Name: self-assembly of microtubule tactoids
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Microtubule Tactoids at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить всех членов Ross Lab летом 2021 года, особенно К. Элис Линдси, за их помощь. Эта работа была поддержана грантом от NSF BIO-2134215, который поддержал С. Саху, Н. Гудби, Х.Б. Ли и Дж.Л. Росса. Грант от Фонда KECK (Rae Anderson, USD, ведущий PI) частично поддержал Р. Бранча и. Чаухана

<ol>
	<li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+proteins:+structuring+the+cytoskeleton.">Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).</li><li>Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+meiotic+spindle+assembly+and+function.">Oocyte meiotic spindle assembly and function.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).</li><li>Brugu&#233;s, J., Needleman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+spindle+self-organization.">Physical basis of spindle self-organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).</li><li>Brugu&#233;s, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+transport+organize+microtubules+in+metaphase+spindles.">Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles.</a> Cell. 149 (3), 554-564 (2012).</li><li>Gatlin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+fusion+requires+dynein-mediated+sliding+of+oppositely+oriented+microtubules.">Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules.</a> Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).</li><li>Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmin:+A+protein+complex+required+for+centrosome-independent+microtubule+generation+within+the+spindle.">Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle.</a> Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).</li><li>Inoue, S., Sato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+by+labile+association+of+the+nature+of+mitotic+spindle+fibers+and+their+role+in+chromosome+movement+molecules.">Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules.</a> Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).</li><li>Allenspach, A. L., Roth, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variations+during+mitosis+in+the+chick+embryo.">Structural variations during mitosis in the chick embryo.</a> Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).</li><li>Theg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+microtubules+in+different+animal+cells.">Cytoplasmic microtubules in different animal cells.</a> Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).</li><li>Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+anaphase+spindle+elongation+in+Diatoma+vulgare.">On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare.</a> Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).</li><li>Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Condensed Matter Physics. , (1995).</li><li>Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastr&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assembly+and+collective+behavior+of+microtubule+bundles+in+the+presence+of+polyamines.">Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines.</a> Biophysical Journal. 101 (1), 205 (2011).</li><li>Needleman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+assembly+of+microtubules+by+counterions:+From+hexagonal+bundles+to+living+necklaces.">Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).</li><li>Ross, J. L., Fygenson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+taxol+in+microtubule+bundles.">Mobility of taxol in microtubule bundles.</a> Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).</li><li>Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-like+beating+of+active+microtubule+bundles.">Cilia-like beating of active microtubule bundles.</a> Science. 333 (6041), 456-459 (2011).</li><li>Brandt, R., Lee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+microtubule-associated+protein+tau.+Identification+of+regions+which+affect+microtubule+growth,+nucleation,+and+bundle+formation+in+vitro.">Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).</li><li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+organization+and+dynamics+dependent+on+microtubule-associated+proteins.">Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA.">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173 (1989).</li><li>MacRae, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+organization+by+cross-linking+and+bundling+proteins.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+(BBA).">Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).</li><li>She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+Ase1/PRC1/MAP65+family+in+central+spindle+assembly.">Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly.</a> Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).</li><li>Walczak, C. E., Shaw, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+for+Bundling+Microtubules.">A MAP for Bundling Microtubules.</a> Cell. 142 (3), 364-367 (2010).</li><li>Edozie, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+spindle-like+microtubule+structures.">Self-organization of spindle-like microtubule structures.</a> Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).</li><li>Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+the+microtubule+cross-linking+protein+MAP65-1+reveals+a+molecular+mechanism+for+contact-angle-dependent+microtubule+bundling.">Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling.</a> Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).</li><li>Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+65-kDa+carrot+microtubule-associated+protein+forms+regularly+arranged+filamentous+cross-bridges+between+microtubules.">The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).</li><li>Scheff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+shape+and+internal+structure+of+protein+droplets+via+biopolymer+filaments.">Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments.</a> Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).</li><li>Weirich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+behavior+of+cross-linked+actin+bundles.">Liquid behavior of cross-linked actin bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).</li><li>Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+motors+divide+active+liquid+droplets.">Self-organizing motors divide active liquid droplets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).</li><li>Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowder+and+surface+effects+on+self-organization+of+microtubules.">Crowder and surface effects on self-organization of microtubules.</a> Physical Review E. 103 (6), 062408 (2021).</li><li>Stanhope, K. T., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+MAPs,+and+motor+patterns.">Microtubules, MAPs, and motor patterns.</a> Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).</li><li>Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons Available from: <a target="_blank" href="https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg">https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg</a> (2022)</li><li>Lantzsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+reorganization+during+female+meiosis+in+c.+Elegans.">Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans.</a> eLife. 10, 58903 (2021).</li><li>Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+and+testing+of+a+new,+local+microtubule-disruption+tool+based+on+the+microtubule-severing+enzyme,+katanin+p60.">Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60.</a> Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).</li><li>Pecqueur, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designed+ankyrin+repeat+protein+selected+to+bind+to+tubulin+caps+the+microtubule+plus+end.">A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).</li><li>Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+dimers+of+the+mitotic+kinesin+motor+Eg5+step+processively+and+support+substantial+loads+in+vitro.">Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).</li><li>Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinesin-13+mutant+catalytically+depolymerizes+microtubules+in+ADP.">A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP.</a> Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).</li><li>McNally, F. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+katanin,+an+ATPase+that+severs+and+disassembles+stable+microtubules.">Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules.</a> Cell. 75 (3), 419-429 (1993).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Методы, описанные здесь, были использованы в нескольких работах для создания тактоидов микротрубочек (рисунок 2)22,28. Эти эксперименты биологически значимы, чтобы помочь раскрыть организационные принципы, которые контролируют форму и стабильность митотического или мейотического веретена в большинстве типов клеток. Кроме того, микротрубочки являются модельными жидкокристаллическими мезогенами, которые могут помочь узнать больше о том, как жидкие кристаллы нуклеат и растут нематические фазы из изотропных фаз.
