saklayın. GelMA mikrojel süspansiyonunu baskıya hazırlamak için, metin makalesinde açıklandığı gibi DMEM'de ağırlıkça %1'lik bir GelMA çözeltisi formüle edin.Asetonu kurutulmuş mikrojellerden buharlaştırın ve elde edilen tozu bir tüpe tartın. Aseton ekleyin ve steril bir ortama aktarın. Mikrojel süspansiyonunu oluşturmak için, asetonu biyogüvenlik kabini içindeki tozdan buharlaştırın.Evaporasyondan sonra,% 30'luk bir son ambalaj fraksiyonu elde etmek için DMEM,% 1 GelMA çözeltisi ve% 2.5 LAP başlatıcı çözeltisi ekleyin Oda sıcaklığında en az 12 saat boyunca tamamen hidratasyona izin verin. Düşük glukoz DMEM'deki adipoz kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin, 37 santigrat derecede %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ve birleşene kadar %5 karbondioksit ile desteklendiği kültür. Yağ türevi mezenkimal kök hücreleri, ortamı çıkararak ve steril PBS ile yıkayarak doku kültürü şişesinden çıkarın.Hücreleri oda sıcaklığında 150 RCF'de beş dakika boyunca santrifüj yaparak toplayın. Hücreleri sayın ve her mililitre GelMA mikrojeli için beş hücreye en az 5 x 10 hesaplayın. Hücre süspansiyonunun gerekli hacmini daha önce gösterildiği gibi ayrı bir tüp ve pelete ayırın.Bir pipet kullanarak mümkün olduğunca fazla süpernatantı dikkatlice çıkarın ve sadece hücre peletini bırakın. Pelet üzerine gerekli miktarda mikrojel süspansiyon ekleyin ve eşit dağılımı sağlamak için yavaşça yukarı ve aşağı pipet uygulayın. Mikrojel süspansiyondaki hücre yüklüyü pipet kullanarak bir reaktöre yükleyin.23 gauge iğne ile donatılmış bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, kemik mürekkebini biriktirin, hücreyi çapraz bağlayın ve kemik-mürekkep yüklü GelMA mikrojeli, 90 saniye boyunca 405 nanometrede bir UV çapraz bağlayıcı lamba ile inşa edilir. Mikrojel süspansiyonunu derhal tam DMEM içeren uygun boyutta bir kuyu plakasına aktarın. 37 santigrat derecede ve % 5 karbondioksitte inkübe edin.Kültür ortamını 24 saat sonra, daha sonra gerektiği gibi her 48 ila 72 saatte bir değiştirin. Kemik mürekkebi, özellikle kuru koşullarda görülebilen mürekkep ayarından sonra hidroksiapatit kristalinin oluşumunu gösteren mikro yapısını belirlemek için taramalı elektron mikroskobu ile analiz edildi. Bu çalışmada, hücreler GelMA mikrojelleri ile karıştırıldı ve sadece mikro jel süspansiyonunda veya COBICS sisteminde beş güne kadar kültürde tutuldu.Hücreler, kemik mürekkebinin varlığında, hem birinci hem de beşinci günde, mürekkebin sızıntı ürünlerinin hücrelere zararlı olmadığını doğrulayan iyi bir canlılık gösterdi. Mikrojeli sentezlerken karıştırma hızını kontrol etmek çok önemlidir, çünkü karıştırma küçük bir değişiklik boyut farklılıklarına neden olabilir. Mikrojel süspansiyonu içindeki hücrelerin homojen dağılımını sağlamak da önemlidir.Aynı protokol, bağımsız kemik yapılarını geride bırakarak kurban desteği görevi gören jelatin mikrojel süspansiyonların içine baskı yapmak için de kullanılabilir. Ancak GelMA'yı kullanmak, osteokondral veya kemik tendon arayüzleri gibi bir pot multifazik yapı için yol açar.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting cellularized dokuya özel Hidrojel Bioink kullanılarak dahil edilmesi

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Hücre yüklü hidrojel uyarıcı hücresel davranışları için degrade zorlanma çip

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Calvarial Model of Bone Augmentation in Rabbit for Assessment of Bone Growth and Neovascularization in Bone Substitution Materials

Kemik İkmal Malzemelerinde Kemik Büyümesi ve Neaskülarizasyonunun Değerlendirilmesi İçin Tavşanda Kemik Büyütmenin Kalvarial Modeli

The basic principle of the rabbit calvarial model is to grow new bone tissue vertically on top of the cortical part of the skull. This model allows ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

3D Hücre Yüklü Pankreas Dokusu Yapıları Baskı için Pankreas Doku Türetilmiş Ekstrasellüler Matrix Bioink

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Measuring 3D In-vivo Shoulder Kinematics using Biplanar Videoradiography

Biplanar Videoradyografi kullanarak 3D In-vivo Omuz Kinematik ölçümü

The shoulder is one of the human body's most complex joint systems, with motion occurring through the coordinated actions of four individual joints, ...

3D Bioprinting of Murine Cortical Astrocytes for Engineering Neural-Like Tissue

Mühendislik Nöral Benzeri Dokular için Murine Kortikal Astrositlerin 3D Biyobaskı

Astrocytes are glial cells with an essential role in the central nervous system (CNS), including neuronal support and functionality. These cells also ...