Name: self-assembly of microtubule tactoids
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Microtubule Tactoids at JoVE.com

लेखक सभी ग्रीष्मकालीन 2021 रॉस लैब सदस्यों, विशेष रूप से के एलिस लिंडसे को उनकी मदद के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को एनएसएफ बीआईओ -2134215 के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था जिसने एस साहू, एन गुडबी, एचबी ली और जेएल रॉस का समर्थन किया था। केईसीके फाउंडेशन (राय एंडरसन, यूएसडी, लीड पीआई) से अनुदान आंशिक रूप से समर्थित आर शाखा और पी चौहान

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Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).</li><li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+organization+and+dynamics+dependent+on+microtubule-associated+proteins.">Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA.">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173 (1989).</li><li>MacRae, T. 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G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+65-kDa+carrot+microtubule-associated+protein+forms+regularly+arranged+filamentous+cross-bridges+between+microtubules.">The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).</li><li>Scheff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+shape+and+internal+structure+of+protein+droplets+via+biopolymer+filaments.">Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments.</a> Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).</li><li>Weirich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+behavior+of+cross-linked+actin+bundles.">Liquid behavior of cross-linked actin bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).</li><li>Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+motors+divide+active+liquid+droplets.">Self-organizing motors divide active liquid droplets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).</li><li>Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowder+and+surface+effects+on+self-organization+of+microtubules.">Crowder and surface effects on self-organization of microtubules.</a> Physical Review E. 103 (6), 062408 (2021).</li><li>Stanhope, K. T., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+MAPs,+and+motor+patterns.">Microtubules, MAPs, and motor patterns.</a> Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).</li><li>Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons Available from: <a target="_blank" href="https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg">https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg</a> (2022)</li><li>Lantzsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+reorganization+during+female+meiosis+in+c.+Elegans.">Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans.</a> eLife. 10, 58903 (2021).</li><li>Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+and+testing+of+a+new,+local+microtubule-disruption+tool+based+on+the+microtubule-severing+enzyme,+katanin+p60.">Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60.</a> Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).</li><li>Pecqueur, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designed+ankyrin+repeat+protein+selected+to+bind+to+tubulin+caps+the+microtubule+plus+end.">A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).</li><li>Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+dimers+of+the+mitotic+kinesin+motor+Eg5+step+processively+and+support+substantial+loads+in+vitro.">Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).</li><li>Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinesin-13+mutant+catalytically+depolymerizes+microtubules+in+ADP.">A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP.</a> Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).</li><li>McNally, F. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+katanin,+an+ATPase+that+severs+and+disassembles+stable+microtubules.">Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules.</a> Cell. 75 (3), 419-429 (1993).</li></ol>