Процедура, описанная здесь, имеет ряд преимуществ для изучения самоорганизации микротрубочек. Во-первых, он очень воспроизводим, будучи выполненным в лаборатории многими студентами, включая старшеклассников, с небольшим предвидением или обучением, прежде чем начать в лаборатории. Тактоиды являются двулучепреломляющими22, что позволяет просматривать их в проходящем свете в дополнение к флуоресцентной микроскопии, что делает этот метод доступным для многих лабораторий, а эту экспериментальную процедуру адаптируемой к образовательным целям, в дополнение к высококлассным исследованиям. Наконец, этот процесс открывает возможности для дальнейшего понимания и исследования биологических систем в урезанном, редукционистском подходе, позволяя понять, как каждое дополнительное условие, белок или добавка могут изменить самоорганизацию тактоидов и, возможно, в конечном счете, веретена. Цели для улучшения биомимикрии включают сортировку активности, текучести и полярности нити.
Может быть несколько факторов, влияющих на эксперимент, дающих неожиданные результаты. Например, если тактоиды не образуются (рисунок 2), но наблюдаются веерообразные паттерны, MAP65, вероятно, не присутствует или не связывается с микротрубочками22,28. Это должно быть очевидно и в канале флуоресценции MAP65, потому что GFP-MAP65 не будет связан с микротрубочками.
Если тактоиды не образуются и фон выглядит в виде пятен на стекле, это может быть связано с покрытием поверхности. После выполнения силанизация длится всего 1 месяц на покровных листах. Когда он изнашивается, тубулин сможет связываться с открытой поверхностью неспецифично. Эта привязка будет происходить в нечетных шаблонах.
Если тактоиды не образуются и тубулин наблюдается в агрегатах различных форм и размеров, это может быть связано с некачественным тубулином. Тубулин может быть центрифугирован для удаления исходных агрегатов, которые могут управлять этой внепутевой агрегацией вместо полимеризации микротрубочек. Если поверхность связывается с тубулином, это также может истощить тубулин в растворе. Низкие концентрации тубулина, ниже критической концентрации для полимеризующих микротрубочек, могут привести к образованию агрегатов.
В экспериментах FRAP, если канал MAP65 не показывает никакого восстановления (рисунок 5), возможно, что фотоотбеливание было фотопоражением микротрубочек. Фотоповреждение вызывает локализованное разрушение нитей. Это можно проверить путем обследования в транслируемом канале. Тактоиды микротрубочек видны в передаваемом канале через высокий показатель несоответствия рефракции окружающей воде. Световой фотоповреждение будет отображаться как след ожога или потеря контраста в изображениях, передаваемых светом, в месте ROI, подвергаемого фотоотбеливанию. Если это происходит, мощность лазера или света должна быть уменьшена, чтобы ингибировать фотоповреждение белков.
В рамках этой процедуры и подхода возникло несколько проблем. Одна из проблем заключается в том, что измерения длины в настоящее время выполняются вручную, нажав на изображение. Этот метод, хотя и прост, может привести к высокой неопределенности. Измерение ширины, которое использует поперечное сечение и подгонку к гауссову, является лучшим методом количественной оценки размера. Аналогичный метод может быть использован для длины. Вторая проблема заключается в том, что иногда тактоиды, поскольку они такие длинные и тонкие, могут изгибаться. Это затрудняет количественную оценку длины. Длина контура может быть количественно определена с помощью сегментированной линии, но при добавлении сегмента добавляется неопределенность.
С научной точки зрения, этот подход имеет некоторые другие проблемы для его использования в качестве модели для жидких кристаллов или веретен. Первой проблемой была длинная, тонкая форма тактоидов, которые создают микротрубочки (рисунок 3 и рисунок 4). Как отмечалось в предыдущих публикациях22, тактоиды микротрубочек являются однородными тактоидами, а не биполярными. Это означает, что микротрубочки, составляющие форму, не переориентируются, чтобы указать на кончики структуры. Вместо этого все микротрубочки параллельны длинной оси, а «полюса» расположены в бесконечности. Это сильно отличается от тактоидов, наблюдаемых для молекулярных жидких кристаллов или даже для актина или ДНК, которые также могут действовать как жидкокристаллические мезогены. В этих других системах тактоиды являются биполярными, и при рассмотрении в скрещенных поляризаторах они показывают явные признаки переориентации стержней.
Вторая серьезная проблема в этой системе заключается в том, что микротрубочки неподвижны внутри тактоида. Это ясно из экспериментов и анализа FRAP, поскольку восстановление микротрубочек очень низкое. Их твердая природа делает тактоиды микротрубочек менее ценными, чем крупномасштабные жидкокристаллические аналоги. Нематическая фаза жидкого кристалла должна обладать как жидкими (жидкими), так и кристаллическими (организованными) свойствами. Хотя форма кажется подходящей для шпинделя, неподвижность делает систему менее захватывающей в качестве модели митотического шпинделя. С другой стороны, этот вопрос дает возможность исследовать, как можно модифицировать эксперименты, чтобы создать больше текучести в системе.
Эти научные проблемы предлагают захватывающие возможности, которые позволят получить новые знания о системе. Чтобы сделать тактоиды микротрубочек более биполярными, можно использовать более короткие микротрубочки. Однако существует дополнительная проблема, поскольку микротрубочки не имеют много хорошо охарактеризованных укупорочных белков для контроля длины, как это делает актин. Использование нуклеации и роста требует использования очень высоких концентраций тубулина и GMPCPP для создания коротких микротрубочек. Высокая концентрация тубулина приводит к большему количеству нитей в системе, что затрудняет отделение тактоидов друг от друга. Добавление новых капперов микротрубочек, таких как DARPin33, может помочь в этой ситуации. Вторая проблема неподвижности микротрубочек может быть смягчена добавлением моторных белков, таких как кинезин-534, которые являются тетрамерами двигателей, используемых в митозе. В качестве альтернативы могут быть использованы искусственные димеры димерного кинезина-15.
Другим способом добавить больше текучести было бы позволить микротрубочкам выполнять свою динамическую нестабильность, рост и сокращение микротрубочек. В настоящее время микротрубочки, которые засеяны стабильными нитями GMPCPP, а затем подвергаются динамической нестабильности, намного длиннее, чем хотелось бы, чтобы сформировать шпиндель или тактоид, что приведет к очень длинным организациям, таким как вентиляторы или пучки. Таким образом, добавление динамической нестабильности микротрубочек должно быть сделано осторожно, чтобы сохранить тактоидную форму. Добавление связанных белков и ферментов, которые могут контролировать длину, может смягчить эту проблему. Например, вероятно, потребуются деполимеризирующие кинезины, такие как кинезин-1335, или разрывные ферменты, такие как катанин36. Эти эксперименты сложны и трудны, хотя они были бы очень проницательными, независимо от того, что показывают результаты. В каком бы направлении ни развивались будущие эксперименты, разработанная здесь платформа для создания тактоидов микротрубочек может выдавать новую информацию на физической основе организации микротрубочек.

