Name: self-assembly of microtubule tactoids
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Microtubule Tactoids at JoVE.com

Forfatterne vil takke alle Ross Lab-medlemmene sommeren 2021, spesielt K. Alice Lindsay, for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra NSF BIO-2134215 som støttet S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee og J.L. Ross. Et stipend fra KECK Foundation (Rae Anderson, USD, lead PI) støttet delvis R. Branch og P. Chauhan

<ol>
	<li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+proteins:+structuring+the+cytoskeleton.">Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).</li><li>Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+meiotic+spindle+assembly+and+function.">Oocyte meiotic spindle assembly and function.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).</li><li>Brugu&#233;s, J., Needleman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+spindle+self-organization.">Physical basis of spindle self-organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).</li><li>Brugu&#233;s, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+transport+organize+microtubules+in+metaphase+spindles.">Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles.</a> Cell. 149 (3), 554-564 (2012).</li><li>Gatlin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+fusion+requires+dynein-mediated+sliding+of+oppositely+oriented+microtubules.">Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules.</a> Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).</li><li>Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmin:+A+protein+complex+required+for+centrosome-independent+microtubule+generation+within+the+spindle.">Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle.</a> Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).</li><li>Inoue, S., Sato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+by+labile+association+of+the+nature+of+mitotic+spindle+fibers+and+their+role+in+chromosome+movement+molecules.">Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules.</a> Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).</li><li>Allenspach, A. L., Roth, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variations+during+mitosis+in+the+chick+embryo.">Structural variations during mitosis in the chick embryo.</a> Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).</li><li>Theg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+microtubules+in+different+animal+cells.">Cytoplasmic microtubules in different animal cells.</a> Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).</li><li>Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+anaphase+spindle+elongation+in+Diatoma+vulgare.">On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare.</a> Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).</li><li>Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Condensed Matter Physics. , (1995).</li><li>Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastr&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assembly+and+collective+behavior+of+microtubule+bundles+in+the+presence+of+polyamines.">Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines.</a> Biophysical Journal. 101 (1), 205 (2011).</li><li>Needleman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+assembly+of+microtubules+by+counterions:+From+hexagonal+bundles+to+living+necklaces.">Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).</li><li>Ross, J. L., Fygenson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+taxol+in+microtubule+bundles.">Mobility of taxol in microtubule bundles.</a> Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).</li><li>Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-like+beating+of+active+microtubule+bundles.">Cilia-like beating of active microtubule bundles.</a> Science. 333 (6041), 456-459 (2011).</li><li>Brandt, R., Lee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+microtubule-associated+protein+tau.+Identification+of+regions+which+affect+microtubule+growth,+nucleation,+and+bundle+formation+in+vitro.">Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).</li><li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+organization+and+dynamics+dependent+on+microtubule-associated+proteins.">Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA.">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173 (1989).</li><li>MacRae, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+organization+by+cross-linking+and+bundling+proteins.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+(BBA).">Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).</li><li>She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+Ase1/PRC1/MAP65+family+in+central+spindle+assembly.">Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly.</a> Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).</li><li>Walczak, C. E., Shaw, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+for+Bundling+Microtubules.">A MAP for Bundling Microtubules.</a> Cell. 142 (3), 364-367 (2010).</li><li>Edozie, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+spindle-like+microtubule+structures.">Self-organization of spindle-like microtubule structures.</a> Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).</li><li>Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+the+microtubule+cross-linking+protein+MAP65-1+reveals+a+molecular+mechanism+for+contact-angle-dependent+microtubule+bundling.">Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling.</a> Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).</li><li>Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+65-kDa+carrot+microtubule-associated+protein+forms+regularly+arranged+filamentous+cross-bridges+between+microtubules.">The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).</li><li>Scheff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+shape+and+internal+structure+of+protein+droplets+via+biopolymer+filaments.">Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments.</a> Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).</li><li>Weirich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+behavior+of+cross-linked+actin+bundles.">Liquid behavior of cross-linked actin bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).</li><li>Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+motors+divide+active+liquid+droplets.">Self-organizing motors divide active liquid droplets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).</li><li>Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowder+and+surface+effects+on+self-organization+of+microtubules.">Crowder and surface effects on self-organization of microtubules.</a> Physical Review E. 103 (6), 062408 (2021).</li><li>Stanhope, K. T., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+MAPs,+and+motor+patterns.">Microtubules, MAPs, and motor patterns.</a> Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).</li><li>Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons Available from: <a target="_blank" href="https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg">https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg</a> (2022)</li><li>Lantzsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+reorganization+during+female+meiosis+in+c.+Elegans.">Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans.</a> eLife. 10, 58903 (2021).</li><li>Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+and+testing+of+a+new,+local+microtubule-disruption+tool+based+on+the+microtubule-severing+enzyme,+katanin+p60.">Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60.</a> Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).</li><li>Pecqueur, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designed+ankyrin+repeat+protein+selected+to+bind+to+tubulin+caps+the+microtubule+plus+end.">A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).</li><li>Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+dimers+of+the+mitotic+kinesin+motor+Eg5+step+processively+and+support+substantial+loads+in+vitro.">Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).</li><li>Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinesin-13+mutant+catalytically+depolymerizes+microtubules+in+ADP.">A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP.</a> Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).</li><li>McNally, F. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+katanin,+an+ATPase+that+severs+and+disassembles+stable+microtubules.">Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules.</a> Cell. 75 (3), 419-429 (1993).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Metodene beskrevet her har blitt brukt i flere artikler for å lage mikrotubule taktoider (figur 2)22,28. Disse eksperimentene er biologisk relevante for å bidra til å avdekke de organisatoriske prinsippene som styrer formen og stabiliteten til den mitotiske eller meiotiske spindelen i de fleste celletyper. I tillegg er mikrotubuler modell flytende krystallmetogener som kan hjelpe til med å lære mer om hvordan flytende krystaller nukleerer og vokser nematiske faser fra isotrope faser.
