Name: investigating the pathogenesis of myh7 mutation gly823glu in familial hypertrophic cardiomyopathy using a mouse model
Uploaded: 2022-08-08T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo projeto do Fundo de Pesquisa Médica da Província de Guangdong (A2022363) e pelo grande projeto do Comitê de Ciência e Tecnologia de Guangdong, China (subvenção no.2022).
Gostaríamos de agradecer a Qingjian Chen, da Universidade de Maryland, College Park, pela ajuda durante a preparação deste manuscrito.

As histórias das famílias foram obtidas por meio de entrevistas com os familiares. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong (No. 2019074). O consentimento informado por escrito foi obtido de todos os membros da família. Todos os animais são tratados de acordo com as diretrizes éticas do Hospital Provincial de Medicina Chinesa de Guangdong (Guangzhou, China).
1. Sujeitos do estudo
NOTA: O...

<ol>
	<li>Toepfer, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+sequestration+regulates+sarcomere+function,+cardiomyocyte+energetics,+and+metabolism,+informing+the+pathogenesis+of+hypertrophic+cardiomyopathy.">Myosin sequestration regulates sarcomere function, cardiomyocyte energetics, and metabolism, informing the pathogenesis of hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation. 141 (10), 828-842 (2020).</li><li>Writing Committee Members et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2020+AHA/ACC+guideline+for+the+diagnosis+and+treatment+of+patients+with+hypertrophic+cardiomyopathy:+A+report+of+the+American+College+of+Cardiology/American+Heart+Association+Joint+Committee+on+Clinical+Practice+Guidelines.">2020 AHA/ACC guideline for the diagnosis and treatment of patients with hypertrophic cardiomyopathy: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Joint Committee on Clinical Practice Guidelines.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 162 (1), 23-106 (2021).</li><li>Elliott, P., McKenna, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy.">Hypertrophic cardiomyopathy.</a> Lancet. 363 (9424), 1881-1891 (2004).</li><li>Maron, B. J., Maron, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy.">Hypertrophic cardiomyopathy.</a> Lancet. 381 (9862), 242-255 (2013).</li><li>Inoue, T., Orgel, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nonenzymatic+RNA+polymerase+model.">A nonenzymatic RNA polymerase model.</a> Science. 219 (4586), 859-862 (1983).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+capture+and+massively+parallel+sequencing+of+12+human+exomes.">Targeted capture and massively parallel sequencing of 12 human exomes.</a> Nature. 461 (7261), 272-276 (2009).</li><li>Wong, K. M., Hudson, T. J., McPherson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+genetics+of+cancer:+genome+sequencing+and+beyond.">Unraveling the genetics of cancer: genome sequencing and beyond.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 12, 407-430 (2011).</li><li>Mattivi, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+utility+of+a+phenotype-enhanced+MYH7-specific+variant+classification+framework+in+hypertrophic+cardiomyopathy+genetic+testing.">Clinical utility of a phenotype-enhanced MYH7-specific variant classification framework in hypertrophic cardiomyopathy genetic testing.</a> Circulation. Genomic and Precision Medicine. 13 (5), 453-459 (2020).</li><li>Jiang, J., Wakimoto, H., Seidman, J. G., Seidman, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele-specific+silencing+of+mutant+Myh6+transcripts+in+mice+suppresses+hypertrophic+cardiomyopathy.">Allele-specific silencing of mutant Myh6 transcripts in mice suppresses hypertrophic cardiomyopathy.</a> Science. 342 (6154), 111-114 (2013).</li><li>Hayashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+of+Japanese+patients+with+pediatric+hypertrophic+and+restrictive+cardiomyopathy.">Genetic background of Japanese patients with pediatric hypertrophic and restrictive cardiomyopathy.</a> Journal of Human Genetics. 63 (9), 989-996 (2018).</li><li>Gil, W. S., &#193;vila Vidal, L. A., V&#225;squez Salguero, M. A., Cajiao, M. B., Pe&#241;a, C. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+yield,+interpretation,+and+clinical+utility+of+mutation+screening+of+sarcomere+encoding+genes+in+Danish+hypertrophic+cardiomyopathy+patients+and+relatives.">Diagnostic yield, interpretation, and clinical utility of mutation screening of sarcomere encoding genes in Danish hypertrophic cardiomyopathy patients and relatives.