Деление клеток с помощью митоза является одним из наиболее важных биологических процессов для поддержания жизни. Нити микротрубочек, состоящие из тубулиновых димеров, являются важными структурными элементами этого процесса. Переходный механизм, созданный в метафазе, когда хромосомы выравниваются в центре клетки, называется митотическим веретеном из-за его формы, которая похожа на веретено ткацкого станка, покрытого нитями (рисунок 1A). Во многих организмах хорошо известно, что микротрубочки используются в метафазе для проталкивания и вытягивания конденсированных хромосом в центр клетки, выравнивания их и подключения к микротрубочкам, которые будут раздвигать их в анафазе (рисунок 1B, C). Веретено образуется как в мейозе (рисунок 1B), так и в митозе (рисунок 1C), созданном из множества перекрывающихся микротрубочек, не обернутых вокруг центральной оси, как нить, но идущих параллельно интерфейсу. Создание этих структур на основе микротрубочек требует ассоциированных белков, которые сшиваются, и связанных ферментов, которые могут действовать как двигатели, помогающие толкать и тянуть хромосомы1.
Исследования мейотических веретен показали, что микротрубочки короткие, динамичные и перекрываются в сшитых массивах 2,3,4,5,6 (рисунок 1Di). Из-за физической организации этих коротких микротрубочек мейотическое веретено похоже на жидкокристаллический тактоид (рисунок 1Е). Действительно, было показано, что шпиндели объединяются и сливаются, как и следовало ожидать от жидкокристаллических тактоидов5.
Многие исследования, относящиеся к 1960-м годам, использовали фиксацию, последовательные сечения и электронную микроскопию, чтобы определить, что внутри митотического веретенаесть два типа микротрубочек 7,8,9,10. Первый тип называется кинетохорными микротрубочками, которые соединяют веретенообразный полюс с кинетохорой. Второй тип называется межполярными или полярными микротрубочками, которые прорастают мимо хромосом и перекрываются в средней зоне (рисунок 1Dii)8,9,10. Третий тип называется астральными микротрубочками, которые находятся вне веретена и соединяют полюса с краем клетки; эти организации, занимающиеся микротрубочками, выходят за рамки нынешнего обсуждения. Недавно были проведены исследования взаимодействия между аугмином6 и гамма-тубулиновым кольцевым комплексом, влияющим на центры нуклеации микротрубочек, в результате чего получилось митотическое веретено с более короткими микротрубочками, как на рисунке 1D.
Поскольку микротрубочки длиннее, чем они широкие, с высоким соотношением сторон и высокой жесткостью, они похожи на увеличенные версии жидкокристаллических молекул. В физике мягкой материи атомы и молекулы были аппроксимированы с использованием минимальных взаимодействий для вывода физических механизмов фазовых переходов, включая зарождение и плавление кристаллов11. Аналогичным образом, микротрубочки являются мезомасштабными объектами, которые являются увеличенными версиями молекул жидких кристаллов, что дает представление о физике динамики жидких кристаллов, включая зарождение и рост нематических фаз из изотропных. Далее, как обсуждалось выше, мейотическое веретено проявляет свойства, подобные свойствам жидкокристаллического тактоида, нематического состояния, которое нуклеативно и растет из изотропного состояния жидкокристаллических молекул 3,4,5. Для тактоидов нуклеация и рост аналогичны зарождению и росту других кристаллов (т. е. требуют относительно высокой концентрации мезогенов [молекул, образующих жидкие кристаллы]). Уникальная «веретенообразная» форма тактоида происходит от локального выравнивания жидкокристаллических мезогенов, которые выравниваются в нематическую фазу (рисунок 1E). Они не могут образовать округлый кристалл, потому что молекулы очень асимметричны. Учитывая природу микротрубочек, возможно, неудивительно, что митотический веретенообразный механизм, изготовленный из высокой локальной концентрации микротрубочек, также имеет одинаковую форму, независимо от того, называется ли он тактоидом или веретеном. Тактоиды могут быть биполярными, с полюсами на конических концах (рисунок 1Ei), или однородными, с полюсами, эффективно находящимися в бесконечности (рисунок 1Eii).
Учитывая важность формирования веретена, предпринимаются усилия по самоорганизующемуся образованию веретена in vitro путем демонстрации конденсации микротрубочек в пучки через ионные виды12,13, скученные агенты, которые создают истощение взаимодействий14,15, и специфические белки сшивания микротрубочек 13,16,17,18,19, 21. Удивительно, но, хотя все эти агенты работают для увеличения местной концентрации микротрубочек, они часто приводят к длинным пучкам микротрубочек, но не к тактоидам. Одна из причин, почему эти пучки длинные, может заключаться в том, что микротрубочки, составляющие их, также длинные. Недавняя работа с использованием более коротких микротрубочек также сообщила о более длинных пучках, которые не сужаются в конце15; в этом случае пучки удерживаются вместе с моторными белками, которые вызывают расширение пучков и, тем самым, делают их длиннее. Короткие микротрубочки с неэкстензионными сшивающимися соединениями необходимы для конических, шпиндельно-подобных сборок, как описано здесь.
