Name: self-assembly of microtubule tactoids
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Microtubule Tactoids at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del Ross Lab dell'estate 2021, in particolare K. Alice Lindsay, per il loro aiuto. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione di NSF BIO-2134215 che ha supportato S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee e J.L. Ross. Una sovvenzione della KECK Foundation (Rae Anderson, USD, lead PI) ha parzialmente sostenuto R. Branch e P. Chauhan

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

I metodi qui descritti sono stati utilizzati in diversi articoli per creare tactoidi microtubuli (Figura 2)22,28. Questi esperimenti sono biologicamente rilevanti per aiutare a scoprire i principi organizzativi che controllano la forma e la stabilità del fuso mitotico o meiotico nella maggior parte dei tipi di cellule. Inoltre, i microtubuli sono mesogeni a cristalli liquidi modello che possono aiutare a saperne di più su come i cristalli liquidi nucleano e fanno crescere fasi nematiche da fasi isotrope.
La procedura qui descritta ha diversi vantaggi per esplorare l'auto-organizzazione dei microtubuli. In primo luogo, è altamente riproducibile, essendo stato eseguito in laboratorio da molti studenti, compresi gli studenti delle scuole superiori, con poca preconoscenza o formazione prima di iniziare in laboratorio. I tactoidi sono birifrangenti22, consentendo loro di essere visualizzati in luce trasmessa oltre alla microscopia a fluorescenza, rendendo questo metodo accessibile a molti laboratori e questa procedura sperimentale adattabile a scopi educativi, oltre alla ricerca di fascia alta. Infine, questo processo apre strade per continuare a comprendere e sondare i sistemi biologici in un approccio riduzionista e ridotto, consentendo di capire come ogni condizione aggiuntiva, proteina o additivo può alterare l'auto-organizzazione dei tactoidi e, forse, in definitiva, del fuso. Gli obiettivi per una migliore biomimetica includono attività, fluidità e ordinamento della polarità del filamento.
Ci possono essere diversi fattori che influenzano l'esperimento dando risultati inaspettati. Ad esempio, se i tactoidi non si formano (Figura 2) ma si osservano modelli simili a ventagli, è probabile che il MAP65 non sia presente o non si leghi ai microtubuli22,28. Questo dovrebbe essere evidente anche nel canale di fluorescenza MAP65 perché il GFP-MAP65 non sarà legato ai microtubuli.
Se i tactoidi non si formano e lo sfondo appare come macchie sul vetro, ciò potrebbe essere dovuto al rivestimento superficiale. Una volta eseguita, la silanizzazione dura solo 1 mese su coverslips. Quando svanisce, la tubulina sarà in grado di legarsi alla superficie esposta in modo non specifico. Questa associazione si verificherà in modelli dispari.
Se i tactoidi non si formano e la tubulina viene osservata in aggregati di varie forme e dimensioni, ciò potrebbe essere dovuto alla tubulina di scarsa qualità. La tubulina può essere centrifugata per rimuovere gli aggregati iniziali che possono guidare questa aggregazione fuori percorso invece della polimerizzazione dei microtubuli. Se la superficie è legata alla tubulina, può anche esaurire la tubulina nella soluzione. Basse concentrazioni di tubulina, al di sotto della concentrazione critica per la polimerizzazione dei microtubuli, possono provocare aggregati.
Negli esperimenti FRAP, se il canale MAP65 non mostra alcun recupero (Figura 5), è possibile che il fotosbiancamento stesse fotodannando i microtubuli. Il fotodanno provoca la distruzione localizzata dei filamenti. Questo può essere verificato mediante esame nel canale trasmesso. I tactoidi dei microtubuli sono visibili nel canale trasmesso attraverso un alto indice di mancata corrispondenza della rifrazione con l'acqua circostante. Il fotodanno indotto dalla luce apparirà come un segno di bruciatura o perdita di contrasto nell'imaging della luce trasmessa nella posizione del ROI sottoposto a fotosbiancamento. Se ciò accade, la potenza del laser o della luce deve essere ridotta per inibire il fotodanno delle proteine.
Ci sono state diverse sfide incontrate in questa procedura e approccio. Un problema è che le misure di lunghezza vengono attualmente eseguite a mano facendo clic sull'immagine. Questo metodo, sebbene semplice, può causare un'elevata incertezza. La misurazione della larghezza che utilizza la sezione trasversale e l'adattamento a un gaussiano è un metodo migliore per quantificare la dimensione. Un metodo simile potrebbe essere impiegato per la lunghezza. Un secondo problema è che, a volte, i tactoidi, perché sono così lunghi e sottili, possono piegarsi. Ciò rende più difficile quantificare la lunghezza. La lunghezza del contorno può essere quantificata utilizzando una linea segmentata, ma c'è un'incertezza aggiuntiva ogni volta che viene aggiunto un segmento.