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं।

माइटोसिस के माध्यम से कोशिका विभाजन जीवन को बनाए रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रियाओं में से एक है। ट्यूबुलिन डिमर्स से बने सूक्ष्मनलिका फिलामेंट्स, इस प्रक्रिया के आवश्यक संरचनात्मक तत्व हैं। मेटाफ़ेज़ में बनाई गई क्षणिक मशीनरी जब गुणसूत्र कोशिका केंद्र में संरेखित होते हैं, तो इसके आकार के कारण माइटोटिक स्पिंडल कहा जाता है, जो धागे (चित्रा 1 ए) में कवर किए गए करघे के धुरी की तरह है। यह कई जीवों में अच्छी तरह से स्थापित है कि सूक्ष्मनलिकाएं मेटाफ़ेज़ में संघनित गुणसूत्रों को कोशिका के केंद्र में धकेलने और खींचने के लिए उपयोग की जाती हैं, उन्हें संरेखित करती हैं और उन्हें सूक्ष्मनलिकाएं तक हुक करती हैं जो उन्हें एनाफ़ेज़ (चित्रा 1 बी, सी) में अलग कर देगी। अर्धसूत्रीविभाजन (चित्रा 1 बी) और माइटोसिस (चित्रा 1 सी) दोनों में स्पिंडल रूपों, कई अतिव्यापी सूक्ष्मनलिकाएं धागे की तरह केंद्रीय अक्ष के चारों ओर लिपटे नहीं बल्कि इंटरफ़ेस के समानांतर चल रहे हैं। इन सूक्ष्मनलिका-आधारित संरचनाओं को बनाने के लिए संबंधित प्रोटीन की आवश्यकता होती है जो क्रॉसलिंक और संबंधित एंजाइम जो गुणसूत्रों को धक्का देने और खींचने में मदद करने के लिए मोटर्स के रूप में कार्य कर सकते हैं1.
अर्धसूत्रीविभाजन स्पिंडल के अध्ययन से पता चला है कि सूक्ष्मनलिकाएं क्रॉसलिंक्ड सरणियों 2,3,4,5,6 (चित्रा 1डीआई) में छोटी, गतिशील और अतिव्यापी हैं। इन छोटे सूक्ष्मनलिकाएं के भौतिक संगठन के कारण, अर्धसूत्रीविभाजन धुरी एक तरल क्रिस्टल टैक्टोइड (चित्रा 1 ई) के समान है। दरअसल, स्पिंडल को एकजुट करने और विलय करने के लिए दिखाया गया है, जैसा कि कोई तरल क्रिस्टलटैक्टोइड्स 5 से उम्मीद करेगा।
1960 के दशक में वापस डेटिंग करने वाले कई अध्ययनों ने निर्धारण, धारावाहिक वर्गों और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया है कि माइटोटिकस्पिंडल 7,8,9,10 के अंदर दो प्रकार के सूक्ष्मनलिकाएं हैं। पहले प्रकार को किनेटोकोर सूक्ष्मनलिकाएं कहा जाता है, जो स्पिंडल ध्रुव को कीनेटोकोर से जोड़ता है। दूसरे प्रकार को इंटरपोलर या ध्रुवीय सूक्ष्मनलिकाएं कहा जाता है, जो गुणसूत्रों से आगे बढ़ते हैं और मिडज़ोन (चित्रा 1 डीआईआई) 8,9,10 पर ओवरलैप होते हैं। एक तीसरे प्रकार को सूक्ष्म सूक्ष्मनलिकाएं कहा जाता है, जो धुरी के बाहर होते हैं और ध्रुवों को सेल किनारे से जोड़ते हैं; ये सूक्ष्मनलिका संगठन वर्तमान चर्चा के दायरे से बाहर हैं। सूक्ष्मनलिकाएं के लिए न्यूक्लिएशन केंद्रों को प्रभावित करने वाले ऑगमिन6 और गामा-ट्यूबुलिन रिंग कॉम्प्लेक्स के बीच बातचीत पर हालिया अध्ययन हुए हैं, जिसके परिणामस्वरूप चित्रा 1 डी की तरह छोटे सूक्ष्मनलिकाएं के साथ एक माइटोटिक स्पिंडल होता है।
चूंकि सूक्ष्मनलिकाएं चौड़ी होने की तुलना में लंबी होती हैं, उच्च पहलू अनुपात और उच्च कठोरता के साथ, वे तरल क्रिस्टल अणुओं के स्केल-अप संस्करणों की तरह होते हैं। नरम पदार्थ भौतिकी में, परमाणुओं और अणुओं को न्यूक्लिएशन और क्रिस्टल के पिघलने सहित चरण संक्रमण के भौतिक तंत्र को कम करने के लिए न्यूनतम इंटरैक्शन का उपयोग करके अनुमानित किया गया है11. इसी तरह, सूक्ष्मनलिकाएं मेसोस्केल ऑब्जेक्ट्स हैं जो लिक्विड क्रिस्टल अणुओं के स्केल-अप संस्करण हैं, जो लिक्विड क्रिस्टल गतिशीलता के भौतिकी में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, जिसमें आइसोट्रोपिक लोगों से नेमेटिक चरणों के न्यूक्लिएशन और विकास शामिल हैं। इसके अलावा, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, अर्धसूत्रीविभाजन धुरी एक तरल क्रिस्टल टैक्टोइड जैसे गुणों को प्रदर्शित करती है, एक नेमेटिक अवस्था जो तरल क्रिस्टल अणुओं 3,4,5 के आइसोट्रोपिक राज्य से न्यूक्लिएट और बढ़ती है। टैक्टोइड्स के लिए, न्यूक्लिएशन और विकास अन्य क्रिस्टल की तरह होते हैं (यानी, मेसोजेन की अपेक्षाकृत उच्च सांद्रता की आवश्यकता होती है [अणु जो तरल क्रिस्टल बनाते हैं])। टैक्टॉइड का अद्वितीय "स्पिंडल" आकार तरल क्रिस्टल मेसोजेन के स्थानीय संरेखण से आता है जो नेमेटिक चरण (चित्रा 1 ई) में संरेखित होता है। वे एक गोल क्रिस्टल नहीं बना सकते क्योंकि अणु अत्यधिक असममित होते हैं। सूक्ष्मनलिकाएं की प्रकृति को देखते हुए, यह शायद आश्चर्य की बात नहीं है कि सूक्ष्मनलिकाएं की उच्च स्थानीय एकाग्रता से बनी माइटोटिक स्पिंडल-मशीनरी भी उसी आकार की है, चाहे उसे टैक्टोइड या स्पिंडल कहा जाता हो। टैक्टोइड द्विध्रुवी हो सकते हैं, पतला सिरों पर ध्रुवों के साथ (चित्रा 1 ईआई), या सजातीय, अनंत (चित्रा 1ईआईआई) पर प्रभावी ढंग से ध्रुवों के साथ।