Недавно мы разработали методику, позволяющую создавать тактоиды микротрубочек с использованием антипараллельного сшивки MAP65 в присутствии нуклеирующих стабильных микротрубочек22. Микротрубочки должны были быть короткими, но немногие известные регуляторы длины микротрубочек могут закрывать микротрубочки против динамической нестабильности или сквозного отжига. Вместо этого GMPCPP использовался для нуклеатизации и стабилизации нитей после роста. Это позволило создать высокую плотность коротких микротрубочек, которые могли бы самоорганизоваться в тактоиды. Эти тактоиды были однородными при просмотре под двулучепреломлением. В дополнение к коротким микротрубочкам для формирования тактоидов использовался специфический антипараллельный сшиватель MAP65 (рисунок 2). MAP65 — растительный микротрубочки-ассоциированный белок из семейства митотических сшивающих сшивателей PRC1/Ase11. MAP65 существует в виде димера, с сильным сродством к связыванию с самим собой, а также с микротрубочками24. В отличие от мейотических веретен и тактоидов, наблюдаемых с актиновыми нитями 25,26,27, которые являются биполярными и обладают жидкоподобными свойствами жидких кристаллов, тактоиды микротрубочек были твердоподобными22,28.
Здесь представлены протоколы создания тактоидов микротрубочек и характеристики формы сборок и подвижности составляющих с использованием флуоресцентных методов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2% Dichlorodimethylsilane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>118945</td>
			<td>A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-minute epoxy</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td></td>
			<td>For sealing experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>32900HPLC</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 cells</td>
			<td>Bio Labs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Competent bacterial cells used to express MAP65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C30-500MG</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 &#956;l aliquots in -20&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12544-AP</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td>A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889-10G</td>
			<td>Tubulin buffer base ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.5 ml tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402 18</td>
			<td>For holding experimental solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111000200</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with high NA objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E, W2 Confocal</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -20&#176;C</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13986148</td>
			<td>For storing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>328223H01-C</td>
			<td>For storing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass containers for silanization</td>
			<td>Michaels</td>
			<td></td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12544-4</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 &#956;l aliquots in -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133-250KU</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jenna Bioscience</td>
			<td>NU-4055</td>
			<td>Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating element for microscope</td>
			<td>Okolab stage top incubator</td>
			<td></td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidizole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2399</td>
			<td>Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>34155</td>
			<td>For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 230LT22</td>
			<td>To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP65 protein</td>
			<td>Ram Dixit</td>
			<td></td>
			<td>A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 &#956;M solution. This working solution is stored at 4&#176;C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCJ940</td>
			<td>Tubulin buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Nickel beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optomicroscan</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent double-sided tape</td>
			<td>3M - Scotch</td>
			<td>34-8724-5691-7</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7643-100G</td>
			<td>Tubulin buffer base ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic-F127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol</td>
			<td>Affymetrix Inc</td>
			<td>19966 500 GM</td>
			<td>A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4&#176;C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For pipetting viscous liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Racks for coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72240</td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4&#176;C</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td></td>
			<td>For storing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin Labeled</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL590M</td>
			<td>lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80&#176;C until hydrated in PEM80 and used for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td>lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80&#176;C until hydrated in PEM80 and used for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Ozone</td>
			<td>Jelight</td>
			<td>Model 342</td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackreg</td>
			<td>Biomedical Imaging Group</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>plugin for registering time series data to remove drift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turboreg</td>
			<td>Biomedical Imaging Group</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>plugin for registering time series data to remove drift</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of microtubule tactoids