Da un punto di vista scientifico, questo approccio ha alcune altre sfide per il suo uso come modello per cristalli liquidi o mandrini. La prima sfida è stata la forma lunga e sottile dei tactoidi che i microtubuli creano (Figura 3 e Figura 4). Come notato nelle precedenti pubblicazioni22, i tactoidi dei microtubuli sono tactoidi omogenei, non bipolari. Ciò significa che i microtubuli che compongono la forma non si riorientano per puntare verso le punte della struttura. Invece, tutti i microtubuli sono paralleli all'asse lungo e i "poli" si trovano all'infinito. Questo è molto diverso dai tactoidi osservati per i cristalli liquidi molecolari o anche per l'actina o il DNA che possono anche agire come mesogeni a cristalli liquidi. In questi altri sistemi, i tactoidi sono bipolari e, se visti in polarizzatori incrociati, mostrano i segni rivelatori di riorientamento delle aste.
Una seconda grande sfida in questo sistema è che i microtubuli sono immobili all'interno del tactoide. Questo è chiaro dagli esperimenti e dalle analisi FRAP poiché il recupero dei microtubuli è molto basso. La loro natura solida rende i tactoidi dei microtubuli meno preziosi degli analoghi a cristalli liquidi su larga scala. La fase nematica di un cristallo liquido dovrebbe avere proprietà sia liquide (fluide) che cristalline (organizzate). Sebbene la forma sembri giusta per il mandrino, l'immobilità rende il sistema meno eccitante come un mandrino mitotico modello. D'altra parte, questo numero offre l'opportunità di indagare su come è possibile modificare gli esperimenti per creare più fluidità nel sistema.
Queste sfide scientifiche offrono interessanti opportunità che consentiranno nuove conoscenze sul sistema. Per rendere i tactoidi dei microtubuli più bipolari, si potrebbero usare microtubuli più corti. C'è un'ulteriore sfida, tuttavia, dal momento che i microtubuli non hanno molte proteine di tappatura ben caratterizzate per controllare la lunghezza come fa l'actina. L'uso della nucleazione e della crescita richiede l'uso di concentrazioni molto elevate di tubulina e GMPCPP per produrre microtubuli corti. L'alta concentrazione di tubulina si traduce in un numero maggiore di filamenti nel sistema, il che rende più difficile separare i tactoidi l'uno dall'altro. L'aggiunta di nuovi tappi di microtubuli, come DARPin33, può aiutare in questa situazione. Il secondo problema dell'immobilità dei microtubuli potrebbe essere mitigato dall'aggiunta di proteine motorie, come la kinesin-534, che sono tetrameri di motori utilizzati nella mitosi. In alternativa, i dimeri artificiali di kinesin-1 dimerica potrebbero essere usati15.
Un altro modo per aggiungere più fluidità sarebbe quello di consentire ai microtubuli di eseguire la loro instabilità dinamica, la crescita e il restringimento dei microtubuli. Attualmente, i microtubuli che vengono seminati con filamenti GMPCPP stabili e quindi subiscono instabilità dinamica sono molto più lunghi di quanto desiderato per formare un fuso o un tactoide, il che si tradurrebbe in organizzazioni molto lunghe come ventilatori o fasci. Quindi, l'aggiunta di instabilità dinamica dei microtubuli dovrebbe essere fatta con attenzione per preservare la forma tattile. L'aggiunta di proteine ed enzimi associati in grado di controllare la lunghezza può mitigare questo problema. Ad esempio, sarebbero probabilmente necessarie kinesine depolimerizzanti, come la kinesin-1335, o enzimi di taglio, come lakatanina 36. Questi esperimenti sono complessi e difficili, anche se sarebbero molto perspicaci, indipendentemente da ciò che i risultati rivelano. Qualunque sia la direzione degli esperimenti futuri, la piattaforma sviluppata qui per la creazione di tactoidi microtubuli può esporre nuove informazioni sulla base fisica dell'organizzazione dei microtubuli.