स्पिंडल गठन के महत्व को देखते हुए, आयनिक प्रजातियों12,13 के माध्यम से बंडलों में सूक्ष्मनलिका संक्षेपण का प्रदर्शन करके कृत्रिम परिवेशीय में स्व-संगठित स्पिंडल गठन की दिशा में प्रयास चल रहे हैं, भीड़ एजेंट जो कमी इंटरैक्शन14,15 बनाते हैं, और विशिष्ट सूक्ष्मनलिकाएं क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन 13,16,17,18,19, 21. हैरानी की बात है, हालांकि ये एजेंट सूक्ष्मनलिकाएं की स्थानीय एकाग्रता को बढ़ाने के लिए काम करते हैं, वे अक्सर लंबे सूक्ष्मनलिकाएं बंडलों का परिणाम देते हैं लेकिन टैक्टोइड नहीं। इन बंडलों के लंबे होने का एक कारण यह हो सकता है कि इनमें शामिल सूक्ष्मनलिकाएं भी लंबी होती हैं। छोटे सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग करके हाल के काम ने लंबे बंडलों की भी सूचना दी जो अंतमें पतला नहीं हैं 15; इस मामले में, बंडलों को मोटर प्रोटीन के साथ एक साथ रखा जाता है जो बंडलों के विस्तार का कारण बनता है और इस तरह, उन्हें लंबा बनाता है। गैर-एक्सटेंसाइल क्रॉसलिंकर के साथ लघु सूक्ष्मनलिकाएं पतला, धुरी जैसी असेंबली के लिए आवश्यक हैं, जैसा कि यहां वर्णित है।
हाल ही में, हमने स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं22 की उपस्थिति में एंटीपैरेलल क्रॉसलिंकर, एमएपी 65 का उपयोग करके सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स के निर्माण को सक्षम करने के लिए एक तकनीक विकसित की है। सूक्ष्मनलिकाएं छोटी होनी चाहिए, फिर भी सूक्ष्मनलिकाएं लंबाई के कुछ ज्ञात नियामक गतिशील अस्थिरता या एंड-टू-एंड एनीलिंग के खिलाफ सूक्ष्मनलिकाएं कैप कर सकते हैं। इसके बजाय, जीएमपीसीपीपी का उपयोग विकास के बाद फिलामेंट्स को न्यूक्लिएट और स्थिर करने के लिए किया गया था। इसने लघु सूक्ष्मनलिकाएं का एक उच्च घनत्व बनाने की अनुमति दी जो टैक्टोइड्स में स्व-व्यवस्थित हो सकते थे। बिरेफ्रिंजेंस के तहत देखे जाने पर ये टैक्टोइड सजातीय थे। लघु सूक्ष्मनलिकाएं के अलावा, एक विशिष्ट एंटीपैरेलल क्रॉसलिंकर, एमएपी 65, को टैक्टोइड्स (चित्रा 2) बनाने के लिए नियोजित किया गया था। एमएपी 65 माइटोटिक क्रॉसलिंकर्स23 के पीआरसी 1 / एएसई 1 परिवार में एक पौधे सूक्ष्मनलिका से जुड़ा प्रोटीन है। एमएपी 65 एक डिमर के रूप में मौजूद है, जिसमें खुद के साथ-साथ सूक्ष्मनलिकाएं24 को बांधने के लिए एक मजबूत आत्मीयता है। एक्टिन फिलामेंट्स25,26,27 के साथ देखे गए अर्धसूत्रीविभाजन स्पिंडल और टैक्टोइड्स के विपरीत, जो द्विध्रुवी हैं और तरल क्रिस्टल के तरल जैसे गुण हैं, सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स को ठोस जैसे22,28 देखा गया है।
यहां, प्रोटोकॉल सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड बनाने और असेंबली के आकार और प्रतिदीप्ति-आधारित तकनीकों का उपयोग करके घटकों की गतिशीलता की विशेषता के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2% Dichlorodimethylsilane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>118945</td>
			<td>A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-minute epoxy</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td></td>
			<td>For sealing experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>32900HPLC</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 cells</td>
			<td>Bio Labs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Competent bacterial cells used to express MAP65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C30-500MG</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 &#956;l aliquots in -20&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12544-AP</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td>A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889-10G</td>