Цитоскелет отвечает за крупную внутреннюю организацию и реорганизацию внутри клетки, и все это без менеджера, который будет руководить изменениями. Это особенно актуально во время митоза или мейоза, когда микротрубочки образуют веретено во время деления клеток. Веретено - это механизм, используемый для разделения генетического материала во время деления клеток. Для создания самоорганизованных веретен in vitro мы недавно разработали технику воссоздания микротрубочек в веретенообразные сборки с минимальным набором белков, связанных с микротрубочками, и агентов скученности. В частности, был использован MAP65, который является антипараллельным сшивателем микротрубочек из растений, гомологом Ase1 из дрожжей и PRC1 из организмов млекопитающих. Этот кросслинкер самоорганизует микротрубочки в длинные, тонкие, веретенообразные микротрубочки самоорганизованные сборки. Эти сборки также похожи на жидкокристаллические тактоиды, а микротрубочки могут быть использованы в качестве мезомасштабных мезогенов. Здесь представлены протоколы создания этих микротрубочек тактоидов, а также для характеристики формы сборок с помощью флуоресцентной микроскопии и подвижности составляющих с помощью флуоресцентного восстановления после фотоотбеливания.

С небольшим количеством компонентов, димеров тубулина и сшивающих микротрубочек, могут образовываться тактоиды микротрубочек (рисунок 2A). Хотя этот протокол описывает инкубацию для нуклеации и выращивания микротрубочек в инкубаторе, зарождение и рост можно наблюдать непосредственно под микроскопом (которые завершаются в течение 30 минут) (рисунок 2B). Концентрация тубулина поддерживается постоянной на уровне 13,6 мкм и связыванием MAP65-MT на уровне 10%.
На рисунке 4 показаны успешные данные. Тактоиды должны быть видны как с лазером 561 нм в канале тубулина, так и с 488 нм в канале MAP65, которые идеально перекрываются друг с другом (рисунок 4A). Одна из загадок системы заключалась в том, что ширина тактоидов, по-видимому, не изменяется при различных экспериментальных изменениях, включая изменение длины микротрубочек, концентрации MAP65 и агентов скученности (рисунок 4B)22,28. Длина гораздо более изменчива и зависит как от длины микротрубочек, так и от концентрации MAP65 (рисунок 4B)22,28.
При выполнении FRAP было замечено, что сигнал MAP65 восстанавливается, но сигнал микротрубочки не восстанавливается (рисунок 5). Восстановление FRAP происходит за счет мобильности и перемещения меченых и фотоотбеленных объектов. В случае MAP65 затемненные молекулы диссоциируют и удаляются от микротрубочек, а новые перемещаются в область (рисунок 5). Связывание MAP65 находится в равновесии, поэтому скорость связывания и развязывания равна (измеряется в молекулах в секунду). Для микротрубочек не было замечено никакого восстановления, подразумевающего, что микротрубочки не способны покинуть тактоид (рисунок 5A, Bi, C). Кроме того, не было замечено распространения затемненной области, что говорит о том, что микротрубочки локально неподвижны и не являются жидкостью внутри тактоидной формы.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg"> Рисунок 1: Различные модели формирования шпинделя. Митотическое веретено представляет собой машину, состоящую из микротрубочек и связанных с ними белков и ферментов, которая выравнивает и разделяет хромосомы на две новые дочерние клетки во время деления клеток. (A) Изображение реплики веретена раннего средневековья с тонкой пряжей из Нидерландов. Эта цифра была изменена по сравнению с изображением Викимедиа Питера ван дер Слуйса30. (B) Трехмерная реконструкция микротрубочек на различных стадиях мейоза дикого типа II. Микротрубочки показаны зеленым цветом, а хромосомы — серым. Шкала бара = 1 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Lantzsch et al.31. (C) Микроскопическое изображение микротрубочек в митотическом веретенде делящейся клетки Sf9. Полюса веретена и микротрубочки веретена помечены зеленым флуоресцентным белком. Шкала бара = 5 мкм. Эта цифра была изменена по сравнению с Advani et al.32. (D) Различные модели того, как организованы митотические и мейотические веретенообразные микротрубочки. (i) Ранее наблюдаемые для мейотических веретен, созданных из экстрактов яиц Xenopus, микротрубочки (зеленые) были выведены как короткие и динамичные по всему веретену. Это похоже на биполярную тактоидную организацию внутри жидкого кристалла. (ii) Каноническая