Name: investigating the pathogenesis of myh7 mutation gly823glu in familial hypertrophic cardiomyopathy using a mouse model
Uploaded: 2022-08-08T14:00:00
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Diese Arbeit wurde durch das Medical Research Fund Projekt der Provinz Guangdong (A2022363) und das Großprojekt des Guangdong Committee of Science and Technology, China (Fördernummer 2022) unterstützt.
Wir danken Qingjian Chen von der University of Maryland, College Park für die Hilfe bei der Vorbereitung dieses Manuskripts.

Die Geschichten der Familien wurden durch Interviews mit den Familienmitgliedern gewonnen. Die Studie wurde von der Ethikkommission des Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (Nr. 2019074) genehmigt. Von allen Familienmitgliedern wurde eine schriftliche Einwilligung eingeholt. Alle Tiere werden in Übereinstimmung mit den ethischen Richtlinien des Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine (Guangzhou, China) behandelt.
1. Studienfächer
<p class="jove_conte...

<ol>
	<li>Toepfer, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+sequestration+regulates+sarcomere+function,+cardiomyocyte+energetics,+and+metabolism,+informing+the+pathogenesis+of+hypertrophic+cardiomyopathy.">Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).</li><li>Writing Committee Members et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2020+AHA/ACC+guideline+for+the+diagnosis+and+treatment+of+patients+with+hypertrophic+cardiomyopathy:+A+report+of+the+American+College+of+Cardiology/American+Heart+Association+Joint+Committee+on+Clinical+Practice+Guidelines.">2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).</li><li>Elliott, P., McKenna, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy.">Hypertrophic cardiomyopathy.</a> Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).</li><li>Maron, B. J., Maron, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy.">Hypertrophic cardiomyopathy.</a> Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).</li><li>Inoue, T., Orgel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonenzymatic+RNA+polymerase+model.">A nonenzymatic RNA polymerase model.</a> Science. 219 (4586), 859-862 (1983).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+capture+and+massively+parallel+sequencing+of+12+human+exomes.">Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes.</a> Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).</li><li>Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+genetics+of+cancer:+genome+sequencing+and+beyond.">Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).</li><li>Mattivi, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+a+phenotype-enhanced+MYH7-specific+variant+classification+framework+in+hypertrophic+cardiomyopathy+genetic+testing.">Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing.</a> Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).</li><li>Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. 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V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variant+affecting+the+myosin+light+chain+2+related+to+familial+hypertrophic+cardiomyopathy.">Genetic variant affecting the myosin light chain 2 related to familial hypertrophic cardiomyopathy.</a> Intractable &amp; Rare Diseases Research. 9 (4), 229-232 (2020).</li><li>Berge, K. E., Leren, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+hypertrophic+cardiomyopathy+in+Norway.">Genetics of hypertrophic cardiomyopathy in Norway.</a> Clinical Genetics. 86 (4), 355-360 (2014).</li><li>McNamara, J. W., Schuckman, M., Becker, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+yield,+interpretation,+and+clinical+utility+of+mutation+screening+of+sarcomere+encoding+genes+in+Danish+hypertrophic+cardiomyopathy+patients+and+relatives.">Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives.</a> Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).</li><li>Nakashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+clinical+impact+of+the+presence+of+sarcomere+gene+mutation+in+Japanese+patients+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).</li><li>Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+myocardia+containing+the+Obscurin+R4344Q+mutation+linked+to+hypertrophic+cardiomyopathy.">Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).</li><li>Girolami, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+alpha-actinin+2+variant+associated+with+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+and+juvenile+atrial+arrhythmias:+a+massively+parallel+sequencing+study.">Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).</li><li>Salazar-Mendiguchia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p.(Cys150Tyr)+variant+in+CSRP3+is+associated+with+late-onset+hypertrophic+cardiomyopathy+in+heterozygous+individuals.">The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals.</a> European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).</li><li>Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy:+An+overview+of+genetics+and+management.">Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management.</a> Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).</li><li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring.">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+profile+in+Chinese+patients+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).</li><li>Marian, A. J., Braunwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy:+Genetics,+pathogenesis,+clinical+manifestations,+diagnosis,+and+therapy.">Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy.</a> Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).</li><li>Cann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype-driven+molecular+autopsy+for+sudden+cardiac+death.">Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death.</a> Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).</li><li>Lafreniere-Roula, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family+screening+for+hypertrophic+cardiomyopathy:+Is+it+time+to+change+practice+guidelines.">Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).</li><li>Winkelmann, D. A., Forgacs, E., Miller, M. T., Stock, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+drug-induced+allosteric+changes+to+human+beta-cardiac+myosin+motor+activity.">Structural basis for drug-induced allosteric changes to human beta-cardiac myosin motor activity.</a> Nature Communications. 6, 7974 (2015).</li><li>Garc&#237;a-Giustiniani, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype+and+prognostic+correlations+of+the+converter+region+mutations+affecting+the+&#946;+myosin+heavy+chain.">Phenotype and prognostic correlations of the converter region mutations affecting the &#946; myosin heavy chain.</a> Heart (British Cardiac Society). 101 (13), 1047-1053 (2015).</li><li>Moore, J. R., Leinwand, L., Warshaw, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cardiomyopathy+phenotypes+based+on+the+functional+impact+of+mutations+in+the+myosin+motor.">Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor.</a> Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).</li><li>Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+exome+sequencing+do+for+you.">What can exome sequencing do for you.</a> Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).</li></ol>