			<td>Tubulin buffer base ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.5 ml tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402 18</td>
			<td>For holding experimental solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111000200</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with high NA objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E, W2 Confocal</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -20&#176;C</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13986148</td>
			<td>For storing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>328223H01-C</td>
			<td>For storing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass containers for silanization</td>
			<td>Michaels</td>
			<td></td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12544-4</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 &#956;l aliquots in -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133-250KU</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jenna Bioscience</td>
			<td>NU-4055</td>
			<td>Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating element for microscope</td>
			<td>Okolab stage top incubator</td>
			<td></td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidizole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2399</td>
			<td>Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>34155</td>
			<td>For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 230LT22</td>
			<td>To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP65 protein</td>
			<td>Ram Dixit</td>
			<td></td>
			<td>A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 &#956;M solution. This working solution is stored at 4&#176;C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCJ940</td>
			<td>Tubulin buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Nickel beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optomicroscan</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent double-sided tape</td>
			<td>3M - Scotch</td>
			<td>34-8724-5691-7</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7643-100G</td>
			<td>Tubulin buffer base ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic-F127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol</td>
			<td>Affymetrix Inc</td>
			<td>19966 500 GM</td>
			<td>A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4&#176;C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For pipetting viscous liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Racks for coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72240</td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4&#176;C</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td></td>
			<td>For storing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin Labeled</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL590M</td>
			<td>lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80&#176;C until hydrated in PEM80 and used for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td>lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80&#176;C until hydrated in PEM80 and used for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Ozone</td>
			<td>Jelight</td>
			<td>Model 342</td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackreg</td>
			<td>Biomedical Imaging Group</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>plugin for registering time series data to remove drift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turboreg</td>
			<td>Biomedical Imaging Group</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>plugin for registering time series data to remove drift</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of microtubule tactoids