модель организации микротрубочек внутри митотического веретена имеет два типа микротрубочек: межполярные или полярные микротрубочки (темно-зеленые), которые сшиваются в средней зоне вокруг хромосом, и кинетохорные микротрубочки (светло-зеленые), которые связываются и растягиваются от полюса до кинетохора, чтобы толкать и тянуть хромосомы. На всех изображениях хромосомы показаны прозрачным синим цветом, а веретенообразные полюса представлены темно-зеленым цветом. (E) Схемы мезогенов (зеленых линий) в жидкокристаллическом тактоиде для (i) биполярных и (ii) однородных тактоидов. Биполярные тактоиды имеют два полюса в конце тактоида, и мезогены переориентируются, чтобы указать на эти полюса. Однородные тактоиды имеют полюса в бесконечности, а мезогены не меняют ориентацию по длине тактоида. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg"> Рисунок 2: Конденсация микротрубочек. (A) Микротрубочки могут быть связаны и сшиты различными методами, включая ионные виды, силы истощения, вызванные агентами скученности, и специфические сшивки микротрубочек, такие как MAP65. (i) Димеры тубулина и белки MAP65 смешиваются с нуклеатом и выращиванием микротрубочек. (ii) Микротрубочки ядра и растут из тубулина, а MAP65 немедленно связывается с микротрубочками, другим мономером MAP65 или и тем, и другим и вызывает объединение. iii) микротрубочки в сшитых пучках зарождаются и растут. iv) Окончательная конфигурация представляет собой тактоид микротрубочки, похожий на шпиндель. (B) Временные ряды тактоидов микротрубочек, зарождающихся и растущих в течение 105 мин. Шкала бара = 5 мкм. Рисунок взят из Edozie et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg"> Рисунок 3: Сборка проточной камеры. Проточная камера выполнена с использованием стеклянного затвора, силанизированного покровного стекла и постоянной двусторонней ленты. Выделенная желтым цветом область — это путь потока, по которому проба течет и наблюдается. Объем проточной камеры составляет ~20 мкл. Эпоксидная смола использовалась для герметизации концов камеры, чтобы сохранить образец от испарения во время длительной визуализации в течение нескольких часов. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg"> Рисунок 4: Тактоидные изображения и анализ длины и ширины. (A) Примеры данных тактоидов, сформированных в соответствии с описанием и изображенных с использованием конфокального вращающегося диска, показывающих (i) изображение каналов микротрубочек, меченых родамином тубулина с использованием лазера 561 нм, (ii) визуализацию канала GFP-MAP65 с использованием лазера 488 нм и (iii) объединенное наложенное изображение из канала микротрубочек (пурпурный) и канала GFP-MAP65 (голубой). Перекрывающиеся области отображаются белым цветом и демонстрируют, что микротрубочки и MAP65 точно колокализуются. Шкала = 10 мкм для всех изображений в (A). (B) Количественная оценка длины и ширины тактоидов. i) изображение тактоида, подлежащего анализу без меток. Шкала = 5 мкм. (ii) То же изображение, что и в (i), где обозначены размеры длины (сплошная линия с прописными буквами) и ширины (пунктирная линия). Шкала шкалы = 5 мкм. (iii) Ширина измерялась путем взятия профиля интенсивности через тактоид в перпендикулярной биссектрисе (пунктирной линии), обозначенной в (ii). Профиль интенсивности соответствовал функции Гаусса, чтобы выявить амплитуду и ширину тактоида. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg"> Рисунок 5: Репрезентативные данные и анализ FRAP. (A) Данные временных рядов микроскопии (i) тактоида микротрубочек и (ii) GFP-MAP65 и (iii) наложение изображения обоих каналов с микротрубочками в пурпурном цвете и GFP-MAP65 в голубом, которые были фотоотбелены в момент 63 с и наблюдались в течение дополнительных 5 мин. (B) Количественная интенсивность (i) ) канал микротрубочек в отбеленной области (пурпурные круги) и фон (темно-серые круги) и (ii) канал GFP-MAP65 в отбеленной области (голубые квадраты) и фон (темно-серые квадраты). (C) Данные были скорректированы для фонового шума и перемасштабированы для канала микротрубочек (пурпурные круги) и канала GFP-MAP65 (голубые квадраты). Микротрубочки не восстанавливаются, но GFP-MAP65 подходит и может быть приспособлен (темно-серая линия) к растущему экспоненциальному распаду, чтобы найти амплитуду и временную шкалу восстановления. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Microtubule Tactoids at JoVE.com

