Name: self-assembly of microtubule tactoids
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Microtubule Tactoids at JoVE.com

Yazarlar, tüm yaz 2021 Ross Lab üyelerine, özellikle de K. Alice Lindsay'e yardımları için teşekkür eder. Bu çalışma, NSF BIO-2134215'ten S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee ve J.L. Ross'u destekleyen bir hibe ile desteklendi. KECK Vakfı'ndan (Rae Anderson, USD, kurşun PI) gelen bir hibe, R. Branch ve P. Chauhan'ı kısmen destekledi.

<ol>
	<li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-associated+proteins:+structuring+the+cytoskeleton.">Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).</li><li>Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocyte+meiotic+spindle+assembly+and+function.">Oocyte meiotic spindle assembly and function.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).</li><li>Brugu&#233;s, J., Needleman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+basis+of+spindle+self-organization.">Physical basis of spindle self-organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).</li><li>Brugu&#233;s, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleation+and+transport+organize+microtubules+in+metaphase+spindles.">Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles.</a> Cell. 149 (3), 554-564 (2012).</li><li>Gatlin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spindle+fusion+requires+dynein-mediated+sliding+of+oppositely+oriented+microtubules.">Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules.</a> Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).</li><li>Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Augmin:+A+protein+complex+required+for+centrosome-independent+microtubule+generation+within+the+spindle.">Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle.</a> Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).</li><li>Inoue, S., Sato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+motility+by+labile+association+of+the+nature+of+mitotic+spindle+fibers+and+their+role+in+chromosome+movement+molecules.">Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules.</a> Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).</li><li>Allenspach, A. L., Roth, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+variations+during+mitosis+in+the+chick+embryo.">Structural variations during mitosis in the chick embryo.</a> Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).</li><li>Theg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+microtubules+in+different+animal+cells.">Cytoplasmic microtubules in different animal cells.</a> Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).</li><li>Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+anaphase+spindle+elongation+in+Diatoma+vulgare.">On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare.</a> Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).</li><li>Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Condensed Matter Physics. , (1995).</li><li>Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastr&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+assembly+and+collective+behavior+of+microtubule+bundles+in+the+presence+of+polyamines.">Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines.</a> Biophysical Journal. 101 (1), 205 (2011).</li><li>Needleman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-order+assembly+of+microtubules+by+counterions:+From+hexagonal+bundles+to+living+necklaces.">Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).</li><li>Ross, J. L., Fygenson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobility+of+taxol+in+microtubule+bundles.">Mobility of taxol in microtubule bundles.</a> Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).</li><li>Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilia-like+beating+of+active+microtubule+bundles.">Cilia-like beating of active microtubule bundles.</a> Science. 333 (6041), 456-459 (2011).</li><li>Brandt, R., Lee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+organization+of+microtubule-associated+protein+tau.+Identification+of+regions+which+affect+microtubule+growth,+nucleation,+and+bundle+formation+in+vitro.">Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).</li><li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+organization+and+dynamics+dependent+on+microtubule-associated+proteins.">Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA.">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173 (1989).</li><li>MacRae, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+organization+by+cross-linking+and+bundling+proteins.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+(BBA).">Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).</li><li>She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+the+Ase1/PRC1/MAP65+family+in+central+spindle+assembly.">Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly.</a> Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).</li><li>Walczak, C. E., Shaw, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+MAP+for+Bundling+Microtubules.">A MAP for Bundling Microtubules.</a> Cell. 142 (3), 364-367 (2010).</li><li>Edozie, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+spindle-like+microtubule+structures.">Self-organization of spindle-like microtubule structures.</a> Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).</li><li>Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+the+microtubule+cross-linking+protein+MAP65-1+reveals+a+molecular+mechanism+for+contact-angle-dependent+microtubule+bundling.">Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling.</a> Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).</li><li>Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+65-kDa+carrot+microtubule-associated+protein+forms+regularly+arranged+filamentous+cross-bridges+between+microtubules.">The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).</li><li>Scheff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuning+shape+and+internal+structure+of+protein+droplets+via+biopolymer+filaments.">Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments.</a> Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).</li><li>Weirich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+behavior+of+cross-linked+actin+bundles.">Liquid behavior of cross-linked actin bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).</li><li>Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+motors+divide+active+liquid+droplets.">Self-organizing motors divide active liquid droplets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).</li><li>Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crowder+and+surface+effects+on+self-organization+of+microtubules.">Crowder and surface effects on self-organization of microtubules.</a> Physical Review E. 103 (6), 062408 (2021).</li><li>Stanhope, K. T., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+MAPs,+and+motor+patterns.">Microtubules, MAPs, and motor patterns.</a> Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).</li><li>Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons Available from: <a target="_blank" href="https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg">https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg</a> (2022)</li><li>Lantzsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+reorganization+during+female+meiosis+in+c.+Elegans.">Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans.</a> eLife. 10, 58903 (2021).</li><li>Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creation+and+testing+of+a+new,+local+microtubule-disruption+tool+based+on+the+microtubule-severing+enzyme,+katanin+p60.">Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60.</a> Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).</li><li>Pecqueur, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+designed+ankyrin+repeat+protein+selected+to+bind+to+tubulin+caps+the+microtubule+plus+end.">A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).</li><li>Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+dimers+of+the+mitotic+kinesin+motor+Eg5+step+processively+and+support+substantial+loads+in+vitro.">Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).</li><li>Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+kinesin-13+mutant+catalytically+depolymerizes+microtubules+in+ADP.">A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP.</a> Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).</li><li>McNally, F. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+katanin,+an+ATPase+that+severs+and+disassembles+stable+microtubules.">Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules.</a> Cell. 75 (3), 419-429 (1993).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Burada açıklanan yöntemler mikrotübül taktoidleri oluşturmak için çeşitli makalelerde kullanılmıştır (Şekil 2)22,28. Bu deneyler, çoğu hücre tipinde mitotik veya mayotik iğin şeklini ve stabilitesini kontrol eden örgütsel ilkeleri ortaya çıkarmaya yardımcı olmak için biyolojik olarak ilgilidir. Ek olarak, mikrotübüller, sıvı kristallerin izotropik fazlardan nematik fazları nasıl çekirdeklendirdiği ve büyüttüğü hakkında daha fazla bilgi edinmede yardımcı olabilecek model sıvı kristal mezojenleridir.