In dieser Studie beschreiben wir eine chinesische Han-Familie mit HCM. Die genetische Analyse ergab, dass eine heterozygote MYH6-Mutation p.G823E bei Familienmitgliedern mit autosomal-dominanter Vererbung mit der Krankheit kosegnet. Um die Pathogenität der G823E-Mutation zu validieren und die zugrunde liegenden Mechanismen zu diskutieren, erstellten wir ein C57BL/6N-Mausmodell mit G823E am Myh7-Locus der Maus durch CRISPR/Cas9-vermitteltes Genom-Engineering.
Phänotypische Merkmale von C57BL/...

Hypertrophe Kardiomyopathie (HCM, OMIM: 613690) ist mit einer geschätzten Inzidenz von 0,2% die häufigste Kardiomyopathie in China, von der 150.000 Menschen betroffen sind 1,2.
Das pathologische anatomische Merkmal, das HCM charakterisiert, ist die asymmetrische ventrikuläre Hypertrophie, die häufig den ventrikulären Ausflusstrakt und / oder das interventrikuläre Septum3 betrifft. Die klinische Manifestation ist Belastungsdyspnoe, Müdigkeit und Brustschmerzen. Der individuelle Phänotyp der HCM weist eine Variabilität auf, die von klinisch heimtückischer bis zu schwerer Herzinsuffizienz reicht. Patienten mit HCM benötigen medizinische Behandlung, Herztransplantation, lebenserhaltende Ausrüstung und multidisziplinäre Nachsorge4.
Im vergangenen Jahrhundert hat die PCR-Technologie die Art und Weise verändert, wie wir DNA5 untersuchen. Eine DNA-Sequenzierungsmethode für die klinische Diagnose wurde von Sanger und Kollegen entdeckt6. Die Sanger-Technik wurde später auf das Human Genome Project angewendet, aber dieser Ansatz war kostspielig und zeitaufwendig7. Das Aufkommen der Gesamtgenomsequenzierung (WGS) brachte Einblicke in menschliche genetische Krankheiten auf neue Höhen, blieb aber in Bezug auf die Kosten unerschwinglich. Die Whole-Exom-Sequenzierungstechnologie (WES) wird seit langem zum Nachweis von Keimbahnvarianten8 eingesetzt und war erfolgreich bei der Identifizierung somatischer Treibermutationen im Exom verschiedener Krebsarten9. Der Nachweis von DNA-Exons oder kodierenden Regionen durch WES kann verwendet werden, um pathogene Varianten bei den meisten Mendelschen Erkrankungen aufzudecken. Heute, mit den sinkenden Kosten für die Sequenzierung, wird erwartet, dass WGS zu einem wichtigen Werkzeug in der Genomforschung wird und bei der Erkennung pathogener Varianten im Genom weit verbreitet sein kann.
Die WES-Technologie wurde auch bei der erblichen Kardiomyopathie eingesetzt, um pathogene Varianten zu identifizieren, um die Ätiologie weiter aufzuklären. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Gene, die Sarkomer-Strukturprotein-Genmutationen kodieren, wie MYH7 10, MYH6 11, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL3 14, TNNT215, TNNI3 16, TNNC1 17 undTPM1 18, für die genetische Ätiologie von HCM verantwortlich sind. Das Bewusstsein für pathogene Varianten in seltenen krankheitsverursachenden Genen (z. B. Obscurin, Zytoskelett-Calmodulin und Titin-interagierendes RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, wirkendes Alpha 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 und Cystein und glycinreiches Protein 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) wurde ebenfalls mit HCM in Verbindung gebracht. Aktuelle genetische Studien haben bei etwa 40% -60% der HCM-Patienten mehrere verschiedene pathogene Varianten im Sarkomerproteingen identifiziert, und Gentests bei HCM-Patienten ergaben, dass die meisten pathogenen Varianten in der Myosin-Schwerkette (MYH7) und dem Myosin-bindenden Protein C (MYBPC3) vorkommen. Die genetische Grundlage für HCM bleibt jedoch schwer fassbar. Die Erforschung der Pathogenität dieser Variationen, die den menschlichen HCM-Patienten zugrunde liegen, bleibt eine große Herausforderung22.
In dieser Studie berichten wir über eine pathogene Variante in MYH7 in einer chinesischen Han-Familie mit HCM von WES. Um die Pathogenität dieser Variante zu überprüfen, haben wir eine C57BL/6N-Myh7em1(G823E) Knockin-Maus mit dem CRISPR/Cas9-System etabliert. Wir diskutieren auch plausible Mechanismen dieser Variante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5&#215;TBE</td>
			<td>Shanghai Sangon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; Taq Master Mix (Dye Plus)</td>
			<td>Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Regu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine for small animals</td>
			<td>Reward Life Technology Co., Ltd.</td>
			<td>R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEDTools</td>
			<td></td>
			<td>2.16.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit</td>
			<td>Viewsolid Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>VK007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA stabilizer</td>
			<td>Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>DNAstable LD</td>
			<td>prevent DNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric paraffin microtome</td>
			<td>Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.</td>
			<td>HS-S7220-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATK</td>
			<td></td>
			<td>v3.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentra Puregene blood kit</td>
			<td>Santa Clara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide, coverslip</td>
			<td>Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution</td>
			<td>Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>C0107-500ml, C0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq X-ten platform</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>perform sequencing on the captured libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection of chorionic gonadotropin</td>
			<td>Livzon Pharmaceutical Group Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection of pregnant mare serum gonadotropin</td>
			<td>Livzon Pharmaceutical Group Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Local suppliers</td>
			<td></td>
			<td>inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Embedding Machine</td>
			<td>Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.</td>
			<td>HS-B7126-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picard</td>
			<td></td>
			<td>(2.2.4) 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>samtools</td>
			<td></td>
			<td>1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>ABI 3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Human All Exon V6</td>
			<td>Agilent Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>exome probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 ARCA mRNA Kit</td>
			<td>New England BioLabs, Inc.</td>
			<td>NEB-E2065S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature box</td>
			<td>BINDER GmbH</td>
			<td>KBF-S Solid.Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride Solution</td>
			<td>Sigma, Merck KGaA</td>
			<td>No. T2663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary ultrasound system</td>
			<td>Royal Philips</td>
			<td>CX50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the pathogenesis of myh7 mutation gly823glu in familial hypertrophic cardiomyopathy using a mouse model