Prosedyren som er skissert her har flere fordeler for å utforske mikrotubul selvorganisering. For det første er det svært reproduserbart, etter å ha blitt utført i laboratoriet av mange studenter, inkludert elever på videregående skole, med liten forkunnskap eller trening før de begynte i laboratoriet. Taktoidene er birefringent22, slik at de kan sees i overført lys i tillegg til fluorescensmikroskopi, noe som gjør denne metoden tilgjengelig for mange laboratorier og denne eksperimentelle prosedyren som kan tilpasses pedagogiske formål, i tillegg til avansert forskning. Til slutt åpner denne prosessen veier for å fortsette å forstå og sondere biologiske systemer i en nedstrippet, reduksjonistisk tilnærming, slik at man kan forstå hvordan hver ekstra tilstand, protein eller additiv kan endre selvorganisering av taktoider og kanskje til slutt spindelen. Mål for bedre biomimicry inkluderer aktivitet, fluiditet og filament polaritet sortering.
Det kan være flere faktorer som påvirker eksperimentet og gir uventede resultater. Hvis taktoidene for eksempel ikke dannes (figur 2), men viftelignende mønstre observeres, er MAP65 sannsynligvis ikke til stede eller ikke bindende for mikrotubulene22,28. Dette bør også være åpenbart i MAP65 fluorescenskanalen fordi GFP-MAP65 ikke vil være bundet til mikrotubulene.
Hvis taktoidene ikke dannes og bakgrunnen vises som flekker på glasset, kan dette skyldes overflatebelegget. Når den er utført, varer silaniseringen bare 1 måned på coverlips. Når den slites av, vil tubulinen kunne binde seg til den eksponerte overflaten ikke-spesifikt. Denne bindingen vil forekomme i rare mønstre.
Hvis taktoidene ikke dannes og tubulin observeres i aggregater av forskjellige former og størrelser, kan dette skyldes tubulin av dårlig kvalitet. Tubulin kan sentrifugeres for å fjerne innledende aggregater som kan drive denne off-pathway aggregasjonen i stedet for mikrotubul polymerisering. Hvis overflaten er bindende til tubulinen, kan den også tømme tubulinen i løsningen. Lave konsentrasjoner av tubulin, under den kritiske konsentrasjonen for polymerisering av mikrotubuler, kan resultere i aggregater.
I FRAP-eksperimenter, hvis MAP65-kanalen ikke viser noen gjenoppretting (figur 5), er det mulig at fotobleaching fotodamaging mikrotubules. Fotodamage forårsaker lokalisert ødeleggelse av filamentene. Dette kan kontrolleres ved undersøkelse i den overførte kanalen. Mikrotubule taktoider er synlige i den overførte kanalen gjennom en høy indeks av brytningskonflikt med det omkringliggende vannet. Lysindusert fotodamage vil vises som et brennmerke eller tap av kontrast i overført lysavbildning på stedet der avkastningen utsettes for fotobleking. Hvis dette skjer, må laseren eller lyseffekten reduseres for å hemme proteinenes fotodamage.
Det var flere utfordringer i denne prosedyren og tilnærmingen. Et problem er at lengdemålene for øyeblikket utføres for hånd ved å klikke på bildet. Denne metoden, selv om den er grei, kan føre til stor usikkerhet. Breddemålet som bruker tverrsnittet og tilpasningen til en gaussianer, er en bedre metode for å kvantifisere størrelsen. En lignende metode kan brukes for lengden. Et annet problem er at noen ganger kan taktoidene, fordi de er så lange og tynne, bøye seg. Dette gjør kvantifisering av lengden vanskeligere. Konturlengden kan kvantifiseres ved hjelp av en segmentert linje, men det er ekstra usikkerhet hver gang et segment legges til.