Burada özetlenen prosedür, mikrotübül kendi kendine organizasyonu keşfetmek için çeşitli avantajlara sahiptir. İlk olarak, laboratuvara başlamadan önce lise öğrencileri de dahil olmak üzere birçok öğrenci tarafından laboratuvarda çok az ön bilgi veya eğitim ile gerçekleştirilmiş olan oldukça tekrarlanabilir. Taktoidler çift refringent22'dir, floresan mikroskobuna ek olarak iletilen ışıkta görüntülenmelerini sağlar, bu yöntemi birçok laboratuvar için erişilebilir kılar ve bu deneysel prosedür, üst düzey araştırmalara ek olarak eğitim amaçlarına uyarlanabilir. Son olarak, bu süreç biyolojik sistemleri soyulmuş, indirgemeci bir yaklaşımla anlamaya ve araştırmaya devam etmek için yollar açarak, her bir ek koşulun, proteinin veya katkı maddesinin taktoidlerin ve belki de nihayetinde iğin kendi kendine organizasyonunu nasıl değiştirebileceğini anlamasını sağlar. Daha iyi biyomimikri için hedefler arasında aktivite, akışkanlık ve filament polarite sıralaması bulunur.
Deneyi etkileyen ve beklenmedik sonuçlar veren birkaç faktör olabilir. Örneğin, taktoidler oluşmuyorsa (Şekil 2) ancak fan benzeri desenler gözlenirse, MAP65 muhtemelen mevcut değildir veya mikrotübüllere bağlanmaz22,28. Bu, MAP65 floresan kanalında da belirgin olmalıdır, çünkü GFP-MAP65 mikrotübüllere bağlı olmayacaktır.
Taktoidler oluşmazsa ve arka plan cam üzerinde lekeler olarak görünüyorsa, bunun nedeni yüzey kaplaması olabilir. Bir kez gerçekleştirildikten sonra, silanizasyon kapaklarda sadece 1 ay sürer. Yıprandığında, tübülin spesifik olmayan bir şekilde maruz kalan yüzeye bağlanabilecektir. Bu bağlanma garip desenlerde gerçekleşecektir.
Taktoidler oluşmazsa ve tübülin çeşitli şekil ve boyutlardaki agregalarda gözlenirse, bunun nedeni düşük kaliteli tübülin olabilir. Tubulin, mikrotübül polimerizasyonu yerine bu yol dışı agregasyonu yönlendirebilecek ilk agregaları çıkarmak için santrifüj edilebilir. Yüzey tübüline bağlanıyorsa, çözeltideki tübülü de tüketebilir. Mikrotübüllerin polimerizasyonu için kritik konsantrasyonun altındaki düşük tübülin konsantrasyonları, agregalara neden olabilir.
FRAP deneylerinde, MAP65 kanalı herhangi bir iyileşme göstermiyorsa (Şekil 5), fotobeyazlatmanın mikrotübüllere fotozarar vermiş olması mümkündür. Fotohasar, filamentlerin lokalize tahribatına neden olur. Bu, iletilen kanalda muayene ile kontrol edilebilir. Mikrotübül taktoidleri, iletilen kanalda, çevredeki su ile yüksek indeksli kırılma uyumsuzluğu yoluyla görülebilir. Işık kaynaklı fotohasar, fotobeyazlatmaya tabi tutulan ROI'nin bulunduğu yerde iletilen ışık görüntülemede yanık izi veya kontrast kaybı olarak görünecektir. Bu meydana gelirse, proteinlerin fotohasarını inhibe etmek için lazer veya ışık gücü azaltılmalıdır.
Bu prosedür ve yaklaşımda karşılaşılan çeşitli zorluklar vardı. Bir sorun, uzunluk ölçümlerinin şu anda resme tıklanarak elle gerçekleştirilmesidir. Bu yöntem, basit olsa da, yüksek belirsizliğe neden olabilir. Enine kesiti kullanan ve bir Gaussian'a uyan genişlik ölçümü, boyutu ölçmek için daha iyi bir yöntemdir. Uzunluk için benzer bir yöntem kullanılabilir. İkinci bir sorun, bazen, taktoidlerin, çok uzun ve ince oldukları için bükülebilmeleridir. Bu, uzunluğu ölçmeyi daha zor hale getirir. Kontur uzunluğu, parçalı bir çizgi kullanılarak ölçülebilir, ancak bir segment her eklendiğinde belirsizlik eklenir.
Bilimsel bir bakış açısına göre, bu yaklaşımın sıvı kristaller veya iğler için bir model olarak kullanımı için başka zorlukları da vardır. İlk zorluk, mikrotübüllerin oluşturduğu taktoidlerin uzun, ince şekli olmuştur (Şekil 3 ve Şekil 4). Önceki yayınlarda belirtildiği gibi22, mikrotübül taktoidleri bipolar değil, homojen taktoidlerdir. Bu, şekli oluşturan mikrotübüllerin, yapının uçlarına işaret edecek şekilde yeniden yönlendirilmediği anlamına gelir. Bunun yerine, tüm mikrotübüller uzun eksene paraleldir ve "kutuplar" sonsuzlukta bulunur. Bu, moleküler sıvı kristaller veya hatta sıvı kristal mezojenler olarak da işlev görebilen aktin veya DNA için gözlemlenen taktoidlerden çok farklıdır. Bu diğer sistemlerde, taktoidler bipolar ve çapraz polarizörlerde bakıldığında, çubukların yeniden yönlendirilmesinin belirgin işaretlerini gösterirler.
Bu sistemdeki ikinci büyük zorluk, mikrotübüllerin taktoid içinde hareketsiz olmasıdır. Bu, mikrotübüllerin geri kazanımı çok düşük olduğu için FRAP deneylerinden ve analizlerinden açıktır. Katı benzeri yapıları, mikrotübül taktoidlerini büyük ölçekli sıvı kristal analogları kadar az değerli kılar. Bir sıvı kristalin nematik fazı hem sıvı (sıvı) hem de kristal (organize) özelliklere sahip olmalıdır. Şekil iş mili için doğru gibi görünse de, hareketsizlik sistemi model bir mitotik iş mili olarak daha az heyecan verici hale getirir. Öte yandan, bu konu, sistemde daha fazla akışkanlık yaratmak için deneylerin nasıl değiştirilebileceğini araştırmak için fırsatlar sunmaktadır.
Bu bilimsel zorluklar, sistem hakkında yeni bilgilere izin verecek heyecan verici fırsatlar sunmaktadır. Mikrotübül taktoidlerini daha bipolar hale getirmek için, daha kısa mikrotübüller kullanılabilir. Bununla birlikte, mikrotübüllerin aktinin yaptığı gibi uzunluğu kontrol etmek için çok iyi karakterize edilmiş kapak proteinlerine sahip olmadıkları için ek bir zorluk vardır. Çekirdeklenme ve büyüme kullanımı, kısa mikrotübüller yapmak için çok yüksek konsantrasyonlarda tübülin ve GMPCPP kullanılmasını gerektirir. Yüksek tübülin konsantrasyonu, sistemde daha fazla sayıda filamentle sonuçlanır, bu da taktoidleri birbirinden ayırmayı zorlaştırır. DARPin33 gibi yeni mikrotübül kapasitörlerinin eklenmesi bu duruma yardımcı olabilir. Mikrotübüllerin hareketsiz olmasının ikinci sorunu, mitozda kullanılan motorların tetramerleri olan kinesin-534 gibi motor proteinlerinin eklenmesiyle hafifletilebilir. Alternatif olarak, dimerik kinezin-1'in yapay dimerleri kullanılabilir15.
Daha fazla akışkanlık eklemenin bir başka yolu, mikrotübüllerin dinamik kararsızlıklarını, mikrotübüllerin büyümesini ve küçülmesini gerçekleştirmelerine izin vermektir. Şu anda, kararlı GMPCPP filamentleri ile tohumlanan ve daha sonra dinamik kararsızlığa uğrayan mikrotübüller, bir iğ veya taktoid oluşturmak için istenenden çok daha uzundur, bu da fanlar veya demetler gibi çok uzun organizasyonlara neden olur. Bu nedenle, mikrotübül dinamik kararsızlığının eklenmesi, dokuntoid şeklini korumak için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Uzunluğu kontrol edebilen ilişkili proteinlerin ve enzimlerin eklenmesi bu sorunu hafifletebilir. Örneğin, kinezin-1335 gibi kinezinlerin depolimerize edilmesi veya katanin36 gibi enzimlerin kesilmesi muhtemelen gerekli olacaktır. Bu deneyler karmaşık ve zordur, ancak sonuçlar ne ortaya çıkarsa çıksın çok anlayışlı olacaktır. Gelecekteki deneyler hangi yöne giderse gitsin, mikrotübül taktoidleri oluşturmak için burada geliştirilen platform, mikrotübül organizasyonunun fiziksel temeli hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarabilir.