Die familiäre hypertrophe Kardiomyopathie (HCM, OMIM: 613690) ist die häufigste Kardiomyopathie in China. Die zugrunde liegende genetische Ätiologie von HCM bleibt jedoch schwer fassbar.
Wir haben zuvor eine Myosin-Schwerketten-7 (MYH7)-Gen-heterozygote Variante NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E) in einer großen chinesischen Han-Familie mit HCM identifiziert. In dieser Familie ist die Variante G823E mit einer autosomal-dominanten Erkrankung getrennt. Diese Variante befindet sich in der Hebelarmdomäne der Halsregion des MYH7-Proteins und ist unter homologen Myosinen und Spezies hoch konserviert. Um die Pathogenität der G823E-Variante zu überprüfen, produzierten wir ein C57BL/6N-Mausmodell mit einer Punktmutation (G823E) am Maus-MYH7-Locus mit CRISPR/Cas9-vermitteltem Genom-Engineering. Wir entwarfen gRNA-Targeting-Vektoren und Donor-Oligonukleotide (mit Targeting-Sequenzen, die von 134 bp Homologie flankiert werden). Die p.G823E-Stelle (GGG zu GAG) im Donor-Oligonukleotid wurde durch homologiegesteuerte Reparatur in Exon 23 von MYH7 eingebracht. Ein schallgedämpftes p.R819 (AGG zu CGA) wurde ebenfalls eingefügt, um eine gRNA-Bindung und Re-Spaltung der Sequenz nach homologiegesteuerter Reparatur zu verhindern. Die Echokardiographie ergab eine linksventrikuläre hintere Wand (LVPW) Hypertrophie mit Systole bei MYH7 G823E/- Mäusen im Alter von 2 Monaten. Diese Ergebnisse wurden ebenfalls durch histologische Analysen validiert (Abbildung 3).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die G823E-Variante eine wichtige Rolle bei der Pathogenese von HCM spielt. Unsere Ergebnisse bereichern das Spektrum der MYH7-Varianten, die mit familiärer HCM verbunden sind, und können eine Anleitung für die genetische Beratung und pränatale Diagnose in dieser chinesischen Familie bieten.