La divisione cellulare tramite mitosi è uno dei processi biologici più importanti per sostenere la vita. I filamenti di microtubuli, composti da dimeri di tubulina, sono elementi strutturali essenziali di questo processo. Il meccanismo transitorio creato in metafase quando i cromosomi si allineano nel centro cellulare è chiamato fuso mitotico a causa della sua forma, che è come un fuso di un telaio coperto di fili (Figura 1A). È ben noto in molti organismi che i microtubuli sono usati nella metafase per spingere e tirare i cromosomi condensati nel centro della cellula, allineandoli e collegandoli a microtubuli che li separeranno in anafase (Figura 1B, C). Il mandrino si forma sia in meiosi (Figura 1B) che in mitosi (Figura 1C), creato da molti microtubuli sovrapposti non avvolti attorno all'asse centrale come filo ma che corrono paralleli all'interfaccia. La creazione di queste strutture basate su microtubuli richiede proteine associate che si reticolano e enzimi associati che possono agire come motori per aiutare a spingere e tirare i cromosomi1.
Studi sui fusi meiotici hanno dimostrato che i microtubuli sono corti, dinamici e sovrapposti in array reticolati 2,3,4,5,6 (Figura 1Di). A causa dell'organizzazione fisica di questi microtubuli corti, il fuso meiotico è simile a un tactoide a cristalli liquidi (Figura 1E). In effetti, è stato dimostrato che i mandrini si fondono e si fondono, come ci si aspetterebbe dai tactoidi a cristalli liquidi5.
Molti studi risalenti al 1960 hanno utilizzato la fissazione, le sezioni seriali e la microscopia elettronica per determinare che ci sono due tipi di microtubuli all'interno del fuso mitotico 7,8,9,10. Il primo tipo è chiamato microtubuli di chinetocore, che collegano il polo del fuso al chinetocore. Il secondo tipo è chiamato microtubuli interpolari o polari, che crescono oltre i cromosomi e si sovrappongono nella zona centrale (Figura 1Dii)8,9,10. Un terzo tipo è chiamato microtubuli astrali, che si trovano all'esterno del fuso e collegano i poli al bordo cellulare; queste organizzazioni di microtubuli sono al di fuori dell'ambito della discussione in corso. Ci sono stati studi recenti sull'interazione tra augmin6 e complesso dell'anello gamma-tubulina che influenza i centri di nucleazione per i microtubuli, risultando in un fuso mitotico con microtubuli più corti come nella Figura 1D.
Poiché i microtubuli sono più lunghi di quanto siano larghi, con un elevato rapporto di aspetto e un'elevata rigidità, sono come versioni in scala di molecole a cristalli liquidi. Nella fisica della materia soffice, atomi e molecole sono stati approssimati usando interazioni minime per dedurre i meccanismi fisici delle transizioni di fase, tra cui la nucleazione e la fusione dei cristalli11. Allo stesso modo, i microtubuli sono oggetti a mesoscala che sono versioni in scala di molecole a cristalli liquidi, fornendo approfondimenti sulla fisica della dinamica dei cristalli liquidi, compresa la nucleazione e la crescita delle fasi nematiche da quelle isotrope. Inoltre, come discusso sopra, il fuso meiotico mostra proprietà come quelle di un tactoide a cristalli liquidi, uno stato nematico che nuclea e cresce dallo stato isotropo delle molecole a cristalli liquidi 3,4,5. Per i tactoidi, la nucleazione e la crescita sono come quelle di altri cristalli (cioè, richiedono una concentrazione relativamente alta di mesogeni [le molecole che formano i cristalli liquidi]). L'unica forma a "mandrino" del tactoide deriva dall'allineamento locale dei mesogeni a cristalli liquidi che si allineano nella fase nematica (Figura 1E). Non possono formare un cristallo arrotondato perché le molecole sono altamente asimmetriche. Data la natura dei microtubuli, forse non sorprende che anche il macchinario del fuso mitotico costituito da un'alta concentrazione locale di microtubuli sia della stessa forma, sia che si chiami tactoide o fuso. I tactoidi possono essere bipolari, con poli alle estremità affusolate (Figura 1Ei), o omogenei, con poli effettivamente all'infinito (Figura 1Eii).