Mitoz yoluyla hücre bölünmesi, yaşamı sürdürmek için en önemli biyolojik süreçlerden biridir. Tübülin dimerlerinden oluşan mikrotübül filamentleri, bu işlemin temel yapısal elemanlarıdır. Kromozomlar hücre merkezinde hizalandığında metafazda oluşturulan geçici makineye, ipliklerle kaplı bir tezgahın mili gibi olan şekli nedeniyle mitotik iğ denir (Şekil 1A). Birçok organizmada, mikrotübüllerin metafazda yoğunlaştırılmış kromozomları hücrenin merkezine itmek ve çekmek, hizalamak ve anafazda onları ayıracak mikrotübüllere bağlamak için kullanıldığı iyi bilinmektedir (Şekil 1B, C). İş mili hem mayoz (Şekil 1B) hem de mitozda (Şekil 1C) oluşur, iplik gibi merkezi eksenin etrafına sarılmamış, ancak arayüze paralel çalışan birçok üst üste binen mikrotübülden yaratılmıştır. Bu mikrotübül bazlı yapıların oluşturulması, çapraz bağlanan ilişkili proteinleri ve kromozomları itmeye ve çekmeye yardımcı olmak için motor görevi görebilen ilişkili enzimleri gerektirir1.
Mayotik iğler üzerine yapılan çalışmalar, mikrotübüllerin kısa, dinamik olduğunu ve çapraz bağlı dizilerde 2,3,4,5,6 üst üste bindiğini göstermiştir (Şekil 1Di). Bu kısa mikrotübüllerin fiziksel organizasyonu nedeniyle, mayotik iş mili bir sıvı kristal taktoide benzer (Şekil 1E). Gerçekten de, iğlerin sıvı kristal taktoidlerden bekleneceği gibi birleştiği ve birleştiği gösterilmiştir5.
1960'lı yıllara dayanan birçok çalışma, mitotik iş mili 7,8,9,10 içinde iki tip mikrotübül olduğunu belirlemek için fiksasyon, seri bölümler ve elektron mikroskobu kullanmıştır. İlk tip, iş mili direğini kinetochore'a bağlayan kinetochore mikrotübülleri olarak adlandırılır. İkinci tip, kromozomları geçerek büyüyen ve orta bölgede üst üste binen polar veya polar mikrotübüller olarak adlandırılır (Şekil 1Dii)8,9,10. Üçüncü bir tip, iğin dışında bulunan ve kutupları hücre kenarına bağlayan astral mikrotübüller olarak adlandırılır; Bu mikrotübül örgütleri mevcut tartışmanın kapsamı dışındadır. Mikrotübüller için nükleasyon merkezlerini etkileyen augmin6 ve gama-tübülin halka kompleksi arasındaki etkileşim üzerine son zamanlarda yapılan çalışmalar yapılmıştır, bu da Şekil 1D'deki gibi daha kısa mikrotübüllere sahip mitotik bir iğle sonuçlanır.
Mikrotübüller geniş olduklarından daha uzun olduklarından, yüksek en-boy oranına ve yüksek sertliğe sahip olduklarından, sıvı kristal moleküllerinin ölçeklendirilmiş versiyonları gibidirler. Yumuşak madde fiziğinde, atomlar ve moleküller, çekirdeklenme ve kristallerin erimesi de dahil olmak üzere faz geçişlerinin fiziksel mekanizmalarını çıkarmak için minimum etkileşimler kullanılarak yaklaştırılmıştır11. Benzer şekilde, mikrotübüller, sıvı kristal moleküllerinin ölçeklendirilmiş versiyonları olan mezo ölçekli nesnelerdir ve nematik fazların izotropik olanlardan çekirdeklenmesi ve büyümesi de dahil olmak üzere sıvı kristal dinamiğinin fiziği hakkında fikir verir. Ayrıca, yukarıda tartışıldığı gibi, mayotik iğ, sıvıkristal moleküllerinin izotropik durumundan 3,4,5 çekirdeklenen ve büyüyen nematik bir durum olan sıvı kristal taktoidinki gibi özellikler gösterir. Taktoidler için, çekirdeklenme ve büyüme diğer kristallerinki gibidir (yani, nispeten yüksek konsantrasyonda mezojen [sıvı kristalleri oluşturan moleküller] gerektirir). Taktoidin benzersiz "iğ" şekli, nematik faza hizalanan sıvı kristal mezojenlerinin lokal hizalamasından gelir (Şekil 1E). Yuvarlak bir kristal oluşturamazlar çünkü moleküller oldukça asimetriktir. Mikrotübüllerin doğası göz önüne alındığında, yüksek yerel mikrotübül konsantrasyonundan yapılan mitotik iğ makinelerinin, taktoid veya iğ olarak adlandırılıp adlandırılmadığına bakılmaksızın aynı şekle sahip olması şaşırtıcı değildir. Taktoitler, konik uçlarda kutuplarla (Şekil 1Ei) bipolar veya homojen olabilir, kutuplar sonsuzlukta etkili bir şekilde (Şekil 1Eii).
İş mili oluşumunun önemi göz önüne alındığında, iyonik türler 12,13, tükenme etkileşimleri yaratan kalabalık ajanlar 14,15 ve spesifik mikrotübül çaprazbağlama proteinleri 13,16,17,18,19 yoluyla demetler halinde mikrotübül yoğuşmasını göstererek in vitro olarak kendi kendini organize eden iğ oluşumuna yönelik çabalar devam etmektedir. 21. Şaşırtıcı bir şekilde, bu ajanların hepsi mikrotübüllerin lokal konsantrasyonunu arttırmak için çalışsa da, genellikle uzun mikrotübül demetleriyle sonuçlanırlar, ancak taktoidlerle sonuçlanmazlar. Bu demetlerin uzun olmasının bir nedeni, onları oluşturan mikrotübüllerin de uzun olması olabilir. Daha kısa mikrotübüller kullanan son çalışmalar,15'in sonunda konik olmayan daha uzun demetler de bildirmiştir; Bu durumda, demetler, demetlerin genişlemesine neden olan motor proteinleri ile bir arada tutulur ve böylece onları daha uzun hale getirir. Burada açıklandığı gibi, konik, iş mili benzeri montajlar için ekstansiyon olmayan çapraz bağlayıcılara sahip kısa mikrotübüllere ihtiyaç vardır.
Son zamanlarda, çekirdeklendirici stabil mikrotübüllerin varlığında antiparalel çapraz bağlayıcı MAP65 kullanılarak mikrotübül taktoidlerinin oluşturulmasını sağlamak için bir teknik geliştirdik22. Mikrotübüllerin kısa olması gerekiyordu, ancak mikrotübül uzunluğundaki bilinen birkaç düzenleyici, mikrotübülleri dinamik kararsızlığa veya uçtan uca tavlamaya karşı kapatabilir. Bunun yerine, büyümeden sonra filamentleri çekirdeklendirmek ve stabilize etmek için GMPCPP kullanıldı. Bu, taktoidlere kendi kendini organize edebilen yüksek yoğunluklu kısa mikrotübüller oluşturmaya izin verdi. Bu taktoidler birefringans altında bakıldığında homojendi. Kısa mikrotübüllere ek olarak, taktoidleri oluşturmak için spesifik bir antiparalel çapraz bağlayıcı olan MAP65 kullanılmıştır (Şekil 2). MAP65, PRC1 / Ase1 mitotik çapraz bağlayıcılar ailesinde bitki mikrotübül ile ilişkili bir proteindir23. MAP65, kendisine ve mikrotübüllere bağlanmak için güçlü bir afiniteye sahip bir dimer olarak bulunur24. Aktin filamentleri 25,26,27 ile gözlenen, bipolar olan ve sıvı kristallerin sıvı benzeri özelliklerine sahip olan mayotik iğ ve taktoidlerin aksine, mikrotübül taktoidlerinin katı benzeri22,28 olduğu gözlenmiştir.
Burada, mikrotübül taktoidlerinin oluşturulması ve montajların şeklini ve floresan bazlı teknikler kullanılarak bileşenlerin hareketliliğini karakterize etmek için protokoller sunulmaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2% Dichlorodimethylsilane</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>118945</td>
			<td>A hydrophobic silane surface treatment. This can be resused upto three times and kept at room temperature for one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-minute epoxy</td>
			<td>Bob Smith Industries</td>
			<td></td>
			<td>For sealing experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>32900HPLC</td>
			<td>100%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 cells</td>
			<td>Bio Labs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td>Competent bacterial cells used to express MAP65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C30-500MG</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 &#956;l aliquots in -20&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (22 mm x 22 mm or 22 mm x 30 mm)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12544-AP</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815-5G</td>