साइटोस्केलेटन सेल के भीतर प्रमुख आंतरिक संगठन और पुन: संगठन के लिए जिम्मेदार है, सभी परिवर्तनों को निर्देशित करने के लिए प्रबंधक के बिना। यह विशेष रूप से माइटोसिस या अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान होता है, जहां सूक्ष्मनलिकाएं कोशिका विभाजन के दौरान धुरी बनाती हैं। धुरी कोशिका विभाजन के दौरान आनुवंशिक सामग्री को अलग करने के लिए उपयोग की जाने वाली मशीनरी है। कृत्रिम परिवेशीय में स्व-संगठित स्पिंडल बनाने की दिशा में, हमने हाल ही में सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़े प्रोटीन और भीड़ एजेंटों के न्यूनतम सेट के साथ धुरी जैसी विधानसभाओं में सूक्ष्मनलिकाएं पुनर्गठित करने के लिए एक तकनीक विकसित की है। विशेष रूप से, एमएपी 65 का उपयोग किया गया था, जो पौधों से एक एंटीपैरेलल माइक्रोट्यूब्यूल क्रॉसलिंकर है, खमीर से एएसई 1 का एक होमोलॉग और स्तनधारी जीवों से पीआरसी 1 है। यह क्रॉसलिंकर सूक्ष्मनलिकाएं को लंबे, पतले, धुरी जैसी सूक्ष्मनलिकाएं स्व-संगठित विधानसभाओं में व्यवस्थित करता है। ये असेंबली लिक्विड क्रिस्टल टैक्टोइड्स के समान हैं, और सूक्ष्मनलिकाएं मेसोस्केल मेसोजेन के रूप में इस्तेमाल की जा सकती हैं। यहां, प्रोटोकॉल इन सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स बनाने के साथ-साथ प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके विधानसभाओं के आकार और फोटोब्लीचिंग के बाद प्रतिदीप्ति वसूली का उपयोग करके घटकों की गतिशीलता की विशेषता के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं।