</a> Human Mutations. 30 (3), 363-370 (2009).</li><li>Nakashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifelong+clinical+impact+of+the+presence+of+sarcomere+gene+mutation+in+Japanese+patients+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Lifelong clinical impact of the presence of sarcomere gene mutation in Japanese patients with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Circulation Journal. 84 (10), 1846-1853 (2020).</li><li>Hu, L. R., Kontrogianni-Konstantopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+myocardia+containing+the+Obscurin+R4344Q+mutation+linked+to+hypertrophic+cardiomyopathy.">Proteomic analysis of myocardia containing the Obscurin R4344Q mutation linked to hypertrophic cardiomyopathy.</a> Frontiers in Physiology. 11, 478 (2020).</li><li>Girolami, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+alpha-actinin+2+variant+associated+with+familial+hypertrophic+cardiomyopathy+and+juvenile+atrial+arrhythmias:+a+massively+parallel+sequencing+study.">Novel alpha-actinin 2 variant associated with familial hypertrophic cardiomyopathy and juvenile atrial arrhythmias: a massively parallel sequencing study.</a> Circulation. Cardiovascular Genetics. 7 (6), 741-750 (2014).</li><li>Salazar-Mendiguchia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+p.(Cys150Tyr)+variant+in+CSRP3+is+associated+with+late-onset+hypertrophic+cardiomyopathy+in+heterozygous+individuals.">The p.(Cys150Tyr) variant in CSRP3 is associated with late-onset hypertrophic cardiomyopathy in heterozygous individuals.</a> European Journal of Medical Genetics. 63 (12), 104079 (2020).</li><li>Teekakirikul, P., Zhu, W., Huang, H. C., Fung, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy:+An+overview+of+genetics+and+management.">Hypertrophic cardiomyopathy: An overview of genetics and management.</a> Biomolecules. 9 (12), 878 (2019).</li><li>Crossley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Sanger+sequencing+and+molecular+assay+monitoring.">Guidelines for Sanger sequencing and molecular assay monitoring.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 32 (6), 767-775 (2020).</li><li>Song, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+profile+in+Chinese+patients+with+hypertrophic+cardiomyopathy.">Mutations profile in Chinese patients with hypertrophic cardiomyopathy.</a> Clinica Chimica Acta. 351 (1-2), 209-216 (2005).</li><li>Marian, A. J., Braunwald, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypertrophic+cardiomyopathy:+Genetics,+pathogenesis,+clinical+manifestations,+diagnosis,+and+therapy.">Hypertrophic cardiomyopathy: Genetics, pathogenesis, clinical manifestations, diagnosis, and therapy.</a> Circulation Research. 121 (7), 749-770 (2017).</li><li>Cann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotype-driven+molecular+autopsy+for+sudden+cardiac+death.">Phenotype-driven molecular autopsy for sudden cardiac death.</a> Clinical Genetics. 91 (1), 22-29 (2017).</li><li>Lafreniere-Roula, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Family+screening+for+hypertrophic+cardiomyopathy:+Is+it+time+to+change+practice+guidelines.">Family screening for hypertrophic cardiomyopathy: Is it time to change practice guidelines.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3672-3681 (2019).</li><li>Winkelmann, D. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+cardiomyopathy+phenotypes+based+on+the+functional+impact+of+mutations+in+the+myosin+motor.">Understanding cardiomyopathy phenotypes based on the functional impact of mutations in the myosin motor.</a> Circulation Research. 111 (3), 375-385 (2012).</li><li>Majewski, J., Schwartzentruber, J., Lalonde, E., Montpetit, A., Jabado, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+exome+sequencing+do+for+you.">What can exome sequencing do for you.</a> Journal of Medical Genetics. 48 (9), 580-589 (2011).</li></ol>

Neste estudo, descrevemos uma família Han chinesa com CMH. A análise genética revelou que uma mutação heterozigótica MYH6 p.G823E co-segrega com a doença em membros da família com herança autossômica dominante. Para validar a patogenicidade da mutação G823E e discutir os mecanismos subjacentes, criamos um modelo de camundongo C57BL/6N com G823E no locus Myh7 do camundongo por engenharia genômica mediada por CRISPR/Cas9.
As características fenotípicas de camundongos knockin C57BL...