			<td>A small molecule that is used to break disulfide bonds and scavenge oxygen. A 1 M stock is made from powder (Sigma) in ddH2O. The solution is aliquoted and stored at -20C for upto one year. The aliquots are used 7-8 times then discarded.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889-10G</td>
			<td>Tubulin buffer base ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 0.5 ml tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>05 402 18</td>
			<td>For holding experimental solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>111000200</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>1004-110</td>
			<td>For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence microscope with high NA objectives</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E, W2 Confocal</td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -20&#176;C</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>13986148</td>
			<td>For storing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezer -80&#176;C</td>
			<td>Thermo scientific</td>
			<td>328223H01-C</td>
			<td>For storing proteins.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass containers for silanization</td>
			<td>Michaels</td>
			<td></td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>12544-4</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7528-250G</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. A 300 mg/ml stock is made in ddH2O and stored in 10 &#956;l aliquots in -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose oxidase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2133-250KU</td>
			<td>Part of the oxygen scavenging system. This is stored at 4&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMPCPP</td>
			<td>Jenna Bioscience</td>
			<td>NU-4055</td>
			<td>Slowly hydrolyzable analog of GTP used to polymerize and stabilize the microtubules by reducing the dynamic instability and spontaneous critical concentration for microtubule nucleation to get a consistent length. We purchase a 10 mM stock from Jena Biosciences and store it at -20&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating element for microscope</td>
			<td>Okolab stage top incubator</td>
			<td></td>
			<td>For imaging experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidizole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I2399</td>
			<td>Used to elute MAP65 protein from Nickel beads to purify MAP65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>34155</td>
			<td>For cleaning and for pulling solutions through experimental chambers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P250-500</td>
			<td>1 M in ddH2O, made fresh to prevent acidification over time.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Nitrogen</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>NI 230LT22</td>
			<td>To drop freeze aliquots. This can also be used for storage (not recommended)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MAP65 protein</td>
			<td>Ram Dixit</td>
			<td></td>
			<td>A microtubule-associated protein (MAP) with a molecular weight of 65 kD that is an antiparallel microtubule crosslinker. We have purified an unlabeled and GFP-labeled version of MAP65-1 from Arabidopsis thaliana. We mix the GFP-MAP65 with the unlabeled MAP65 such that 10% of the protein is labeled. The working stock is a 10.8 &#956;M solution. This working solution is stored at 4&#176;C and remade fresh every week. The protocol for purifying the MAP65 and GFP-MAP65 is given in our prior methods chapter (26).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MKCJ940</td>
			<td>Tubulin buffer ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTA-Nickel beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>30210</td>
			<td>Beads required to purify 6xHis tagged MAP65 proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optomicroscan</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>405 nm laser system which can focus the laser in any desired shape of region of interest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEM80</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Neutral tubulin polymerizing base buffer for solution made from 80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stored at 4&#176;C for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanent double-sided tape</td>
			<td>3M - Scotch</td>
			<td>34-8724-5691-7</td>
			<td>For experimental chambers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>For humid chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7643-100G</td>
			<td>Tubulin buffer base ingredient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic-F127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A block-copolymer with two hydrophilic polyethylene oxide (PEO) blocks on the ends and a hydrophobic center block of polyphenylene oxide (PPO) hydrophobic surface coating we use to prevent protein binding to the surface. Pluronic-F127 is purchased as a powder (Sigma) and dissolved to a 5% (w/v) solution in ddH2O overnight. Once dissolved, the solution can be stored at room temperature for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene Glycol</td>
			<td>Affymetrix Inc</td>
			<td>19966 500 GM</td>
			<td>A crowding agent used to create depletion forces to bring tactoids to the surface and help to organize microtubules. We create a 5% (w/v) solution of 100 kDa PEG in PEM80. The solution is stored in 4&#176;C for upto one year and placed on the rocker before use. It is viscous, so we recommend using a positive displacement pipette to work with it.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Positive displacement pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>For pipetting viscous liquids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Racks for coverslips</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72240</td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4&#176;C</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td></td>
			<td>For storing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin Labeled</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>TL590M</td>
			<td>lyophilized rhodamine-labeled tubulin from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80&#176;C until hydrated in PEM80 and used for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubulin protein</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>T240</td>
			<td>lyophilized tubulin 99% pure unlabeled from pig brain is purchased (Cytoskeleton) and stored in -80&#176;C until hydrated in PEM80 and used for upto one year.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Ozone</td>
			<td>Jelight</td>
			<td>Model 342</td>
			<td>For preparing experimental chambers - treating cover glasses</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stackreg</td>
			<td>Biomedical Imaging Group</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td>
			<td>plugin for registering time series data to remove drift</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Turboreg</td>
			<td>Biomedical Imaging Group</td>
			<td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td>
			<td>plugin for registering time series data to remove drift</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