Data l'importanza della formazione del fuso, sono stati avviati sforzi verso la formazione di mandrino auto-organizzata in vitro dimostrando la condensazione dei microtubuli in fasci attraverso specie ioniche12,13, agenti di affollamento che creano interazioni di deplezione14,15 e specifiche proteine reticolanti di microtubuli 13,16,17,18,19, 21. Sorprendentemente, sebbene questi agenti lavorino tutti per aumentare la concentrazione locale di microtubuli, spesso si traducono in lunghi fasci di microtubuli ma non tactoidi. Uno dei motivi per cui questi fasci sono lunghi potrebbe essere che anche i microtubuli che li compongono sono lunghi. Lavori recenti che utilizzano microtubuli più corti hanno anche riportato fasci più lunghi che non sono affusolati alla fine15; in questo caso, i fasci sono tenuti insieme con proteine motorie che causano l'estensione dei fasci e, quindi, li rendono più lunghi. I microtubuli corti con reticolanti non estensibili sono necessari per assemblaggi conici simili a mandrini, come descritto qui.
Recentemente, abbiamo sviluppato una tecnica per consentire la creazione di tactoidi microtubuli utilizzando il reticolante antiparallelo, MAP65, in presenza di microtubuli stabili nucleanti22. I microtubuli dovevano essere corti, ma pochi regolatori noti della lunghezza dei microtubuli possono tappare i microtubuli contro l'instabilità dinamica o la ricottura end-to-end. Invece, GMPCPP è stato utilizzato per nucleare e stabilizzare i filamenti dopo la crescita. Ciò ha permesso di creare un'alta densità di microtubuli corti che potrebbero auto-organizzarsi in tactoidi. Questi tactoidi erano omogenei se visti sotto birifrangenza. Oltre ai microtubuli corti, uno specifico reticolante antiparallelo, MAP65, è stato impiegato per formare i tactoidi (Figura 2). MAP65 è una proteina associata a microtubuli vegetali della famiglia PRC1/Ase1 dei reticolanti mitotici23. MAP65 esiste come dimero, con una forte affinità di legarsi a se stesso così come ai microtubuli24. A differenza del fuso meiotico e dei tactoidi osservati con i filamenti di actina 25,26,27, che sono bipolari e hanno le proprietà liquide dei cristalli liquidi, i tactoidi dei microtubuli sono stati osservati essere solidicome 22,28.
Qui vengono presentati i protocolli per la creazione dei tactoidi dei microtubuli e la caratterizzazione della forma degli assiemi e della mobilità dei costituenti utilizzando tecniche basate sulla fluorescenza.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2% Dichlorodimethylsilane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>118945</td>
			<td>A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-minute epoxy</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td></td>
			<td>For sealing experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>32900HPLC</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 cells</td>
			<td>Bio Labs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Competent bacterial cells used to express MAP65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C30-500MG</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 &#956;l aliquots in -20&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12544-AP</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td>A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889-10G</td>
			<td>Tubulin buffer base ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.5 ml tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402 18</td>
			<td>For holding experimental solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111000200</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with high NA objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E, W2 Confocal</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -20&#176;C</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13986148</td>
			<td>For storing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>328223H01-C</td>
			<td>For storing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass containers for silanization</td>
			<td>Michaels</td>
			<td></td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12544-4</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 &#956;l aliquots in -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133-250KU</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jenna Bioscience</td>
			<td>NU-4055</td>
			<td>Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating element for microscope</td>
			<td>Okolab stage top incubator</td>
			<td></td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidizole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2399</td>
			<td>Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>34155</td>
			<td>For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 230LT22</td>
			<td>To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP65 protein</td>
			<td>Ram Dixit</td>
			<td></td>
			<td>A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 &#956;M solution. This working solution is stored at 4&#176;C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCJ940</td>
			<td>Tubulin buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Nickel beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optomicroscan</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent double-sided tape</td>
			<td>3M - Scotch</td>
			<td>34-8724-5691-7</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7643-100G</td>
			<td>Tubulin buffer base ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic-F127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol</td>
			<td>Affymetrix Inc</td>
			<td>19966 500 GM</td>
			<td>A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4&#176;C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For pipetting viscous liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Racks for coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72240</td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4&#176;C</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td></td>
			<td>For storing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin Labeled</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL590M</td>
			<td>lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80&#176;C until hydrated in PEM80 and used for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td>lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80&#176;C until hydrated in PEM80 and used for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Ozone</td>
			<td>Jelight</td>
			<td>Model 342</td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackreg</td>
			<td>Biomedical Imaging Group</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>plugin for registering time series data to remove drift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turboreg</td>
			<td>Biomedical Imaging Group</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>plugin for registering time series data to remove drift</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of microtubule tactoids

Il citoscheletro è responsabile della principale organizzazione interna e della riorganizzazione all'interno della cellula, il tutto senza un manager che diriga i cambiamenti. Questo è particolarmente vero durante la mitosi o la meiosi, dove i microtubuli formano il fuso durante la divisione cellulare. Il mandrino è il macchinario utilizzato per separare il materiale genetico durante la divisione cellulare. Verso la creazione di fusi auto-organizzati in vitro, abbiamo recentemente sviluppato una tecnica per ricostituire i microtubuli in assemblaggi simili a mandrini con un set minimo di proteine associate ai microtubuli e agenti di affollamento. Nello specifico, è stato utilizzato MAP65, che è un reticolante microtubulo antiparallelo dalle piante, un omologo di Ase1 dal lievito e PRC1 da organismi di mammiferi. Questo reticolante auto-organizza i microtubuli in gruppi auto-organizzati di microtubuli lunghi, sottili e simili a mandrini. Questi assemblaggi sono anche simili ai tactoidi a cristalli liquidi e i microtubuli potrebbero essere usati come mesogeni a mesoscala. Qui vengono presentati protocolli per la creazione di questi tactoidi microtubuli, nonché per caratterizzare la forma degli assiemi utilizzando la microscopia a fluorescenza e la mobilità dei costituenti utilizzando il recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento.