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Self-Assembly of Microtubule Tactoids

यह लेख एमएपी 65, एक पौधे आधारित सूक्ष्मनलिका क्रॉसलिंकर और खूंटी को भीड़ एजेंट के रूप में उपयोग करके टैक्टोइड्स के आकार में सूक्ष्मनलिकाएं असेंबली के गठन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है।

सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स की स्व-असेंबली

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

यह प्रोटोकॉल एक विरोधी समानांतर क्रॉस-लिंकर, एमएपी 65 का उपयोग करके सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स के सहज आत्म-संगठन को सक्षम बनाता है। यह प्रणाली हमें सूक्ष्मनलिकाएं संगठन और माइटोटिक स्पिंडल जैसे जैविक प्रणालियों को समझने में मदद कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह एक न्यूनतर प्रणाली है जो सूक्ष्मनलिकाएं के लिए धुरी जैसी आकृतियों को फिर से बना सकती है जो कई प्रयोगशालाओं के लिए अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और सुलभ है।यह विधि न केवल सेलुलर प्रणालियों पर लागू होती है, बल्कि मेसो-स्केल लिक्विड क्रिस्टल अध्ययन के लिए एक मॉडल के रूप में भी काम कर सकती है। ट्यूबुलिन तैयार करने के लिए सबसे पहले माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से एक मिलीग्राम लियोफिलाइज्ड ट्यूबुलिन युक्त बिना लेबल वाले ट्यूबुलिन का एक विभाज्य निकालें और इसे बर्फ पर रखें। फिर, ठंडे पीईएम -80 के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।सभी लियोफिलेट को भंग करने के लिए, ट्यूब को 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें। इसके बाद, रोडामाइन-लेबल वाले ट्यूबुलिन की एक ट्यूब निकालें जिसमें माइनस 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से 20 माइक्रोग्राम लियोफिलाइज्ड ट्यूबुलिन पाउडर हो और इसे बर्फ पर रखें। फिर, ठंडे पीईएम -80 के चार माइक्रोलीटर जोड़ें और सभी लियोफिलेट को भंग करने के लिए ट्यूब को 10 मिनट के लिए बर्फ पर रखें।एक बार जब लियोफिलाइज्ड ट्यूबुलिन भंग हो जाते हैं, तो चार-माइक्रोलीटर रोडामाइन-लेबल वाले ट्यूबुलिन समाधान में पुन: निलंबित अनलेबल ट्यूबुलिन समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर, समाधान को छह से सात बार बहुत धीरे-धीरे मिलाएं। बिना लेबल वाले ट्यूबुलिन समाधान के शेष 100 माइक्रोलीटर को स्टोर करने के लिए, सबसे पहले, समाधान को फ्रीज करने के लिए तरल नाइट्रोजन में ट्यूब डालें, फिर ट्यूब को भविष्य के उपयोग के लिए शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर रखें।अगला, प्रत्येक में 15 माइक्रोलीटर जोड़कर ट्यूबुलिन मिश्रण को सात नई ट्यूबों में वितरित करें। तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों को फ्रीज करें जैसा कि पहले दिखाया गया है और भविष्य के उपयोग के लिए उन्हें शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रयोग करने के लिए प्रवाह कक्षों को इकट्ठा करने के लिए, सबसे पहले, डबल-डिस्टिल्ड पानी के साथ एक ग्लास स्लाइड को साफ करें और इसे लिंट-फ्री प्रयोगशाला पोंछे के साथ सुखाएं।इसके बाद, पहले स्लाइड को इथेनॉल के साथ साफ करें, उसके बाद डबल-डिस्टिल्ड वॉटर। प्रवाह पथ बनाने के लिए, डबल-पक्षीय टेप का 40-से-50 मिलीमीटर लंबा टुकड़ा काट लें। फिर, टेप के दो पतले स्ट्रिप्स बनाने के लिए इसे बीच में विभाजित करें और स्लाइड पर दो स्ट्रिप्स को पांच से आठ मिलीमीटर अलग रखें।अगला, प्रवाह पथ के शीर्ष पर सिलेनाइज्ड कवर स्लिप रखें। फिर, स्लाइड को सील करें और कवर ने पेन के पीछे टेप क्षेत्र पर धीरे-धीरे दबाकर डबल-पक्षीय टेप स्ट्रिप्स को फिसल दिया। यदि सील अच्छी तरह से बनाई गई है, तो टेप पारदर्शी से स्पष्ट करने के लिए बारी चाहिए।किनारों पर अतिरिक्त टेप को हटाने के लिए, टेप को रेजर ब्लेड के साथ काट लें, प्रवाह कक्ष प्रवेश द्वार से केवल एक मिलीमीटर छोड़ दें। फिर, उचित प्रयोगात्मक मापदंडों के साथ कक्ष को लेबल करें टैक्टॉइड प्रयोगों को करने के लिए, सबसे पहले, बर्फ पर सभी आवश्यक अभिकर्मकों को पिघलाएं और उन्हें काम के दौरान बर्फ पर स्टोर करें। अगला, अंदर हवा के बुलबुले के गठन को रोकने के लिए कक्ष के दोनों सिरों पर छोटी बूंदों के साथ पीईएम -80 में भंग 5% गैर-आयनिक ब्लॉक कॉपोलिमर सर्फैक्टेंट के 20 माइक्रोलीटर के साथ प्रवाह कक्ष को कोट करें।