self-assembly of microtubule tactoids

Hücre iskeleti, değişiklikleri yönlendirecek bir yönetici olmadan, hücre içindeki büyük iç organizasyondan ve yeniden yapılanmadan sorumludur. Bu, özellikle mikrotübüllerin hücre bölünmesi sırasında mili oluşturduğu mitoz veya mayoz sırasında geçerlidir. İş mili, hücre bölünmesi sırasında genetik materyali ayırmak için kullanılan makinedir. In vitro olarak kendi kendini organize eden iğler oluşturmaya doğru, yakın zamanda mikrotübülleri, minimum mikrotübül ile ilişkili protein seti ve kalabalıklaştırıcı ajanlarla iğ benzeri montajlara dönüştürmek için bir teknik geliştirdik. Spesifik olarak, bitkilerden bir antiparalel mikrotübül çapraz bağlayıcısı, mayadan Ase1 homologu ve memeli organizmalardan PRC1 olan MAP65 kullanılmıştır. Bu çapraz bağlayıcı, mikrotübülleri uzun, ince, iğ benzeri mikrotübül kendi kendini organize eden montajlar halinde kendi kendine organize eder. Bu düzenekler ayrıca sıvı kristal taktoidlere benzer ve mikrotübüller mezojenler olarak kullanılabilir. Burada, bu mikrotübül taktoidlerini oluşturmak ve ayrıca floresan mikroskobu kullanarak montajların şeklini ve fotobeyazlatma sonrası floresan geri kazanımı kullanarak bileşenlerin hareketliliğini karakterize etmek için protokoller sunulmaktadır.