Con solo un piccolo numero di componenti, dimeri di tubulina e reticolatori di microtubuli, possono formarsi tactoidi di microtubuli (Figura 2A). Sebbene questo protocollo descriva l'incubazione per nucleare e far crescere microtubuli in un incubatore, la nucleazione e la crescita possono essere osservate direttamente al microscopio (che sono complete entro 30 minuti) (Figura 2B). La concentrazione di tubulina è mantenuta costante a 13,6 μm e il legame MAP65-MT al 10%.
La Figura 4 rappresenta i dati riusciti. I tactoidi dovrebbero essere visibili sia con un laser a 561 nm nel canale della tubulina che con 488 nm nel canale MAP65, che si sovrappongono perfettamente l'uno con l'altro (Figura 4A). Un mistero del sistema è stato che la larghezza dei tactoidi non sembra variare sotto una varietà di cambiamenti sperimentali, tra cui la modifica delle lunghezze dei microtubuli, la concentrazione di MAP65 e gli agenti di affollamento (Figura 4B) 22,28. La lunghezza è molto più variabile e dipende sia dalla lunghezza dei microtubuli che dalla concentrazione di MAP65 (Figura 4B)22,28.
Durante l'esecuzione di FRAP, è stato osservato che il segnale MAP65 si riprende, ma il segnale dei microtubuli non si riprende (Figura 5). Il recupero in FRAP è dovuto alla mobilità e al movimento degli oggetti etichettati e fotosbiancati. Nel caso del MAP65, le molecole oscurate si dissociano e si allontanano dal microtubulo e quelle nuove si spostano nella regione (Figura 5). Il legame MAP65 è in equilibrio, quindi il tasso di legame e svincolo è uguale (misurato in molecole al secondo). Per i microtubuli, non è stato osservato alcun recupero che implica che i microtubuli non sono in grado di lasciare il tactoide (Figura 5A, Bi, C). Inoltre, non è stata osservata alcuna diffusione della regione oscurata, suggerendo che i microtubuli sono localmente immobili e non un fluido all'interno della forma tactoide.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg"> Figura 1: Diversi modelli di formazione del mandrino. Un fuso mitotico è una macchina fatta di microtubuli e delle loro proteine ed enzimi associati che allinea e separa i cromosomi nelle due nuove cellule figlie durante la divisione cellulare. (A) Immagine di una replica del fuso a goccia dell'alto Medioevo con filati pregiati provenienti dai Paesi Bassi. Questa figura è stata modificata da un'immagine Wikimedia di Peter van der Sluijs30. (B) Ricostruzione tridimensionale di microtubuli in diversi stadi della meiosi wild-type II. I microtubuli sono mostrati in verde e i cromosomi sono mostrati in grigio. Barra della scala = 1 μm. Questa cifra è stata modificata da Lantzsch et al.31. (C) Immagine al microscopio dei microtubuli in un fuso mitotico di una cellula Sf9 in divisione. I poli del fuso e i microtubuli del fuso sono etichettati con una proteina fluorescente verde. Barra di scala = 5 μm. Questa cifra è stata modificata da Advani et al.32. (D) Diversi modelli di come sono organizzati i microtubuli del fuso mitotico e meiotico. (i) Precedentemente osservati per i fusi meiotici creati da estratti di uova di Xenopus, i microtubuli (verdi) sono stati dedotti come corti e dinamici in tutto il fuso. Questo è simile a un'organizzazione tactoide bipolare all'interno di un cristallo liquido. (ii) Il modello canonico per l'organizzazione dei microtubuli all'interno di un fuso mitotico ha due tipi di microtubuli: microtubuli interpolari o polari (verde scuro) che si reticolano nella zona centrale attorno ai cromosomi e microtubuli di chinetocore (verde chiaro) che sono raggruppati e allungati dal polo al chinetocore per spingere e tirare i cromosomi. In tutte le immagini, i cromosomi sono mostrati in blu trasparente e i poli del fuso sono rappresentati in verde scuro. (E) Schemi di mesogeni (linee verdi) in un tactoide a cristalli liquidi per (i) tactoidi bipolari e (ii) omogenei. I tactoidi bipolari hanno due poli all'estremità del tactoide e i mesogeni si riorientano per puntare a quei poli. I tactoidi omogenei hanno poli all'infinito e i mesogeni non