फिर, प्रवाह कक्ष को कम से कम पांच से सात मिनट के लिए गीले, लिंट-मुक्त प्रयोगशाला पोंछे के साथ पेट्री डिश से बने आर्द्र कक्ष में रखें। अगला, पीईएम -80, जीएमपीपीसीपीपी, प्लूरोनिक एफ -127, डाइथियोथ्रिटोल, ग्लूकोज, पॉलीथीन ग्लाइकॉल, पहले किए गए ट्यूबुलिन मिश्रण, और जीएफपी एमएपी 65 के साथ एमएपी 65 को पांच से छह बार पाइप करके बाँझ ट्यूब में विज़ुअलाइज़ेशन के लिए मिलाएं, बर्फ पर ट्यूब रखते हुए। फिर, ट्यूबुलिन-एमएपी मिश्रण की ट्यूब में ग्लूकोज ऑक्सीडेज और कैटालेज़ के पूर्व-मिश्रित समाधान का एक माइक्रोलीटर जोड़ें और सात से आठ बार पाइप करके फिर से मिलाएं।समाधान की कुल मात्रा को अलग-अलग कक्षों में उपयोग करने के लिए दो भागों में विभाजित करें। इस बीच, प्रवाह कक्ष में पहले जोड़े गए तरल को कक्ष के दूसरे छोर पर लिंट-मुक्त प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग करके केशिका कार्रवाई द्वारा हटा दिया जाना चाहिए, साथ ही प्रवाह कक्ष में ट्यूबुलिन-एमएपी मिश्रण के अलावा। एक बार नमूना पूरी तरह से कक्ष के अंदर हो जाने के बाद, पांच मिनट के एपॉक्सी का उपयोग करके कक्ष के दो सिरों को सील करें और सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स को न्यूक्लिएट और विकसित करने के लिए लगभग 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा टैक्टोइड्स की इमेजिंग के लिए, प्रतिदीप्ति में पर्याप्त प्रकाश एकत्र करने के लिए 60X या उच्च आवर्धन में 1.2 या अधिक के संख्यात्मक एपर्चर के साथ उद्देश्यों का उपयोग करें। एक मानार्थ धातु ऑक्साइड अर्धचालक या चार्ज-युग्मित डिवाइस कैमरा के साथ छवियों को रिकॉर्ड करें। नमूने को बनाए रखने के लिए, इसे 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट पर्यावरण कक्ष में रखें।वैकल्पिक रूप से, गर्म हवा चरण हीटर और परिसंचारी गर्म पानी के साथ उद्देश्य तापमान-नियंत्रित कॉलर सहित अन्य चरण हीटर, इस उद्देश्य के लिए नियोजित किए जा सकते हैं। चूंकि रोडामाइन ट्यूबुलिन के लिए सही प्रतिदीप्ति के लिए उपयुक्त उत्तेजना स्रोत आवश्यक हैं, इसलिए अच्छी गुणवत्ता वाली छवियों के लिए नमूने पर कम से कम एक मिलीवाट शक्ति के साथ 561-नैनोमीटर लेजर का उपयोग करें। हालांकि, जीएफपी एमएपी 65 के लिए, उत्तेजना स्रोत को 488-नैनोमीटर लेजर में बदलें।यदि वाइड-फील्ड एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर रहे हैं, तो 540 12.5 नैनोमीटर की उत्तेजना के साथ रोडामाइन फिल्टर क्यूब का उपयोग करें, 545 नैनोमीटर 12.5 नैनोमीटर कटऑफ के डाइक्रोइक और 575 नैनोमीटर लॉन्ग-पास के उत्सर्जन का उपयोग करें। जीएफपी एमएपी के लिए, 480 15 नैनोमीटर की उत्तेजना के साथ एक जीएफपी फिल्टर क्यूब का उपयोग करें, 505 नैनोमीटर 15 नैनोमीटर कट, और 515 नैनोमीटर लॉन्ग-पास के उत्सर्जन के साथ। यह सुनिश्चित करने के बाद कि रोशनी शक्ति और एक्सपोज़र समय ऐसे हैं कि कैमरे के लिए तीव्रता पैमाने संतृप्त नहीं है, लाल और हरे दोनों चैनलों में 100 से अधिक टैक्टोइड्स की छवि के लिए विभिन्न क्षेत्रों की कम से कम 10 छवियां लें, और उन्हें विश्लेषण के लिए 16-बिट टीआईएफएफ छवियों के रूप में सहेजें।इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स जिनका गठन 30 मिनट के भीतर पूरा हो जाता है, सीधे माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना की जा सकती है। टैक्टोइडट्यूबुलिन चैनल में 561-नैनोमीटर लेजर और एमएपी 65 चैनल में 488-नैनोमीटर लेजर दोनों के साथ दिखाई देते हैं। छवियां भी एक दूसरे के साथ पूरी तरह से ओवरलैप होती हैं।इस विधि में, टैक्टोइड्स की लंबाई और चौड़ाई को भी मापा जा सकता है। एक टैक्टॉइड की तीव्रता प्रोफ़ाइल इसकी चौड़ाई के साथ भिन्न पाई गई थी। इसके अलावा, फोटो-ब्लीचिंग या एफआरएपी प्रयोगों के बाद प्रतिदीप्ति वसूली द्वारा सूक्ष्मनलिकाएं टैक्टोइड्स की स्थिर प्रकृति का प्रदर्शन किया गया था, जिसने फोटो-विरंजन के बाद प्रतिदीप्ति की कोई वसूली नहीं दिखाई थी।दूसरी ओर, एफआरएपी प्रयोगों ने एमएपी 65 की एक मोबाइल प्रकृति का खुलासा किया, जिसके लिए फोटो-विरंजन के बाद धीरे-धीरे वसूली और प्रतिदीप्ति देखी जा सकती है। एमएपी 65 द्वारा यह प्रतिदीप्ति वसूली आयाम और वसूली के समय पैमाने को खोजने के लिए एक बढ़ती घातीय क्षय के लिए फिट हो सकती है। टैक्टॉइड प्रयोग भाग को 10 से 12 मिनट के भीतर पूरा किया जाना चाहिए, क्योंकि ट्यूबुलिन बर्फ पर जल्दी से खराब हो सकता है, जो टैक्टोइड्स के न्यूक्लिएशन के लिए हानिकारक हो सकता है।विभिन्न सूक्ष्मनलिकाएं क्रॉस-लिंकिंग प्रोटीन और क्रॉस-लिंकिंग मोटर प्रोटीन के साथ भविष्य का काम, एंजाइम जो सूक्ष्मनलिकाएं स्थानांतरित कर सकते हैं, माइटोटिक स्पिंडल के आत्म-संगठन पर नई जानकारी का पर्दाफाश करना जारी रखेंगे।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