Sadece az sayıda bileşen, tübülin dimerleri ve mikrotübül çapraz bağlayıcıları ile mikrotübül taktoidleri oluşabilir (Şekil 2A). Bu protokol, bir inkübatörde mikrotübülleri çekirdeklendirmek ve büyütmek için inkübasyonu tanımlasa da, çekirdeklenme ve büyüme doğrudan mikroskop altında (30 dakika içinde tamamlanan) gözlemlenebilir (Şekil 2B). Tübülin konsantrasyonu 13.6 μm'de sabit tutulur ve MAP65-MT bağlanması% 10'da tutulur.
Şekil 4 başarılı verileri temsil eder. Taktoidler hem tübülin kanalında 561 nm lazer hem de MAP65 kanalında 488 nm lazer ile görülebilmelidir ve bu da birbirleriyle mükemmel bir şekilde örtüşmektedir (Şekil 4A). Sistemin bir gizemi, taktoidlerin genişliğinin, mikrotübül uzunluklarını, MAP65 konsantrasyonunu ve kalabalıklaşma ajanlarını değiştirmek de dahil olmak üzere çeşitli deneysel değişiklikler altında değişmediğidir (Şekil 4B) 22,28. Uzunluk çok daha değişkendir ve hem mikrotübül uzunluklarına hem de MAP65 konsantrasyonuna bağlıdır (Şekil 4B)22,28.
FRAP yapılırken, MAP65 sinyalinin iyileştiği, ancak mikrotübül sinyalinin iyileşmediği gözlenmiştir (Şekil 5). FRAP'taki iyileşme, etiketli ve fotobeyazlatılmış nesnelerin hareketliliği ve hareketinden kaynaklanmaktadır. MAP65 durumunda, kararmış moleküller ayrışır ve mikrotübülden uzaklaşır ve yenileri bölgeye taşınır (Şekil 5). MAP65 bağlanması dengededir, bu nedenle bağlanma ve bağlanmama oranı eşittir (saniyede molekül cinsinden ölçülür). Mikrotübüller için, mikrotübüllerin taktoidi terk edemediğini ima eden bir iyileşme görülmemiştir (Şekil 5A, Bi, C). Ayrıca, karanlık bölgenin yayılması görülmedi, bu da mikrotübüllerin lokal olarak hareketsiz olduğunu ve dokunaç şekli içinde bir sıvı olmadığını düşündürdü.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg"> Resim 1: Farklı iş mili oluşum modelleri. Mitotik bir iğ, hücre bölünmesi sırasında kromozomları iki yeni yavru hücreye hizalayan ve ayıran mikrotübüllerden ve bunlarla ilişkili proteinlerden ve enzimlerden yapılmış bir makinedir. (A) Hollanda'dan ince iplikli erken bir Orta Çağ damla mili kopyasının görüntüsü. Bu rakam Peter van der Sluijs30 tarafından Wikimedia görüntüsünden değiştirilmiştir. (B) Vahşi tip mayoz II'nin farklı aşamalarında mikrotübüllerin üç boyutlu rekonstrüksiyonu. Mikrotübüller yeşil renkte, kromozomlar gri renkte gösterilir. Ölçek çubuğu = 1 μm. Bu rakam Lantzsch ve ark.31'den değiştirilmiştir. (C) Bölünen bir Sf9 hücresinin mitotik bir milindeki mikrotübüllerin mikroskopi görüntüsü. İş mili kutupları ve iş milinin mikrotübülleri yeşil bir floresan proteini ile etiketlenmiştir. Ölçek çubuğu = 5 μm. Bu rakam Advani ve ark.32'den değiştirilmiştir. (D) Mitotik ve mayotik iğ mikrotübüllerinin nasıl organize edildiğine dair farklı modeller. (i) Daha önce Xenopus yumurta ekstraktlarından oluşturulan mayotik iğler için gözlemlenen mikrotübüllerin (yeşil) iş mili boyunca kısa ve dinamik olduğu sonucuna varılmıştır. Bu, sıvı kristal içindeki bipolar taktoid organizasyona benzer. (ii) Mitotik bir iğ içindeki mikrotübül organizasyonu için kanonik modelin iki tür mikrotübül vardır: kromozomların etrafındaki orta bölgede çapraz bağlanan polarlar arası veya polar mikrotübüller (koyu yeşil) ve kromozomları itmek ve çekmek için kutuptan kinetochore'a paketlenen ve uzatılan kinetochore mikrotübülleri (açık yeşil). Tüm görüntülerde, kromozomlar şeffaf mavi renkte gösterilir ve iğ kutupları koyu yeşil renkte temsil edilir. (E) (i) bipolar ve (ii) homojen taktoidler için sıvı kristal taktoiddeki mezojenlerin (yeşil çizgiler) şemaları. Bipolar taktoidlerin taktoidin sonunda iki kutbu vardır ve mezojenler bu kutuplara işaret etmek için yeniden yönlendirilir. Homojen taktoidlerin sonsuzlukta kutupları vardır ve mezojenler taktoidin uzunluğu boyunca oryantasyon değiştirmez. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg"> Şekil 2: Mikrotübül yoğuşması . (A) Mikrotübüller, iyonik türler, kalabalıklaşma ajanlarının neden olduğu tükenme kuvvetleri ve MAP65 gibi spesifik mikrotübül çapraz bağlayıcıları dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle paketlenebilir ve çapraz bağlanabilir. (i) Tübülin dimerleri ve MAP65 proteinleri, mikrotübülleri çekirdeklendirmek ve büyütmek için karıştırılır. (ii) Mikrotübüller tübülinden çekirdeklenir ve büyür ve MAP65 derhal mikrotübüllere, başka bir MAP65 monomerine veya her ikisine de bağlanır ve demetlenmeye neden olur. (iii) Çapraz bağlı demetlerdeki mikrotübüller çekirdeklenir ve büyür. (iv) Son konfigürasyon, bir iğe benzer bir mikrotübül taktoididir. (B) 105 dakikadan fazla çekirdeklenen ve büyüyen mikrotübül taktoidlerinin zaman serisi. Ölçek çubuğu = 5 μm. Şekil Edozie et al.22'den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg"> Resim 3: Akış odası tertibatı. Akış odası, bir cam slayt, silanized kapak camı ve kalıcı çift taraflı bant kullanılarak yapılır. Sarı vurgulanan bölge, numunenin aktığı ve gözlemlendiği akış yoludur. Akış odasının hacmi ~ 20 μL'dir. Epoksi, numunenin birkaç saat boyunca uzun süreli görüntüleme sırasında buharlaşmasını önlemek için odanın uçlarını kapatmak için kullanıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg"> Şekil 4: Dokunsal görüntüler ile uzunluk ve genişlik analizi. (A) (i) 561 nm lazer kullanarak rodamin etiketli tübüleni görüntüleyen mikrotübül kanalı görüntüleme, (ii) GFP-MAP65 kanalı GFP'yi 488 nm lazer kullanarak görüntüleme ve (iii) mikrotübül kanalından (macenta) ve GFP-MAP65 kanalından (camgöbeği) birleştirilmiş bindirme görüntüsünü gösteren dönen disk konfokal kullanılarak tanımlandığı ve görüntülendiği gibi oluşturulan taktoidlerin örnek verileri. Örtüşen bölgeler beyaz olarak görüntülenir ve mikrotübüllerin ve MAP65'in tam olarak kolokalize olduğunu gösterir. Ölçek çubuğu = (A) içindeki tüm görüntüler için 10 μm. (B) Dokuntoid uzunluk ve genişliğinin ölçülmesi. (i) Etiketsiz analiz edilecek bir taktoidin görüntüsü. Ölçek çubuğu = 5 μm. (ii) Uzunluk (çizgi kapaklı düz çizgi) ve genişlik (kesikli çizgi) ölçümlerinin gösterildiği (i) ile aynı görüntü. Ölçek çubuğu = 5 μm. (iii) Genişlik, (ii)'de belirtilen dik bisektörel (kesikli çizgi) dokuntoid boyunca yoğunluk profili alınarak ölçülmüştür. Yoğunluk profili, taktoidin genliğini ve genişliğini ortaya çıkarmak için bir Gauss fonksiyonuna uyuyordu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg"> Şekil 5: Temsili FRAP verileri ve analizi. (A) (i) mikrotübül taktoidi ve (ii) GFP-MAP65'in mikroskopi zaman serisi verileri ve (iii) her iki kanalın macentadaki mikrotübüller ve camgöbeğindeki GFP-MAP65 ile örtüşen görüntüsü, 63 s zamanında fotobeyazlatılmış ve ilave 5 dakika boyunca gözlemlenmiştir. (B) (i) Niceliklendirilmiş yoğunluğu ) ağartılmış bölgedeki mikrotübül kanalı (macenta daireler) ve arka plan (koyu gri daireler) ve (ii) ağartılmış bölgedeki GFP-MAP65 kanalı (camgöbeği kareleri) ve arka plan (koyu gri kareler). (C) Veriler arka plan gürültüsü için düzeltildi ve mikrotübül kanalı (macenta daireleri) ve GFP-MAP65 kanalı (camgöbeği kareleri) için yeniden ölçeklendirildi. Mikrotübüller iyileşmez, ancak GFP-MAP65, genliği ve iyileşme zaman ölçeğini bulmak için yükselen üstel bozunmaya (koyu gri çizgi) sığar ve sığdırılabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Self-Assembly of Microtubule Tactoids at JoVE.com