Fra et vitenskapelig perspektiv har denne tilnærmingen noen andre utfordringer for bruken som modell for flytende krystaller eller spindler. Den første utfordringen har vært den lange, tynne formen på taktoidene som mikrotubuler skaper (figur 3 og figur 4). Som nevnt i tidligere publikasjoner22, er mikrotubule taktoider homogene taktoider, ikke bipolare. Dette betyr at mikrotubulene som utgjør formen ikke reorienterer for å peke mot spissene på strukturen. I stedet er alle mikrotubulene parallelle med den lange aksen, og "polene" ligger ved uendelig. Dette er svært forskjellig fra taktoidene som observeres for molekylære flytende krystaller eller til og med for aktin eller DNA som også kan fungere som flytende krystallmetogener. I disse andre systemene er taktoidene bipolare, og når de ses i kryssede polarisatorer, viser de de fortellende tegn på reorientering av stengene.
En annen stor utfordring i dette systemet er at mikrotubulene er immobile inne i taktoiden. Dette er klart fra FRAP-eksperimenter og analyse, da utvinningen av mikrotubulene er svært lav. Deres solide natur gjør mikrotubule taktoider mindre verdifulle som store flytende krystallanaloger. Den nematiske fasen av en flytende krystall skal ha både flytende (væske) og krystall (organisert) egenskaper. Selv om formen virker riktig for spindelen, gjør immobiliteten systemet mindre spennende som en modellgeitotisk spindel. På den annen side gir dette problemet muligheter til å undersøke hvordan man kan endre forsøkene for å skape mer flyt i systemet.
Disse vitenskapelige utfordringene gir spennende muligheter som vil gi ny kunnskap om systemet. For å gjøre mikrotubule taktoidene mer bipolare, kan man bruke kortere mikrotubuler. Det er imidlertid en ekstra utfordring, siden mikrotubuler ikke har mange godt karakteriserte cappingproteiner for å kontrollere lengden som aktin gjør. Bruk av kjernedannelse og vekst krever bruk av svært høye konsentrasjoner av tubulin og GMPCPP for å lage korte mikrotubuler. Den høye tubulinkonsentrasjonen resulterer i et større antall filamenter i systemet, noe som gjør det vanskeligere å skille taktoider fra hverandre. Tillegg av nye mikrotubule cappers, for eksempel DARPin33, kan hjelpe med denne situasjonen. Det andre problemet med at mikrotubulene er immobile, kan reduseres ved tilsetning av motorproteiner, som kinesin-534, som er tetramerer av motorer som brukes i mitose. Alternativt kan kunstige dimmere av dimeriske kinesin-1 brukes15.
En annen måte å legge til mer flyt på ville være å la mikrotubulene utføre sin dynamiske ustabilitet, vekst og krymping av mikrotubuler. For tiden er mikrotubuler som er sådd med stabile GMPCPP-filamenter og deretter gjennomgår dynamisk ustabilitet langt lengre enn ønsket for å danne en spindel eller taktoid, noe som vil resultere i svært lange organisasjoner som fans eller bunter. Så å legge til mikrotubul dynamisk ustabilitet må gjøres nøye for å bevare taktoidformen. Tilsetningen av tilknyttede proteiner og enzymer som kan kontrollere lengden, kan redusere dette problemet. For eksempel vil depolymeriserende kinesiner, som kinesin-1335, eller kutte enzymer, som katanin36, sannsynligvis være nødvendig. Disse eksperimentene er komplekse og vanskelige, selv om de ville være veldig innsiktsfulle uansett hva resultatene avslører. Uansett hvilken retning fremtidige eksperimenter tar, kan plattformen som er utviklet her for å lage mikrotubule taktoider, avsløre ny informasjon på fysisk grunnlag av mikrotubulorganisasjon.

Celledeling via mitose er en av de viktigste biologiske prosessene for å opprettholde livet. Mikrotubulfilamentene, som består av tubulin dimers, er essensielle strukturelle elementer i denne prosessen. Det forbigående maskineriet som opprettes i metafase når kromosomene justeres i cellesenteret, kalles den mitotiske spindelen på grunn av formen, som er som en spindel av en vevstol dekket av tråder (figur 1A). Det er veletablert på tvers av mange organismer at mikrotubuler brukes i metafase for å presse og trekke kondenserte kromosomer inn i midten av cellen, justere dem og koble dem opp til mikrotubuler som vil trekke dem fra hverandre i anafase (figur 1B, C). Spindelen dannes i både meiose (figur 1B) og mitose (figur 1C), laget av mange overlappende mikrotubuler som ikke er pakket rundt den sentrale aksen som tråd, men kjører parallelt med grensesnittet. Å lage disse mikrotubule-baserte strukturene krever tilknyttede proteiner som krysskobling og tilhørende enzymer som kan fungere som motorer for å bidra til å presse og trekke kromosomene1.
Studier av meiotiske spindler har vist at mikrotubulene er korte, dynamiske og overlappende i krysskoblede matriser 2,3,4,5,6 (figur 1Di). På grunn av den fysiske organiseringen av disse korte mikrotubulene, ligner den meiotiske spindelen en flytende krystall taktoid (figur 1E). Faktisk har spindler vist seg å samle seg og fusjonere, som man kan forvente av flytende krystall taktoider5.