एक पानी में तेल पायस की centrifugation द्वारा विशालकाय Vesicles encapsulating microspheres की तैयारी

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

फास्फारिलीकरण के लिए परख और कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं में ताऊ प्रोटीन के स्थानीयकरण के साथ बाध्यकारी Microtubule

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

ऊतक की न्यूनतम मात्रा का उपयोग Drosophila के Permeabilized फाइबर में Mitochondrial ऑक्सीजन की खपत का मापन

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

एन के क्रिस्टल संरचना-टर्मिनल डोमेन के Ryanodine रिसेप्टर से Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

उच्च गति के केंद्रापसारक के अभाव में U937 कोशिकाओं के सेल अंश

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

सैकरोमाइसेस सेर्विसियाई स्पलिसिओसोम सबकॉम्प्लेक्स के क्षणिक इंटरप् इंटरेक्टर्स का पता लगाने के लिए ग्रेफिक्स का उपयोग

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

नमूना तैयारी के व्यावहारिक पहलू और आरएनए के 1एच आर 1 ο विश्राम प्रसार प्रयोगों के सेटअप

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

कंकाल की मांसपेशी माइटोकॉन्ड्रिया की प्रोटीन आयात क्षमता का मापन

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Masarimycin का संश्लेषण, ग्राम सकारात्मक जीवाणु विकास का एक छोटा अणु अवरोधक

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

TIRF माइक्रोस्कोपी द्वारा विट्रो में क्रॉसलिंक्ड और एकल सूक्ष्मनलिकाएं की गतिशीलता का एक साथ विज़ुअलाइज़ेशन

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...