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Bu makalede, bitki bazlı bir mikrotübül çapraz bağlayıcısı olan MAP65 ve kalabalıklaştırıcı ajan olarak PEG kullanılarak taktoidler şeklinde mikrotübül montajlarının oluşumu için bir protokol sunulmaktadır.

Mikrotübül taktoidlerinin kendi kendine montajı

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Bu protokol, bir anti-paralel çapraz bağlayıcı olan MAP65 kullanılarak mikrotübül taktoidlerinin kendiliğinden kendi kendine organizasyonunu sağlar. Bu sistem mikrotübül organizasyonunu ve mitotik iğler gibi biyolojik sistemleri anlamamıza yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, mikrotübüller için yüksek oranda tekrarlanabilir ve birçok laboratuvar tarafından erişilebilen iğ benzeri şekilleri yeniden oluşturabilen minimalist bir sistem olmasıdır.Bu yöntem sadece hücresel sistemler için geçerli değildir, aynı zamanda mezo ölçekli sıvı kristal çalışmaları için bir model olarak da hizmet edebilir. Tübülin hazırlamak için, önce eksi 80 santigrat derece dondurucudan bir miligram liyofilize tübülin içeren etiketsiz bir tübülin alikotunu çıkarın ve buz üzerinde tutun. Ardından, 200 mikrolitre soğuk PEM-80 ekleyin.Tüm liyofilatı çözmek için, tüpü 10 dakika boyunca buz üzerinde tutun. Daha sonra, eksi 80 santigrat derece dondurucudan 20 mikrogram liyofilize tübülin tozu içeren rodamin etiketli bir tübülin tübülin tüpü çıkarın ve buz üzerinde tutun. Daha sonra, dört mikrolitre soğuk PEM-80 ekleyin ve tüm liyofilatı çözmek için tüpü 10 dakika buz üzerinde tutun.Liyofilize tübülinler çözündükten sonra, dört mikrolitrelik rodamin etiketli tübülin çözeltisine 100 mikrolitre yeniden askıya alınmış etiketsiz tübülin çözeltisi ekleyin. Ardından, çözeltileri altı ila yedi kez çok yavaş bir şekilde borulayarak karıştırın. Kalan 100 mikrolitre etiketsiz tübülin çözeltisini saklamak için, önce çözeltiyi dondurmak için tüpü sıvı azot içine yerleştirin, ardından tüpü ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede tutun.Daha sonra, tübülin karışımını her birine 15 mikrolitre ekleyerek yedi yeni tüpe dağıtın. Tüpleri daha önce gösterildiği gibi sıvı azotta dondurun ve ileride kullanmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. Deneyleri gerçekleştirmek üzere akış odalarını monte etmek için, önce bir cam slaytı çift damıtılmış suyla temizleyin ve tüy bırakmayan bir laboratuvar mendili ile kurulayın.Ardından, slaytı önce etanol ile temizleyin, ardından çift damıtılmış su ile temizleyin. Bir akış yolu oluşturmak için, 40 ila 50 milimetre uzunluğunda çift taraflı bir bant parçası kesin. Ardından, iki ince bant şeridi oluşturmak için aralarında bölün ve iki şeridi slayta beş ila sekiz milimetre aralıklarla yerleştirin.Ardından, silanize kapak fişlerini akış yolunun üzerine yerleştirin. Ardından, sürgüyü kapatın ve kapak, bir kalemin arkasıyla bant bölgesine hafifçe bastırarak çift taraflı bant şeritlerini kaydırdı. Conta iyi yapılmışsa, bant yarı saydamdan berraklığa dönmelidir.Kenarlardaki ekstra bandı çıkarmak için, bandı bir tıraş bıçağı ile kesin ve akış odası girişinden sadece bir milimetre uzakta bırakın. Ardından, odayı uygun deneysel parametrelerle etiketleyin Dokunaç deneylerini gerçekleştirmek için, önce gerekli tüm reaktifleri buz üzerinde çözün ve çalışma sırasında buz üzerinde saklayın. Daha sonra, akış odasını, içinde hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için PEM-80'de çözünmüş 20 mikrolitre% 5 iyonik olmayan blok kopolimer yüzey aktif madde ile haznenin her iki ucunda küçük damlalarla kaplayın.Ardından, akış odasını Petri kabından yapılmış nemli bir odada ıslak, tüy bırakmayan bir laboratuvar mendili ile en az beş ila yedi dakika boyunca saklayın. Daha sonra, PEM-80, GMPPCPP, Pluronik F-127, ditiyotreitol, glikoz, polietilen glikol, daha önce yapılan tübülin karışımı ve MAP65'i GFP MAP65 ile karıştırarak beş ila altı kez pipetleyerek steril bir tüpte görselleştirmek için karıştırın. Daha sonra, tübülin-MAP karışımı tüpüne önceden karıştırılmış bir glikoz oksidaz ve katalaz çözeltisinin bir mikrolitresini ekleyin ve yedi ila sekiz kez boru çekerek tekrar karıştırın.