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH, OMIM: 613690) é a cardiomiopatia mais comum na China, com incidência estimada em 0,2%, acometendo 150.000 pessoas 1,2.
A característica anatômica patológica que caracteriza a CMH é a hipertrofia ventricular assimétrica, que frequentemente envolve a via de saída ventricular e/ou septo interventricular3. A manifestação clínica é dispneia ao esforço, fadiga e dor torácica. O fenótipo individual da CMH tem variabilidade que varia de clinicamente insidiosa a insuficiência cardíaca grave. Pacientes com CMH necessitam de tratamento médico, transplante cardíaco, equipamentos de suporte à vida e acompanhamento multidisciplinar4.
No século passado, a tecnologia de PCR mudou a maneira como estudamos o DNA5. Um método de sequenciamento de DNA para diagnóstico clínico foi descoberto por Sanger e colegas6. A técnica de Sanger foi posteriormente aplicada ao Projeto Genoma Humano, mas essa abordagem foi dispendiosa e demorada7. O advento do sequenciamento do genoma completo (WGS) trouxe insights sobre doenças genéticas humanas a novos patamares, mas permaneceu proibitivo em termos de custo. A tecnologia de sequenciamento de exoma completo (WES) tem sido usada há muito tempo para detectar variantes da linha germinativa8 e tem sido bem-sucedida na identificação de mutações de drivers somáticos no exoma de vários tipos de câncer9. A detecção de éxons de DNA ou regiões codificadoras por WES pode ser usada para revelar variantes patogênicas na maioria das doenças mendelianas. Hoje, com a diminuição do custo do sequenciamento, espera-se que o WGS se torne uma ferramenta importante na pesquisa genômica e possa ser amplamente utilizado na detecção de variantes patogênicas no genoma.
A tecnologia WES também tem sido usada na cardiomiopatia hereditária para identificar variantes patogênicas para elucidar ainda mais a etiologia. Evidências emergentes implicaram que genes que codificam mutações genéticas de proteínas estruturais do sarcômero, como MYH7 10, MYH611, MYBPC3 12, MYL2 13, MYL314, TNNT2 15, TNNI3 16, TNNC1 17 eTPM1 18 são responsáveis pela etiologia genética da CMH. O conhecimento de variantes patogênicas em genes causadores de doenças raras (por exemplo, obscurina, calmodulina citoesquelética e RhoGEF (OBSCN, OMIM: 608616)19, agindo alfa 2 (ACTN2, OMIM: 102573)20 e proteína rica em cisteína e glicina 3 (CSRP3, OMIM: 600824)21) também tem sido associada à CMH. Estudos genéticos atuais identificaram múltiplas variantes patogênicas distintas no gene da proteína sarcomérica em aproximadamente 40%-60% dos pacientes com CMH, e testes genéticos em pacientes com CMH revelaram que a maioria das variantes patogênicas ocorre na cadeia pesada da miosina (MYH7) e na proteína C de ligação à miosina (MYBPC3). No entanto, a base genética para a CMH permanece indescritível. Explorar a patogenicidade dessas variações subjacentes aos pacientes humanos com CMH continua sendo um grande desafio22.
Neste estudo, relatamos uma variante patogênica no MYH7 em uma família Han chinesa com CMH por WES. Para verificar a patogenicidade dessa variante, estabelecemos um camundongo knockin C57BL/6N-Myh7em1(G823E) utilizando o sistema CRISPR/Cas9. Também discutimos mecanismos plausíveis dessa variante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5&#215;TBE</td>
			<td>Shanghai Sangon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#215; Taq Master Mix (Dye Plus)</td>
			<td>Nanjing Novizan Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Regu</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesthesia machine for small animals</td>
			<td>Reward Life Technology Co., Ltd.</td>
			<td>R500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BEDTools</td>
			<td></td>
			<td>2.16.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 in vitro digestion method to detect gRNA target efficiency kit</td>
			<td>Viewsolid Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>VK007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Marker</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA stabilizer</td>
			<td>Shanghai Seebio Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>DNAstable LD</td>
			<td>prevent DNA degradation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric paraffin microtome</td>
			<td>Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.</td>
			<td>HS-S7220-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GATK</td>
			<td></td>
			<td>v3.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentra Puregene blood kit</td>
			<td>Santa Clara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide, coverslip</td>
			<td>Jiangsu Invotech Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematoxylin staining solution, Eosin staining solution</td>
			<td>Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.</td>
			<td>C0107-500ml, C0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiSeq X-ten platform</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td>perform sequencing on the captured libraries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection of chorionic gonadotropin</td>
			<td>Livzon Pharmaceutical Group Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection of pregnant mare serum gonadotropin</td>
			<td>Livzon Pharmaceutical Group Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Local suppliers</td>
			<td></td>
			<td>inhalation anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>ECLIPSE Ts2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Embedding Machine</td>
			<td>Shenyang Hengsong Technology Co., Ltd.</td>
			<td>HS-B7126-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picard</td>
			<td></td>
			<td>(2.2.4) 20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>samtools</td>
			<td></td>
			<td>1.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencer</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>ABI 3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ745T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SureSelect Human All Exon V6</td>
			<td>Agilent Technology Co., Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>exome probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 ARCA mRNA Kit</td>
			<td>New England BioLabs, Inc.</td>
			<td>NEB-E2065S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature box</td>
			<td>BINDER GmbH</td>
			<td>KBF-S Solid.Line</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride Solution</td>
			<td>Sigma, Merck KGaA</td>
			<td>No. T2663</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Veterinary ultrasound system</td>
			<td>Royal Philips</td>
			<td>CX50</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating the pathogenesis of myh7 mutation gly823glu in familial hypertrophic cardiomyopathy using a mouse model