cambiano orientamento lungo la lunghezza del tactoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg"> Figura 2: Condensazione dei microtubuli. (A) I microtubuli possono essere raggruppati e reticolati con una varietà di metodi, tra cui specie ioniche, forze di esaurimento causate da agenti di affollamento e specifici reticolanti di microtubuli, come MAP65. i) I dimeri di tubulina e le proteine MAP65 sono miscelati per nucleare e far crescere microtubuli. (ii) I microtubuli nucleano e crescono dalla tubulina, e MAP65 si lega immediatamente ai microtubuli, un altro monomero MAP65 o entrambi e causa il raggruppamento. iii) I microtubuli nei fasci reticolati nucleano e crescono. (iv) La configurazione finale è un tactoide microtubulico simile a un mandrino. (B) Serie temporale di tactoidi microtubulici che nucleano e crescono oltre 105 min. Barra di scala = 5 μm. Figura adattata da Edozie et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg"> Figura 3: Assemblaggio della camera di flusso. La camera di flusso è realizzata utilizzando un vetrino, vetro di copertura silanizzato e nastro biadesivo permanente. La regione evidenziata in giallo è il percorso del flusso in cui il campione viene fluito e osservato. Il volume della camera di flusso è di ~ 20 μL. La resina epossidica è stata utilizzata per sigillare le estremità della camera per evitare che il campione evaporasse durante l'imaging a lungo termine per diverse ore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg"> Figura 4: Immagini tactoidi e analisi di lunghezza e larghezza. (A) Dati di esempio di tactoidi formati come descritto e ripresi utilizzando la confocale del disco rotante che mostra (i) l'imaging del canale dei microtubuli tubulina marcata con rodamina utilizzando un laser a 561 nm, (ii) il canale GFP-MAP65 che visualizza la GFP utilizzando un laser a 488 nm e (iii) l'immagine di sovrapposizione unita dal canale dei microtubuli (magenta) e dal canale GFP-MAP65 (ciano). Le regioni di sovrapposizione vengono visualizzate come bianche e dimostrano che i microtubuli e MAP65 si colocalizzano esattamente. Barra di scala = 10 μm per tutte le immagini in (A). (B) Quantificazione della lunghezza e della larghezza dei tactoidi. (i) Immagine di un tactoide da analizzare senza etichette. Barra della scala = 5 μm. (ii) Stessa immagine del punto (i), dove sono indicate le misure di lunghezza (linea continua con tappi di linea) e larghezza (linea tratteggiata). Barra della scala = 5 μm. (iii) La larghezza è stata misurata prendendo il profilo di intensità attraverso il tactoide alla bisettrice perpendicolare (linea tratteggiata) indicata in (ii). Il profilo di intensità era adatto a una funzione gaussiana per rivelare l'ampiezza e la larghezza del tactoide. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg"> Figura 5: Dati FRAP rappresentativi e analisi. (A) Dati delle serie temporali al microscopio di (i) microtubuli tactoidi e (ii) GFP-MAP65 e (iii) immagine sovrapposta di entrambi i canali con microtubuli in magenta e GFP-MAP65 in ciano che sono stati fotosbiancati al tempo 63 s e osservati per altri 5 minuti. (B) Intensità quantificata del (i) ) canale microtubulico nella regione sbiancata (cerchi magenta) e lo sfondo (occhiaie grigio scuro) e (ii) canale GFP-MAP65 nella regione sbiancata (quadrati ciano) e lo sfondo (quadrati grigio scuro). (C) I dati sono stati corretti per il rumore di fondo e riscalati per il canale dei microtubuli (cerchi magenta) e il canale GFP-MAP65 (quadrati ciano). I microtubuli non recuperano, ma il GFP-MAP65 lo fa e può essere adattato (linea grigio scuro) a un crescente decadimento esponenziale per trovare l'ampiezza e la scala temporale del recupero. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Microtubule Tactoids at JoVE.com

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Questo articolo presenta un protocollo per la formazione di assemblaggi di microtubuli a forma di tactoidi utilizzando MAP65, un reticolante di microtubuli a base vegetale e PEG come agente di affollamento.