Çözeltinin toplam hacmini ayrı odalarda kullanılmak üzere iki bölüme bölün. Bu arada, akış odasına daha önce eklenen sıvı, haznenin diğer ucunda tüy bırakmayan bir laboratuvar mendili kullanılarak kılcal hareketle uzaklaştırılmalı ve akış odasına tübülin-MAP karışımının eklenmesi sağlanmalıdır. Numune odanın içine tamamen girdikten sonra, odanın iki ucunu beş dakikalık epoksi kullanarak kapatın ve mikrotübül taktoidlerini çekirdeklendirmek ve büyütmek için yaklaşık 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede tutun.Taktoidleri floresan mikroskobu ile görüntülemek için, floresanda yeterli ışık toplamak için 60X veya daha yüksek büyütmede 1.2 veya daha fazla sayısal açıklığa sahip hedefleri kullanın. Görüntüleri ücretsiz bir metal oksit yarı iletken veya şarj bağlantılı bir cihaz kamerasıyla kaydedin. Numuneyi korumak için, 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir çevre odasında saklayın.Alternatif olarak, sıcak hava kademe ısıtıcıları ve dolaşımdaki ılık suya sahip objektif sıcaklık kontrollü yakalar da dahil olmak üzere diğer kademe ısıtıcıları bu amaçla kullanılabilir. Rodamin tübülin için doğru floresan için uygun uyarma kaynakları gerekli olduğundan, kaliteli görüntüler için numunede en az bir miliwatt güce sahip 561 nanometrelik bir lazer kullanın. Bununla birlikte, GFP MAP65 için, uyarma kaynağını 488 nanometrelik bir lazerle değiştirin.Geniş alan epifloresan mikroskobu kullanıyorsanız, 540 12.5 nanometre uyarım, 545 nanometre 12.5 nanometre kesim dikroik ve 575 nanometre uzun geçişli emisyonlu bir rodamin filtre küpü kullanın. GFP MAP için, 480 15 nanometre uyarımlı, 505 nanometre dikroik 15 nanometre kesilmiş ve 515 nanometre uzun geçişli emisyonlu bir GFP filtre küpü kullanın. Aydınlatma gücünün ve pozlama sürelerinin kameranın yoğunluk ölçeğinin doygun olmayacağı şekilde olmasını sağladıktan sonra, hem kırmızı hem de yeşil kanallarda 100'den fazla taktoid görüntülemek için farklı alanların en az 10 görüntüsünü alın ve bunları analiz için 16 bit TIFF görüntüleri olarak kaydedin.Bu protokolü kullanarak, oluşumu 30 dakika içinde tamamlanan mikrotübül taktoidleri mikroskop altında doğrudan görselleştirilebilir. Taktoidler hem tübülin kanalında 561 nanometrelik bir lazer hem de MAP65 kanalında 488 nanometrelik bir lazerle görülebilir. Görüntüler aynı zamanda birbirleriyle mükemmel bir şekilde örtüşüyor.Bu yöntemde, taktoidlerin uzunluğu ve genişliği de ölçülebilir. Bir taktoidin yoğunluk profilinin genişliğine göre değiştiği bulunmuştur. Dahası, mikrotübül taktoidlerinin hareketsiz doğası, foto-ağartmadan sonra floresan geri kazanımı veya foto-ağartmadan sonra herhangi bir floresan iyileşmesi göstermeyen FRAP deneyleri ile gösterilmiştir.Öte yandan, FRAP deneyleri, foto-ağartmadan sonra kademeli bir iyileşme ve floresan gözlenebilen MAP65'in hareketli bir doğasını ortaya çıkardı. MAP65 tarafından yapılan bu floresan geri kazanımı, genliği ve geri kazanımın zaman ölçeğini bulmak için yükselen üstel bozunmaya uygun olabilir. Dokuntoid deney kısmı 10 ila 12 dakika içinde tamamlanmalıdır, çünkü tübülin buz üzerinde hızlı bir şekilde kötüleşebilir, bu da taktoidlerin çekirdeklenmesine zarar verebilir.Farklı mikrotübül çapraz bağlama proteinleri ve çapraz bağlanan motor proteinleri, mikrotübülleri hareket ettirebilen enzimler ile gelecekteki çalışmalar, mitotik iğin kendi kendine organizasyonu hakkında yeni bilgiler ortaya çıkarmaya devam edecektir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

bir su-içinde-yağ emülsiyonu santrifüj Dev veziküller Kapsüllenen Mikrokürelerin hazırlanması

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

Crystal Structure of the N-terminal Domain of Ryanodine Receptor from Plutella xylostella

N-terminal etki alanı Ryanodine reseptör Plutella xylostella gelen kristal yapısı

Development of potent and efficient insecticides targeting insect ryanodine receptors (RyRs) has been of great interest in the area of agricultural pest ...

Cell Fractionation of U937 Cells in the Absence of High-speed Centrifugation

Yüksek hızlı Santrifüjü yokluğunda U937 hücrelerinin hücre ayırma

In this protocol we detail a method to obtain subcellular fractions of U937 cells without the use of ultracentrifugation or indiscriminate detergents. ...

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Utilization of Grafix for the Detection of Transient Interactors of Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes

Saccharomyces cerevisiae Spliceosome Subcomplexes Geçici Interactors Tespiti için Grafix kullanımı

Pre-mRNA splicing is a very dynamic process that involves many molecular rearrangements of the spliceosome subcomplexes during assembly, RNA processing, ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA'nın 1 H R1φ Gevşeme Dispersiyon Deneylerinin Numune Hazırlama ve Kurulumunun Pratik Yönleri

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

İskelet Kas Mitokondrilerinin Protein İthalat Kapasitesinin Ölçümü

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Gram-pozitif bakteriyel büyümenin küçük moleküllü bir inhibitörü olan masarimisinin sentezi

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy

Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi

Microtubules are polymers of &#945;&#946;-tubulin heterodimers that organize into distinct structures in cells. Microtubule-based architectures and ...