A cardiomiopatia hipertrófica familiar (CMH, OMIM: 613690) é a cardiomiopatia mais comum na China. No entanto, a etiologia genética subjacente da CMH permanece indescritível.
Identificamos anteriormente uma variante heterozigótica do gene da cadeia pesada 7 da miosina (MYH7), NM_000257.4: c.G2468A (p.G823E), em uma grande família Han chinesa com CMH. Nesta família, a variante G823E cosegrega com um distúrbio autossômico dominante. Esta variante está localizada no domínio do braço de alavanca da região do pescoço da proteína MYH7 e é altamente conservada entre miosinas homólogas e espécies. Para verificar a patogenicidade da variante G823E, produzimos um modelo de camundongo C57BL/6N com uma mutação pontual (G823E) no locus MYH7 do camundongo com engenharia genômica mediada por CRISPR/Cas9. Projetamos vetores de gRNA direcionados e oligonucleotídeos doadores (com sequências de segmentação ladeadas por 134 pb de homologia). O sítio p.G823E (GGG a GAG) no oligonucleotídeo doador foi introduzido no éxon 23 do MYH7 por reparo direcionado por homologia. Um p.R819 silenciado (AGG para CGA) também foi inserido para evitar a ligação do gRNA e a reclivagem da sequência após o reparo direcionado por homologia. O ecocardiograma revelou hipertrofia da parede posterior do ventrículo esquerdo (PCVE) com sístole em camundongos MYH7 G823E/- aos 2 meses de idade. Esses resultados também foram validados por análise histológica (Figura 3).
Estes resultados demonstram que a variante G823E desempenha um papel importante na patogênese da CMH. Nossos achados enriquecem o espectro de variantes do MYH7 ligadas à CMH familiar e podem fornecer orientação para aconselhamento genético e diagnóstico pré-natal nesta família chinesa.

Perfil clínico das famílias Os pedigrees familiares da CMH foram obtidos e são apresentados na Figura 2. Todos os membros da família documentados foram diagnosticados com CMH no momento da inscrição.
Na família (Figura 2A), o probando foi o paciente III-7, que foi diagnosticado com CMH e obstrução da via de saída do ventrículo esquerdo (VOTO) aos 46 anos e submetido a cirurgia cardíaca. O paciente III-3 tinha CMH menor ...

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Investigating the Pathogenesis of MYH7 Mutation Gly823Glu in Familial Hypertrophic Cardiomyopathy using a Mouse Model

Com base na família de cardiomiopatia hereditária familiar encontrada em nosso trabalho clínico, criamos um modelo de camundongo C57BL / 6N com uma mutação pontual (G823E) no locus MYH7 do camundongo através da engenharia genômica mediada por CRISPR / Cas9 para verificar essa mutação.