Mange studier som dateres tilbake til 1960-tallet har brukt fiksering, serielle seksjoner og elektronmikroskopi for å fastslå at det er to typer mikrotubuler inne i den mitotiske spindelen 7,8,9,10. Den første typen kalles kinetochore mikrotubules, som forbinder spindelstangen til kinetochore. Den andre typen kalles interpolare eller polare mikrotubuler, som vokser forbi kromosomene og overlapper ved midtsonen (figur 1Dii) 8,9,10. En tredje type kalles astral mikrotubules, som er utenfor spindelen og forbinder polene til cellekanten; Disse mikrotubule organisasjonene er utenfor omfanget av den aktuelle diskusjonen. Det har nylig vært studier på samspillet mellom augmin6 og gamma-tubulin ring kompleks som påvirker nukleasjonssentre for mikrotubuler, noe som resulterer i en mititotisk spindel med kortere mikrotubuler som i figur 1D.
Siden mikrotubuler er lengre enn de er brede, med et høyt størrelsesforhold og høy stivhet, er de som oppskalerte versjoner av flytende krystallmolekyler. I myk materiefysikk har atomer og molekyler blitt tilnærmet ved hjelp av minimale interaksjoner for å utlede de fysiske mekanismene for faseoverganger, inkludert kjernedannelse og smelting av krystaller11. På samme måte er mikrotubuler mesoskala objekter som er oppskalerte versjoner av flytende krystallmolekyler, noe som gir innsikt i fysikken til flytende krystalldynamikk, inkludert kjernen og veksten av de nematiske fasene fra isotrope. Videre, som diskutert ovenfor, viser den meiotiske spindelen egenskaper som en flytende krystall taktoid, en nematisk tilstand som nukleerer og vokser fra isotropisk tilstand av flytende krystallmolekyler 3,4,5. For taktoider er kjernedannelse og vekst som for andre krystaller (dvs. krever en relativt høy konsentrasjon av mesogener [molekylene som danner flytende krystaller]). Den unike "spindel" formen på taktoiden kommer fra den lokale justeringen av flytende krystallmetogener som justerer seg inn i den nematiske fasen (figur 1E). De kan ikke danne en avrundet krystall fordi molekylene er svært asymmetriske. Gitt mikrotubulenes natur er det kanskje ikke overraskende at det mititotiske spindelmaskineriet laget av en høy lokal konsentrasjon av mikrotubuler også er av samme form, enten det kalles taktoid eller spindel. Taktoider kan være bipolare, med poler i de koniske endene (figur 1Ei), eller homogen, med poler effektivt ved uendelig (figur 1Eii).
Gitt betydningen av spindeldannelse, har det pågått innsats mot selvorganisert spindeldannelse in vitro ved å demonstrere mikrotubulkondensasjon i bunter via ioniske arter12,13, trengselmidler som skaper uttømmingsinteraksjoner14,15, og spesifikke mikrotubule krysskoblingsproteiner 13,16,17,18,19, 21. Overraskende, selv om disse midlene alle jobber for å øke den lokale konsentrasjonen av mikrotubuler, resulterer de ofte i lange mikrotubulebunter, men ikke taktoider. En grunn til at disse buntene er lange, kan være at mikrotubulene som består av dem også er lange. Nylig arbeid med kortere mikrotubuler rapporterte også lengre bunter som ikke er avsmalnet på slutten15; I dette tilfellet holdes buntene sammen med motorproteiner som forårsaker forlengelse av buntene og dermed gjør dem lengre. Korte mikrotubuler med ikke-ekstensile krysskoblinger er nødvendig for koniske, spindellignende forsamlinger, som beskrevet her.
Nylig har vi utviklet en teknikk for å muliggjøre opprettelse av mikrotubule taktoider ved hjelp av antiparallel crosslinker, MAP65, i nærvær av nukleerende stabile mikrotubuler22. Mikrotubulene måtte være korte, men få kjente regulatorer av mikrotubullengde kan dekke mikrotubuler mot dynamisk ustabilitet eller ende-til-ende annealing. I stedet ble GMPCPP brukt til å nukleere og stabilisere filamentene etter vekst. Dette tillot å skape en høy tetthet av korte mikrotubuler som selv kunne organisere seg i taktoider. Disse taktoidene var homogene når de ble sett under birefringence. I tillegg til korte mikrotubuler ble en spesifikk antiparallel crosslinker, MAP65, brukt til å danne taktoidene (figur 2). MAP65 er et plantemikrotubul-assosiert protein i PRC1/Ase1-familien av mititotiske krysskoblinger23. MAP65 eksisterer som en dimer, med en sterk affinitet til å binde seg til seg selv så vel som mikrotubulene24. I motsetning til den meiotiske spindelen og taktoidene som observeres med aktinfilamenter 25,26,27, som er bipolare og har de væskelignende egenskapene til flytende krystaller, har mikrotubule taktoider blitt observert å være faste 22,28.