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

В данной статье представлен протокол формирования сборок микротрубочек в форме тактоидов с использованием MAP65, сшивающего микротрубочек на растительной основе, и ПЭГ в качестве краудингового агента.

Самостоятельная сборка тактоидов микротрубочек

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Этот протокол обеспечивает спонтанную самоорганизацию тактоидов микротрубочек с помощью антипараллельного кросс-линкера MAP65. Эта система может помочь нам понять организацию микротрубочек и биологические системы, такие как митотические веретена. Основным преимуществом этой техники является то, что это минималистичная система, которая может воссоздать веретенообразные формы для микротрубочек, которые являются высоковоспроизводимыми и доступными для многих лабораторий.Этот метод применим не только к клеточным системам, но и может служить моделью для мезомасштабных исследований жидких кристаллов. Чтобы приготовить тубулин, сначала выньте из морозильной камеры минус 80 градусов Цельсия аликвоту немаркированного тубулина, содержащего один миллиграмм лиофилизированного тубулина, и держите его на льду. Затем добавьте 200 микролитров холодного ПЭМ-80.Чтобы растворить весь лиофилат, держите трубку на льду в течение 10 минут. Затем достаньте из морозильной камеры морозильной камеры с маркировкой родамина тубулин, содержащую 20 микрограммов лиофилизированного тубулинового порошка, и держите его на льду. Затем добавьте четыре микролитра холодного ПЭМ-80 и держите трубку на льду в течение 10 минут, чтобы растворить весь лиофилат.После растворения лиофилизированных тубулинов добавьте 100 микролитров повторно суспендированного немаркированного раствора тубулина к четырехмикролитровому раствору тубулина, меченому родамином. Затем перемешайте растворы, положив трубы шесть-семь раз очень медленно. Чтобы сохранить оставшиеся 100 микролитров немаркированного раствора тубулина, сначала вставьте трубку в жидкий азот, чтобы заморозить раствор, затем держите трубку при минус 80 градусах Цельсия для дальнейшего использования.Затем распределите тубулиновую смесь на семь новых пробирок, добавив в каждую по 15 микролитров. Заморозьте трубки в жидком азоте, как было продемонстрировано ранее, и храните их при минус 80 градусах Цельсия для будущего использования. Чтобы собрать проточные камеры для проведения экспериментов, сначала очистите стеклянную горку с двойным дистиллированным водой и высушите ее безворсовой лабораторной салфеткой.Затем сначала очистите горку этанолом, а затем дважды дистиллированной водой. Чтобы создать траекторию потока, вырежьте кусок двусторонней ленты длиной от 40 до 50 миллиметров. Затем разделите его между собой, чтобы создать две более тонкие полоски ленты, и поместите две полоски на слайд на расстоянии от пяти до восьми миллиметров друг от друга.Затем поместите силанизированные крышки на верхнюю часть пути потока. Затем запечатайте слайд и крышку сдвиньте двусторонние ленточные полоски, осторожно надавив на область ленты с обратной стороны ручки. Если уплотнение сделано хорошо, лента должна превратиться из полупрозрачной в прозрачную.Чтобы снять лишнюю ленту по краям, отрежьте ленту лезвием бритвы, оставив всего один миллиметр от входа в проточную камеру. Затем маркируйте камеру соответствующими экспериментальными параметрами Для выполнения тактоидных экспериментов, во-первых, разморозьте все необходимые реагенты на льду и храните их на льду во время работы. Затем покройте проточную камеру 20 микролитрами 5% неионного блок-сополимерного поверхностно-активного вещества, растворенного в ПЭМ-80, небольшими каплями на обоих концах камеры, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха внутри.Затем держите проточную камеру во влажной камере, изготовленной из чашки Петри, с влажной, безворсовой лабораторной салфеткой в течение не менее пяти-семи минут. Затем смешайте PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, дитиотрейтол, глюкозу, полиэтиленгликоль, смесь тубулинов, изготовленную ранее, и MAP65 с GFP MAP65 для визуализации в стерильной трубке путем пипетирования пять-шесть раз, сохраняя трубку на льду. Затем добавляют один микролитр предварительно смешанного раствора глюкозооксидазы и каталазы в пробирку смеси тубулин-МАП и снова перемешивают по трубам семь-восемь раз.Разделите общий объем раствора на две порции для использования в отдельных камерах. Между тем, жидкость, добавленная ранее в проточную камеру, должна быть удалена капиллярным действием с помощью безворсовой лабораторной салфетки на другом конце камеры вместе с добавлением смеси тубулин-MAP в проточную камеру. Как только образец полностью окажется внутри камеры, запечатайте два конца камеры с помощью пятиминутной эпоксидной смолы и держите ее при 37 градусах Цельсия в течение примерно 30 минут, чтобы зародышевать и выращивать тактоиды микротрубочек.