Investigando a patogênese da mutação MYH7 Gly823Glu em cardiomiopatia hipertrófica familiar usando um modelo de camundongo

Familial hypertrophic cardiomyopathy (HCM, OMIM: 613690) is the most common cardiomyopathy in China. However, the underlying genetic etiology of HCM ...

Este protocolo é significativo, pois pode fornecer uma demonstração de ultrassom em pequenos animais. Esta técnica pode fornecer insights sobre a descoberta de genes patogênicos na cardiomiopatia hereditária. Fixe os mouses knockin horizontalmente na plataforma e, em seguida, incline a plataforma 30 graus para o mouse knockin.Remova o pelo na parede torácica anterior dos ratos knockin usando um creme depilatório posicione a sonda verticalmente com a protuberância voltada para a cabeça do animal. Em seguida, gire a sonda no sentido anti-horário aproximadamente 45 graus na visão do eixo longo para esternal. Gire a sonda 90 graus no sentido horário para obter a visão do eixo curto para esternal.Depois de girar a sonda, ajuste o deslocamento do eixo Y para obter a fatia correta. Observe a imagem de eixo longo do coração e, em seguida, selecione os dados de medição do modo M. Adquirir dados ultrassonográficos de incidências de eixo longo para esternal de camundongos e medir a frequência cardíaca, fração de ejeção do ventrículo esquerdo, débito cardíaco, dimensão ventricular esquerda e diastólica, ventricular esquerda e dimensão sistólica.Parede posterior do ventrículo esquerdo e septo ventricular. Os pedigrees familiares de cardiomiopatia hipertrófica foram obtidos, e todos os membros da família documentados foram diagnosticados com inscrição em cardiomiopatia hipertrófica. O sequenciamento de Sanger confirmou a mesma variante M Y H 7 P G 8 23 E em todos os pacientes, mas não nos indivíduos saudáveis das famílias.E 174 controles, os heterozigotos M Y H 7 P G 8 23 E completamente co-segregados nesta família. O resíduo de glicina no Códon 8 23 na região do domínio do pescoço de M Y H 7 foi altamente conservado em todas as sequências de miocina de vertebrados disponíveis. De acordo com os padrões e diretrizes A C M G, a variante M Y H 7 P G 8 23 E foi prevista como uma variante patogênica.Os camundongos knockin desenvolveram hipertrofia cardíaca dependente da idade após o nascimento. A ecocardiografia revelou que o septo interventricular e a parede posterior do ventrículo esquerdo se desenvolveram com aumento da frequência cardíaca nos camundongos knockin. Também confirmado pela análise histológica.Os dados de ultrassom do vírus podem ser obtidos girando a sonda em diferentes ângulos em diferentes seções do termo do camundongo.

Research

JoVE Journal

Genetics

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detecção de Copy Number Alterações Usando Sequencing única célula

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Genética

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Uma metodologia padrão para examinar a mutagenicidade no local como uma função de ponto de mutação reparação catalisada por CRISPR/Cas9 e SsODN em células humanas

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Produção eficiente e identificação de CRISPR/Cas9 gerado pelo Gene nocautes no sistema modelo Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Sincronismo de replicação de DNA usando Zebrafish como um sistema modelo In Vivo de criação de perfil

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Usando oócitos de camundongo para avaliar a função de genes humanos durante a meiose I

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization

Visualização da Microbiota nas entranhas do carrapato por toda a montagem In Situ da hibridação

Infectious diseases transmitted by arthropod vectors continue to pose a significant threat to human health worldwide. The pathogens causing these ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Usando em forma de Vitro e na célula para investigar a pequena molécula induzida por alterações estruturais Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Characterizing Histone Post-translational Modification Alterations in Yeast Neurodegenerative Proteinopathy Models

Caracterizando a histona modificação pós-traducional alterações nos modelos de Neurodegenerative Proteinopathy de levedura

Neurodegenerative diseases, such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and Parkinson&#39;s disease (PD), cause the loss of hundreds of thousands of lives ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determinação da taxa de fertilização do ovo de Bemisia tabaci usando uma técnica citogenética

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

A Non-random Mouse Model for Pharmacological Reactivation of Mecp2 on the Inactive X Chromosome

Um modelo de camundongo não aleatório para reativação farmacológica de Mecp2 no cromossomo X inativo

X chromosome inactivation (XCI) is the random silencing of one X chromosome in females to achieve gene dosage balance between the sexes. As a result, all ...