Her presenteres protokoller for å skape mikrotubule taktoider og karakterisere formen på samlingene og mobiliteten til bestanddelene ved hjelp av fluorescensbaserte teknikker.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2% Dichlorodimethylsilane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>118945</td>
			<td>A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-minute epoxy</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td></td>
			<td>For sealing experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>32900HPLC</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 cells</td>
			<td>Bio Labs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Competent bacterial cells used to express MAP65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C30-500MG</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 &#956;l aliquots in -20&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12544-AP</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td>A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889-10G</td>
			<td>Tubulin buffer base ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.5 ml tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402 18</td>
			<td>For holding experimental solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111000200</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with high NA objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E, W2 Confocal</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -20&#176;C</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13986148</td>
			<td>For storing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>328223H01-C</td>
			<td>For storing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass containers for silanization</td>
			<td>Michaels</td>
			<td></td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12544-4</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 &#956;l aliquots in -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133-250KU</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jenna Bioscience</td>
			<td>NU-4055</td>
			<td>Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating element for microscope</td>
			<td>Okolab stage top incubator</td>
			<td></td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidizole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2399</td>
			<td>Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>34155</td>
			<td>For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 230LT22</td>
			<td>To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP65 protein</td>
			<td>Ram Dixit</td>
			<td></td>
			<td>A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 &#956;M solution. This working solution is stored at 4&#176;C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCJ940</td>
			<td>Tubulin buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Nickel beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optomicroscan</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent double-sided tape</td>
			<td>3M - Scotch</td>
			<td>34-8724-5691-7</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7643-100G</td>
			<td>Tubulin buffer base ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic-F127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol</td>
			<td>Affymetrix Inc</td>
			<td>19966 500 GM</td>
			<td>A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4&#176;C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For pipetting viscous liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Racks for coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72240</td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4&#176;C</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td></td>
			<td>For storing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin Labeled</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL590M</td>
			<td>lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80&#176;C until hydrated in PEM80 and used for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td>lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80&#176;C until hydrated in PEM80 and used for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Ozone</td>
			<td>Jelight</td>
			<td>Model 342</td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackreg</td>
			<td>Biomedical Imaging Group</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>plugin for registering time series data to remove drift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turboreg</td>
			<td>Biomedical Imaging Group</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>plugin for registering time series data to remove drift</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of microtubule tactoids

Cytoskjelettet er ansvarlig for stor intern organisering og omorganisering i cellen, alt uten leder for å lede endringene. Dette er spesielt tilfelle under mitose eller meiosis, hvor mikrotubulene danner spindelen under celledeling. Spindelen er maskineriet som brukes til å skille genetisk materiale under celledeling. Mot å lage selvorganiserte spindler in vitro, utviklet vi nylig en teknikk for å rekonstituere mikrotubuler i spindellignende forsamlinger med et minimalt sett med mikrotubule-assosierte proteiner og trengselmidler. Spesielt ble MAP65 brukt, som er en antiparallel mikrotubule crosslinker fra planter, en homolog av Ase1 fra gjær og PRC1 fra pattedyrorganismer. Denne crosslinkeren organiserer selv mikrotubuler i lange, tynne, spindellignende mikrotubule selvorganiserte forsamlinger. Disse samlingene ligner også flytende krystall taktoider, og mikrotubuler kan brukes som mesoskala mesogener. Her presenteres protokoller for å skape disse mikrotubule taktoidene, samt for å karakterisere formen på samlingene ved hjelp av fluorescensmikroskopi og bestanddelenes mobilitet ved hjelp av fluorescensgjenvinning etter fotobleking.

Med bare et lite antall komponenter, tubulin dimmere og mikrotubule krysskoblinger, kan mikrotubule taktoider dannes (figur 2A). Selv om denne protokollen beskriver inkubasjon for å nukleere og dyrke mikrotubuler i en inkubator, kan kjernen og veksten observeres direkte under mikroskopet (som er fullført innen 30 min) (figur 2B). Konsentrasjonen av tubulin holdes konstant på 13,6 μm og MAP65-MT binding ved 10%.
Figur 4 representerer vellykkede data. Taktoidene skal være synlige med både en 561 nm laser i tubulinkanalen og 488 nm i MAP65-kanalen, som perfekt overlapper med hverandre (figur 4A). Et mysterium i systemet har vært at bredden på taktoidene ikke ser ut til å variere under en rekke eksperimentelle endringer, inkludert endring av mikrotubullengdene, MAP65-konsentrasjonen og trengsemidlene (figur 4B) 22,28. Lengden er mye mer variabel og avhenger av både mikrotubullengdene og MAP65-konsentrasjonen (figur 4B) 22,28.