Auto-assemblaggio di microtubuli tactoidi

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Questo protocollo consente l'auto-organizzazione spontanea dei tactoidi dei microtubuli utilizzando un cross-linker anti-parallelo, MAP65. Questo sistema può aiutarci a capire l'organizzazione dei microtubuli e i sistemi biologici come i fusi mitotici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un sistema minimalista in grado di ricreare forme simili a mandrini per microtubuli che è altamente riproducibile e accessibile a molti laboratori.Questo metodo non è applicabile solo ai sistemi cellulari, ma può anche servire da modello per studi sui cristalli liquidi su mesoscala. Per preparare la tubulina, prima estrarre un'aliquota di tubulina non etichettata contenente un milligrammo di tubulina liofilizzata dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e tenerla sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 200 microlitri di PEM-80 freddo.Per sciogliere tutto il liofilo, tenere il tubo sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi, estrarre un tubo di tubulina marcata con rodamina contenente 20 microgrammi di polvere di tubulina liofilizzata dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e tenerlo sul ghiaccio. Quindi, aggiungere quattro microlitri di PEM-80 freddo e mantenere il tubo sul ghiaccio per 10 minuti per sciogliere tutto il liofilato.Una volta che le tubuline liofilizzate si sono dissolte, aggiungere 100 microlitri della soluzione di tubulina non etichettata risospesa alla soluzione di tubulina marcata con rodamina a quattro microliti. Quindi, mescolare le soluzioni convogliando da sei a sette volte molto lentamente. Per conservare i restanti 100 microlitri di soluzione di tubulina non etichettata, in primo luogo, inserire il tubo in azoto liquido per congelare la soluzione, quindi mantenere il tubo a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro.Quindi, distribuire la miscela di tubuline in sette nuovi tubi aggiungendo 15 microlitri in ciascuno. Congelare i tubi in azoto liquido come dimostrato in precedenza e conservarli a meno 80 gradi Celsius per un uso futuro. Per assemblare le camere di flusso per l'esecuzione di esperimenti, in primo luogo, pulire un vetrino con acqua a doppia distillazione e asciugarlo con una salvietta da laboratorio priva di lanugine.Quindi, pulire prima la diapositiva con etanolo seguito da acqua a doppio distillato. Per creare un percorso di flusso, tagliare un pezzo di nastro biadesivo lungo da 40 a 50 millimetri. Quindi, dividerlo tra loro per creare due strisce di nastro più sottili e posizionare le due strisce sulla diapositiva da cinque a otto millimetri di distanza.Quindi, posizionare gli scivoli di copertura silanizzati sulla parte superiore del percorso del flusso. Quindi, sigillare il vetrino e coprire le strisce di nastro biadesivo premendo delicatamente sulla regione del nastro con il retro di una penna. Se il sigillo è fatto bene, il nastro dovrebbe passare da traslucido a trasparente.Per rimuovere il nastro extra sui bordi, tagliare il nastro con una lama di rasoio, lasciando solo un millimetro dall'ingresso della camera di flusso. Quindi, etichettare la camera con parametri sperimentali appropriati Per eseguire gli esperimenti tactoidi, in primo luogo, scongelare tutti i reagenti necessari sul ghiaccio e conservarli sul ghiaccio durante il lavoro. Successivamente, rivestire la camera di flusso con 20 microlitri di tensioattivo copolimero a blocchi non ionici al 5% disciolto in PEM-80 con piccole gocce ad entrambe le estremità della camera per prevenire la formazione di bolle d'aria all'interno.Quindi, tenere la camera di flusso in una camera umida fatta di capsula di Petri con una salvietta da laboratorio bagnata e priva di lanugine per almeno cinque-sette minuti. Successivamente, mescolare PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, ditiotreitolo, glucosio, polietilenglicole, la miscela di tubuline prodotta in precedenza e MAP65 con GFP MAP65 per la visualizzazione in un tubo sterile pipettando da cinque a sei volte, mantenendo il tubo sul