Для визуализации тактоидов с помощью флуоресцентной микроскопии используйте объективы с числовой апертурой 1,2 или более при увеличении 60X или выше для сбора достаточного количества света в флуоресценции. Записывайте изображения с помощью дополнительного полупроводника оксида металла или камеры устройства с зарядовой связью. Чтобы сохранить образец, храните его в экологической камере, установленной при 37 градусах Цельсия.В качестве альтернативы для этой цели могут использоваться другие нагреватели ступеней, в том числе нагреватели стадии горячего воздуха и объективные регулируемые по температуре воротники с циркулирующей теплой водой. Поскольку соответствующие источники возбуждения необходимы для правильной флуоресценции тубулина родамина, используйте 561-нанометровый лазер с мощностью не менее одного милливатта в образце для получения изображений хорошего качества. Однако для GFP MAP65 измените источник возбуждения на 488-нанометровый лазер.Если используется широкоугольная эпифлуоресцентная микроскопия, то используют куб родаминового фильтра с возбуждением 540 12,5 нанометров, дихроиком 545 нанометров 12,5 нанометровой отсечки и излучением 575 нанометров длиннопроходной. Для GFP MAP используйте куб фильтра GFP с возбуждением 480 15 нанометров, дихроиком 505 нанометров 15 нанометров и излучением 515 нанометров в длинный проход. Убедившись, что мощность освещения и время экспозиции таковы, что шкала интенсивности для камеры не насыщена, сделайте не менее 10 изображений различных областей для изображения более 100 тактоидов как в красном, так и в зеленом каналах и сохраните их как 16-битные изображения TIFF для анализа.Используя этот протокол, тактоиды микротрубочек, образование которых завершается в течение 30 минут, могут быть непосредственно визуализированы под микроскопом. Тактоиды видны как 561-нанометровым лазером в канале тубулина, так и 488-нанометровым лазером в канале MAP65. Изображения также идеально пересекаются друг с другом.В этом методе также можно измерить длину и ширину тактоидов. Было обнаружено, что профиль интенсивности тактоида изменяется в зависимости от его ширины. Более того, неподвижный характер тактоидов микротрубочек был продемонстрирован восстановлением флуоресценции после фотоотбеливания или экспериментов FRAP, которые не показали никакого восстановления флуоресценции после фотоотбеливания.С другой стороны, эксперименты FRAP выявили мобильную природу MAP65, для которой после фотоотбеливания можно наблюдать постепенное восстановление и флуоресценцию. Это восстановление флуоресценции MAP65 может быть приспособлено к растущему экспоненциальному распаду, чтобы найти амплитуду и временную шкалу восстановления. Тактоидная экспериментальная часть должна быть завершена в течение 10-12 минут, так как тубулин может быстро испортиться на льду, что может нанести вред зарождению тактоидов.Будущая работа с различными микротрубочками, сшивающими белки и сшивающие моторные белки, ферменты, которые могут перемещать микротрубочки, будет продолжать раскрывать новую информацию о самоорганизации митотического веретена.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

Получение гигантских пузырьках Encapsulating микросферы Центрифугирование эмульсии вода-в-масле

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay для фосфорилирования и привязки микротрубочек наряду с локализацией тау белка в клетках рака прямой кишки

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Измерение потребления кислорода митохондрий в Permeabilized волокнах дрозофилы, используя минимальное количество ткани

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Кристаллическая структура N-концевой домен рианодиновыми рецепторов от Plutella xylostella

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Фракционирование клеток U937 клеток в отсутствие высокоскоростной центрифуги

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Использование Grafix для обнаружения переходных интеракторов Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Практические аспекты пробоподготовки и настройки экспериментовпо релаксационной дисперсии РНК 1 H R1ρ

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Измерение способности митохондрий скелетных мышц импортировать белок

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Синтез масаримицина, ингибитора малых молекул грамположительного бактериального роста

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Одновременная визуализация динамики сшитых и одиночных микротрубочек in vitro методом TIRF-микроскопии

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...