Når du utfører FRAP, har det blitt observert at MAP65-signalet gjenoppretter, men mikrotubulsignalet gjenoppretter ikke (figur 5). Gjenopprettingen i FRAP skyldes mobiliteten og bevegelsen til de merkede og fotobleachede objektene. Når det gjelder MAP65, dissosierer de mørke molekylene og beveger seg bort fra mikrotubulen og nye beveger seg inn i regionen (figur 5). MAP65 bindingen er i likevekt, så bindingshastigheten og ubindingen er lik (målt i molekyler per sekund). For mikrotubulene ble det ikke sett noen gjenoppretting som antyder at mikrotubulene ikke er i stand til å forlate taktoiden (figur 5A, Bi, C). Videre ble det ikke sett noen spredning av den mørke regionen, noe som tyder på at mikrotubulene er lokalt immobile og ikke en væske i taktoidformen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg"> Figur 1: Ulike modeller for spindeldannelse. En mititotisk spindel er en maskin laget av mikrotubuler og deres tilknyttede proteiner og enzymer som justerer og skiller kromosomene inn i de to nye dattercellene under celledeling. (A) Bilde av en tidlig middelalder slippe spindel kopi med fint garn fra Nederland. Denne figuren er endret fra et Wikimedia-bilde av Peter van der Sluijs30. (B) Tredimensjonal rekonstruksjon av mikrotubuler på ulike stadier av villtype meiosis II. Mikrotubuler vises i grønt, og kromosomer vises i grått. Skalastang = 1 μm. Denne figuren er endret fra Lantzsch et al.31. (C) Mikroskopi bilde av mikrotubulene i en mititotisk spindel av en deling Sf9 celle. Spindelstengene og mikrotubulene på spindelen er merket med et grønt fluorescerende protein. Skalastang = 5 μm. Denne figuren er endret fra Advani et al.32. (D) Ulike modeller for hvordan mitotiske og meiotiske spindelmikrotubuler er organisert. (i) Tidligere observert for meiotiske spindler laget av Xenopus egg ekstrakter, ble mikrotubulene (grønne) utledet til å være korte og dynamiske gjennom spindelen. Dette ligner en bipolar taktoid organisasjon inne i en flytende krystall. (ii) Den kanoniske modellen for mikrotubul organisasjon inne i en mititotisk spindel har to typer mikrotubuler: interpolariske eller polare mikrotubuler (mørkegrønn) som krysslinker i midtsonen rundt kromosomene og kinetochore mikrotubulene (lysegrønne) som er buntet og strukket fra polen til kinetochore for å presse og trekke kromosomene. I alle bilder vises kromosomer i gjennomsiktig blå, og spindelstenger er representert i mørkegrønn. (E) Skjematikk av mesogener (grønne linjer) i en flytende krystall taktoid for (i) bipolare og (ii) homogene taktoider. Bipolare taktoider har to poler på slutten av taktoiden, og mesogenene orienterer seg om å peke på disse polene. Homogene taktoider har poler ved uendelig, og mesogenene endrer ikke orientering langs tactoidens lengde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg"> Figur 2: Mikrotubulkondensasjon. (A) Mikrotubuler kan buntes og krysskobles av en rekke metoder, inkludert ioniske arter, uttømmingskrefter forårsaket av trengselsmidler og spesifikke mikrotubule crosslinkers, for eksempel MAP65. (i) Tubulin dimers og MAP65 proteiner blandes for å nukleere og vokse mikrotubuler. (ii) Mikrotubuler nukleerer og vokser fra tubulin, og MAP65 binder seg umiddelbart til mikrotubuler, en annen MAP65 monomer, eller begge deler og forårsaker bunting. (iii) Mikrotubuler i de krysskoblede buntene nukleerer og vokser. (iv) Den endelige konfigurasjonen er en mikrotubul taktoid som ligner en spindel. (B) Tidsserier av mikrotubule taktoider nukleerer og vokser over 105 min. Skalastang = 5 μm. Figur tilpasset fra Edozie et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg"> Figur 3: Montering av strømningskammer. Strømningskammeret er laget ved hjelp av en glasssklie, silanisert dekselglass og permanent dobbeltsidig tape. Det gule uthevede området er strømningsbanen der prøven flyter og observeres. Volumet av strømningskammeret er ~ 20 μL. Epoxy ble brukt til å forsegle endene av kammeret for å forhindre at prøven fordamper under langvarig avbildning over flere timer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg"> Figur 4: Taktoidbilder og lengde- og breddeanalyse. (A) Eksempeldata for taktoider dannet som beskrevet og avbildet ved hjelp av roterende plate confocal viser (i) mikrotubule kanalavbildning rhodamin-merket tubulin ved hjelp av en 561 nm laser, (ii) GFP-MAP65 kanal bildebehandling GFP ved hjelp av en 488 nm laser, og (iii) fusjonert overleggsbilde fra mikrotubulekanalen (magenta) og GFP-MAP65 kanal (cyan). Overlappingsområder vises som hvite og viser at mikrotubulene og MAP65 colokaliseres nøyaktig. Skalalinje = 10 μm for alle bilder i (A). (B) Kvantifisering av taktoid lengde og bredde. (i) Bilde av en taktoid som skal analyseres uten etiketter. Skalalinje = 5 μm. (ii) Samme bilde som i (i), der lengden (heltrukket linje med linjeendepunkter) og breddemål (stiplet linje) er merket. Skalastang = 5 μm. (iii) Bredden ble målt ved å ta intensitetsprofilen over taktoiden ved vinkelrett komektor (stiplet linje) betegnet i (ii). Intensitetsprofilen var egnet til en gaussisk funksjon for å avsløre amplituden og bredden på taktoiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg"> Figur 5: Representative FRAP-data og -analyser. (A) Mikroskopitidsseriedata av (i) mikrotubul tactoid og (ii) GFP-MAP65, og (iii) overleggsbilde av begge kanaler med mikrotubuler i magenta og GFP-MAP65 i cyan som ble fotobleket på tidspunktet 63 s og observert i ytterligere 5 min (B) Kvantifisert intensitet av (i ) mikrotubulkanal i bleket område (magenta sirkler) og bakgrunnen (mørkegrå sirkler) og (ii) GFP-MAP65 kanal i bleket område (cyan firkanter) og bakgrunnen (mørkegrå firkanter). (C) Dataene ble korrigert for bakgrunnsstøyen og skalert på nytt for mikrotubulkanalen (magenta sirkler) og GFP-MAP65-kanalen (cyan firkanter). Mikrotubulene gjenoppretter ikke, men GFP-MAP65 gjør og kan passe (mørkegrå linje) til et stigende eksponentielt forfall for å finne amplituden og tidsskalaen for utvinning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Microtubule Tactoids at JoVE.com

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Denne artikkelen presenterer en protokoll for dannelsen av mikrotubule samlinger i form av taktoider ved hjelp av MAP65, en plantebasert mikrotubule crosslinker, og PEG som et trengselmiddel.