Klinisches Profil der Familien Die Familienstammbäume von HCM wurden erhalten und sind in Abbildung 2 dargestellt. Bei allen dokumentierten Familienmitgliedern wurde bei der Einschreibung HCM diagnostiziert.
In der Familie (Abbildung 2A) war der Probande Patient III-7, bei dem im Alter von 46 Jahren HCM und eine Obstruktion des linksventrikulären Ausflusstraktes (LVOTO) diagnostiziert wurden und der sich einer Herzoperation unter...

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Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

Basierend auf der familiären erblichen Kardiomyopathie-Familie, die in unserer klinischen Arbeit gefunden wurde, erstellten wir ein C57BL / 6N-Mausmodell mit einer Punktmutation (G823E) am MYH7-Locus der Maus durch CRISPR / Cas9-vermitteltes Genom-Engineering, um diese Mutation zu verifizieren.

Untersuchung der Pathogenese der MYH7-Mutation Gly823Glu bei familiärer hypertropher Kardiomyopathie anhand eines Mausmodells

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...

Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Demonstration von Ultraschall bei kleinen Tieren liefern kann. Diese Technik kann Einblicke in die Entdeckung pathogener Gene bei der hereditären Kardiomyopathie geben. Befestigen Sie die Knockin-Mäuse horizontal auf der Plattform und neigen Sie die Plattform um 30 Grad zur Knockin-Maus.Entfernen Sie Haare an der vorderen Brustwand der Knockin-Mäuse mit einer Enthaarungscreme Positionieren Sie die Sonde senkrecht mit der Beule zum Kopf des Tieres. Drehen Sie dann die Sonde gegen den Uhrzeigersinn um ca. 45 Grad in der parasternalen Längsachsenansicht. Drehen Sie die Sonde um 90 Grad im Uhrzeigersinn, um die parasternale Kurzachsenansicht zu erhalten.Passen Sie nach dem Drehen der Sonde die Verschiebung der Y-Achse an, um die richtige Scheibe zu erhalten. Beobachten Sie das Bild der langen Achse des Herzens und wählen Sie dann die Messdaten des M-Modus aus. Erfassen Sie Ultraschalldaten von parasternalen Langachsenansichten von Mäusen und messen Sie die Herzfrequenz, die linksventrikuläre Ejektionsfraktion, das Herzzeitvolumen, die linksventrikuläre und diastolische Dimension, die linksventrikuläre und systolische Dimension.Linke ventrikuläre hintere Wand und Ventrikelscheidewand Die Familienstammbäume der hypertrophen Kardiomyopathie wurden erhalten, und bei allen dokumentierten Familienmitgliedern wurde eine hypertrophe Kardiomyopathie diagnostiziert. Die Sanger-Sequenzierung bestätigte die gleiche M Y H 7 P G 8 23 E-Variante bei allen Patienten, jedoch nicht bei den gesunden Personen in den Familien.Und 174 Kontrollen, die heterozygot M Y H 7 P G 8 23 E vollständig in dieser Familie co-getrennt. Der Glycinrest bei Codon 8 23 im Halsbereich von M Y H 7 war in allen verfügbaren Wirbeltiermyocinsequenzen hochkonserviert. Nach A C M G Standards und Richtlinien wurde die M Y H 7 P G 8 23 E Variante als pathogene Variante vorhergesagt.Die Knockin-Mäuse entwickelten nach der Geburt eine altersabhängige Herzhypertrophie. Die Echokardiographie zeigte, dass sich das interventrikuläre Septum und die linke ventrikuläre hintere Wand bei den Knockin-Mäusen mit erhöhter Herzfrequenz entwickelten. Auch durch die histologische Analyse bestätigt.Virus-Ultraschalldaten können erhalten werden, indem die Sonde in verschiedenen Winkeln auf verschiedenen Abschnitten des Mausbegriffs gedreht wird.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Forschung

Genetik

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Effiziente Produktion und Kennzeichnung der CRISPR/Cas9 generiert gen Knockouts im Modellsystem Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Mit In-vitro- und In der Zelle Form zu untersuchen, kleines Molekül induzierte Pre-mRNA Strukturveränderungen

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Charakterisierung von Histon Post-translationale Modifikation Veränderungen in Hefe Neurodegenerative Proteinopathy Modelle

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Festsetzung des Ei Befruchtung Tabak Tabaci mit einer zytogenetischen Technik

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Ein nicht zufälliges Mausmodell zur pharmakologischen Reaktivierung von Mecp2 auf dem inaktiven X-Chromosom

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...