ghiaccio. Quindi, aggiungere un microlitro di una soluzione premiscelata di glucosio ossidasi e catalasi nel tubo della miscela tubulina-MAP e mescolare di nuovo convogliando da sette a otto volte.Dividere il volume totale della soluzione in due porzioni da utilizzare in camere separate. Nel frattempo, il liquido aggiunto in precedenza alla camera di flusso deve essere rimosso per azione capillare utilizzando una salvietta da laboratorio priva di lanugine all'altra estremità della camera, insieme all'aggiunta della miscela tubulina-MAP alla camera di flusso. Una volta che il campione è completamente all'interno della camera, sigillare le due estremità della camera usando resina epossidica di cinque minuti e tenerlo a 37 gradi Celsius per circa 30 minuti per nucleare e far crescere i tactoidi dei microtubuli.Per l'imaging dei tactoidi mediante microscopia a fluorescenza, utilizzare obiettivi con un'apertura numerica di 1,2 o più in ingrandimento 60X o superiore per raccogliere abbastanza luce in fluorescenza. Registrare le immagini con un semiconduttore di ossido di metallo gratuito o una fotocamera ad accoppiamento di carica. Per mantenere il campione, tenerlo in una camera ambientale impostata a 37 gradi Celsius.In alternativa, altri riscaldatori a stadi, tra cui riscaldatori ad aria calda e collari a temperatura controllata obiettiva con acqua calda circolante, possono essere utilizzati per questo scopo. Poiché le fonti di eccitazione appropriate sono essenziali per la corretta fluorescenza per la tubulina rodamina, utilizzare un laser a 561 nanometri con almeno un milliwatt di potenza sul campione per immagini di buona qualità. Tuttavia, per GFP MAP65, modificare la sorgente di eccitazione in un laser a 488 nanometri.Se si utilizza la microscopia a epifluorescenza a campo largo, utilizzare un cubo di filtro rodaminico con un'eccitazione di 540 12,5 nanometri, dicroico di 545 nanometri 12,5 nanometri di cutoff ed emissione di 575 nanometri di passaggio lungo. Per GFP MAP, utilizzare un cubo filtrante GFP con eccitazione di 480 15 nanometri, dicroico di 505 nanometri 15 nanometri tagliato ed emissione di 515 nanometri long-pass. Dopo esserti assicurato che la potenza di illuminazione e i tempi di esposizione siano tali che la scala di intensità per la fotocamera non sia satura, scatta almeno 10 immagini di aree diverse per visualizzare oltre 100 tactoidi nei canali rosso e verde e salvale come immagini TIFF a 16 bit per l'analisi.Utilizzando questo protocollo, i tactoidi microtubuli la cui formazione viene completata entro 30 minuti possono essere visualizzati direttamente al microscopio. I tactoidi sono visibili sia con un laser a 561 nanometri nel canale della tubulina che con un laser a 488 nanometri nel canale MAP65. Anche le immagini si sovrappongono perfettamente l'una con l'altra.In questo metodo, è possibile misurare anche la lunghezza e la larghezza dei tactoidi. Il profilo di intensità di un tactoide è risultato variare con la sua larghezza. Inoltre, la natura immobile dei tactoidi dei microtubuli è stata dimostrata dal recupero della fluorescenza dopo esperimenti di foto-sbiancamento o FRAP, che non hanno mostrato alcun recupero di fluorescenza dopo il foto-sbiancamento.D'altra parte, gli esperimenti FRAP hanno rivelato una natura mobile di MAP65, per la quale è stato possibile osservare un graduale recupero e fluorescenza dopo il foto-sbiancamento. Questo recupero di fluorescenza da parte di MAP65 può essere adattato a un decadimento esponenziale crescente per trovare l'ampiezza e la scala temporale del recupero. La parte dell'esperimento tattile dovrebbe essere completata entro 10-12 minuti, poiché la tubulina può andare a male sul ghiaccio rapidamente, il che può essere dannoso per la nucleazione dei tactoidi.Il lavoro futuro con diverse proteine reticolanti di microtubuli e proteine motorie reticolanti, enzimi in grado di spostare microtubuli, continuerà a esporre nuove informazioni sull'auto-organizzazione del fuso mitotico.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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