Selvmontering av mikrotubule taktoider

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Denne protokollen muliggjør spontan selvorganisering av mikrotubule taktoider ved hjelp av en anti-parallell krysskobling, MAP65. Dette systemet kan hjelpe oss med å forstå mikrotubule organisasjon og biologiske systemer som mititotiske spindler. Den største fordelen med denne teknikken er at det er et minimalistisk system som kan gjenskape spindellignende former for mikrotubuler som er svært reproduserbare og tilgjengelige for mange laboratorier.Denne metoden gjelder ikke bare for cellulære systemer, men kan også fungere som en modell for meso-skala flytende krystallstudier. For å forberede tubulin, ta først ut en aliquot av umerket tubulin som inneholder ett milligram lyofilisert tubulin fra minus 80 grader Celsius fryser og hold den på is. Tilsett deretter 200 mikroliter kald PEM-80.For å oppløse all lyofilat, hold røret på is i 10 minutter. Deretter tar du ut et rør med rhodaminmerket tubulin som inneholder 20 mikrogram lyofilisert tubulinpulver fra minus 80 grader Celsius-fryseren og holder den på is. Tilsett deretter fire mikroliter kald PEM-80 og hold røret på is i 10 minutter for å oppløse all lyofilat.Når de lyofiliserte tubulinene er oppløst, tilsett 100 mikroliter av den resuspenderte unlabeled tubulinoppløsningen til den fire-mikroliter rhodamin-merkede tubulinoppløsningen. Bland deretter løsningene ved å rør seks til syv ganger veldig sakte. For å lagre de resterende 100 mikroliter av umerket tubulinoppløsning, må du først sette røret inn i flytende nitrogen for å fryse løsningen, og hold deretter røret på minus 80 grader Celsius for fremtidig bruk.Deretter distribuerer du tubulinblandingen i syv nye rør ved å legge til 15 mikroliter i hver. Frys rørene i flytende nitrogen som vist tidligere og lagre dem på minus 80 grader Celsius for fremtidig bruk. For å montere strømningskamre for å utføre eksperimenter, rengjør først en glasssklie med dobbelt destillert vann og tørk det med en lofri laboratorieserviett.Deretter rengjør du lysbildet først med etanol etterfulgt av dobbeltdestillert vann. Hvis du vil opprette en flytbane, klipper du et 40 til 50 millimeter langt stykke dobbeltsidig tape. Deretter deler du den i mellom for å lage to tynnere striper av tape og plassere de to stripene på lysbildet fem til åtte millimeter fra hverandre.Deretter plasserer du silaniserte dekselslipper på toppen av strømningsbanen. Deretter forsegler du lysbildet og dekselet gled de dobbeltsidige båndstrimlene ved å trykke forsiktig på båndområdet med baksiden av en penn. Hvis forseglingen er gjort godt, bør båndet vende seg fra gjennomsiktig til klart.For å fjerne ekstra tape på kantene, kutt båndet med et barberblad, og la bare en millimeter fra strømningskammerets inngang. Deretter merker du kammeret med passende eksperimentelle parametere For å utføre taktoideksperimentene, må du først tine alle nødvendige reagenser på is og lagre dem på isen under arbeidet. Deretter belegges strømningskammeret med 20 mikrolitere av 5% ikke-ionisk blokkkopolymer overflateaktivt middel oppløst i PEM-80 med små dråper i begge ender av kammeret for å forhindre dannelse av luftbobler inni.Hold deretter strømningskammeret i et fuktig kammer laget av Petri-tallerken med en våt, lofri laboratorieserviett i minst fem til syv minutter. Bland deretter PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, dithiothreitol, glukose, polyetylenglykol, tubulinblandingen laget tidligere, og MAP65 med GFP MAP65 for visualisering i et sterilt rør ved pipettering fem til seks ganger, og hold røret på is. Tilsett deretter en mikroliter av en ferdigblandet løsning av glukoseoksidase og katase i røret til tubulin-MAP-blandingen og bland igjen ved å rør syv til åtte ganger.Del det totale volumet av løsningen i to deler som skal brukes i separate kamre. I mellomtiden må væsken som tilsetts tidligere til strømningskammeret fjernes ved kapillærvirkning ved å bruke en lofri laboratorieserviett i den andre enden av kammeret, sammen med tilsetningen av tubulin-MAP-blandingen til strømningskammeret. Når prøven er helt inne i kammeret, forsegler du de to endene av kammeret ved hjelp av fem minutters epoksy og holder den på 37 grader Celsius i ca. 30 minutter for å nukleere og vokse mikrotubule taktoider.For avbildning av taktoidene ved fluorescensmikroskopi, bruk mål med en numerisk blenderåpning på 1,2 eller mer i 60X eller høyere forstørrelse for å samle nok lys i fluorescens. Ta opp bildene med en gratis metalloksid halvleder eller et ladekoblet enhetskamera. For å opprettholde prøven, hold den i et miljøkammer satt til 37 grader Celsius.Alternativt kan andre scenevarmere, inkludert varmtluftsvarmere og objektive temperaturkontrollerte krager med sirkulerende varmt vann, brukes til dette formålet. Som passende eksitasjonskilder er avgjørende for riktig fluorescens for rhodamin tubulin, bruk en 561-nanometer laser med minst en milliwatt strøm på prøven for bilder av god kvalitet. For GFP MAP65 endrer du imidlertid eksitasjonskilden til en 488-nanometerlaser.Hvis du bruker bredfelts epifluorescensmikroskopi, bruk deretter en rhodaminfilterkube med en eksitasjon på 540 12,5 nanometer, dichroic på 545 nanometer 12,5 nanometer cutoff og utslipp av 575 nanometer langpass. For GFP MAP, bruk en GFP-filterkube med eksitasjon på 480 15 nanometer, dichroic på 505 nanometer 15 nanometer avskåret, og utslipp av 515 nanometer langpass. Etter å ha sørget for at belysningseffekten og eksponeringstidene er slik at intensitetsskalaen for kameraet ikke er mettet, ta minst 10 bilder av forskjellige områder for å bilde over 100 taktoider i både de røde og grønne kanalene, og lagre dem som 16-biters TIFF-bilder for analyse.Ved hjelp av denne protokollen kan mikrotubule taktoider hvis dannelse blir fullført innen 30 minutter, visualiseres direkte under mikroskopet. Taktoidene er synlige med både en 561-nanometerlaser i tubulinkanalen og en 488-nanometerlaser i MAP65-kanalen. Bildene overlapper også perfekt med hverandre.I denne metoden kan lengden og bredden på taktoidene også måles. Intensitetsprofilen til en taktoid ble funnet å variere med bredden. Videre ble mikrotubulens tactoiders immobile natur demonstrert ved fluorescensgjenoppretting etter fotobleking eller FRAP-eksperimenter, som ikke viste noen gjenoppretting av fluorescens etter fotobleking.På den annen side avslørte FRAP-eksperimenter en mobil karakter av MAP65, som en gradvis gjenoppretting og fluorescens kunne observeres etter fotobleking. Denne fluorescensgjenvinningen av MAP65 kan passe til et stigende eksponentielt forfall for å finne amplituden og tidsskalaen for utvinning. Taktoideksperimentdelen skal fullføres innen 10 til 12 minutter, da tubulinen raskt kan gå dårlig på is, noe som kan være skadelig for kjernen av taktoider.Fremtidig arbeid med forskjellige mikrotubule krysskoblingsproteiner og krysskoblingsmotorproteiner, enzymer som kan flytte mikrotubuler, vil fortsette å avsløre ny informasjon om selvorganisering av den mitotiske spindelen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Utarbeidelse av Giant vesikler innkapsle mikrosfære ved sentrifugering av en vann-i-olje emulsjon

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Analysen for fosforylering og Microtubule Binding med lokalisering av Tau Protein i tykktarmskreft celler

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Måling av mitokondrie oksygenforbruk i Permeabilized fiber av Drosophila med minimale mengder vev

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal struktur av N-terminal domenet av Ryanodine reseptoren fra Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Celle fraksjoneres av U937 celler i fravær av høyhastighets sentrifugering

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utnyttelse av Grafix for påvisning av forbigående interagere av Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Praktiske aspekter ved prøvepreparering og oppsett av 1H R1ρ avslapningsspredningsforsøk av RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Måling av protein import kapasitet av skjelett muskel mitokondrier

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Syntese av Masarimycin, en liten molekylhemmer av Gram-positiv bakterievekst

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Samtidig visualisering av dynamikken i krysskoblede og enkle mikrotubuler in vitro av TIRF mikroskopi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...