Name: visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

تم تمويل هذه الدراسة من قبل صندوق الابتكار CACMS (No. CI2021A03407)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82004299)، وصناديق البحوث الأساسية للمعاهد المركزية لبحوث الرفاه العام (رقم ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات في معهد الوخز بالإبر والكى ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية الصينية (الموافقة رقم 2021-04-15-1). وأجريت جميع الإجراءات وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر (مطبعة الأكاديمية الوطنية، واشنطن العاصمة، 1996). تم استخدام ثلاث...

<ol>
	<li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells,+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats.">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+extracellular+complexity+of+neuromuscular+junction+organizers.">Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).</li><li>Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+in+health+and+disease:+molecular+mechanisms+governing+synaptic+formation+and+homeostasis.">The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).</li><li>Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+distribution+of+acetylcholine+receptors+at+developing+mouse+neuromuscular+junctions.">Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions.</a> The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).</li><li>Desaki, J., Uehara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maturation+of+subneural+apparatuses+at+neuromuscular+junctions+in+postnatal+rats:+a+scanning+and+transmission+electron+microscopical+study.">Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study.</a> Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).</li><li>Marques, M., Santo Neto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuromuscular+junctions+by+confocal+fluorescence+microscopy:+individual+endplates+seen+in+whole+muscles+with+vital+intracellular+staining+of+the+nerve+terminals.">Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals.</a> Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).</li><li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+a+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+motor+endplates+and+its+adaptive+change+in+skeletal+muscle.">Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle.</a> Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Chen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+injection+of+-bungarotoxin+to+improve+the+efficiency+of+motor+endplate+labeling.">In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling.</a> Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).</li><li>Sugiura, Y., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-glia+interactions:+the+roles+of+Schwann+cells+in+neuromuscular+synapse+formation+and+function.">Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function.</a> Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).</li><li>Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisynaptic+schwann+cells+-+The+multitasking+cells+at+the+developing+neuromuscular+junctions.">Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).</li><li>Walker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+perisynaptic+Schwann+cell+and+neuromuscular+junction+research.">Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research.</a> Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).</li><li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+defects+and+breathing+disorders+in+a+new+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+endoplasmic+reticulum+stress+in+soleus+and+gastrocnemius+muscles+and+differential+response+to+UPR+pathway+in+rats.">Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats.</a> Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).</li><li>Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle+based+on+inputs+to+motoneurons+and+on+an+algorithm+for+prediction+of+the+motor+unit+force.">A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).</li><li>Marinello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuromuscular+junctions+in+mice+by+combined+confocal+and+super-resolution+microscopy.">Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).</li><li>Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+multiple+aspects+of+neurofilament+functions,+and+their+possible+contribution+to+neurodegeneration.">Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration.</a> Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).</li><li>Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+and+neurofilament+proteins+in+health+and+disease.">Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).</li><li>Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinesterases+in+tripartite+neuromuscular+synapse.">Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).</li><li>Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).</li><li>Rudolf, R., Straka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+at+vertebrate+motor+endplates:+Endocytosis,+recycling,+and+degradation.">Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation.</a> Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).</li><li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance.">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li><li>Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+guidance+of+nerve+growth+between+synaptic+sites+explains+changes+in+the+pattern+of+muscle+innervation+and+remodeling+of+synaptic+sites+following+peripheral+nerve+injuries.">Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries.</a> Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+neuromuscular+junction.">Molecular architecture of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li></ol>

لقد وصفنا التفاصيل التقنية المطلوبة لإجراء تلطيخ متعدد ناجح لشرائح العضلات واستخدام الكيمياء النسيجية المناعية الفلورية للكشف عن الخصائص المورفولوجية ل NMJ على الأقسام السميكة من عضلة المعدة الإنسية للفئران. باستخدام هذا النهج ، يمكن تحليل التفاصيل الدقيقة والارتباط المكاني ل PSCs والعنا...

كثلاثة مكونات هيكلية أساسية للوصلة العصبية العضلية (NMJ) 1،2،3،4 ، تم التحقيق على نطاق واسع في الجوانب المورفولوجية لمحطات المحور الحركي قبل المشبكي ، والغشاء ما بعد المشبكي الذي يحتوي على مستقبلات أستيل كولين النيكوتينية (AchRs) ، وخلايا شوان شبه المشبكية (PSCs). تم فحص المقاطع الرقيقة والعينات الكاملة من عضلات الهيكل العظمي باستخدام تقنيات نسيجية مختلفة ، مثل المجهر الإلكتروني 5,6 ، والمجهر البؤري7,8 ، والمجهر الضوئي 9,10. على الرغم من أن الخصائص المورفولوجية ل NMJ قد تم إثباتها من خلال هذه التقنيات من جوانب مختلفة ، على سبيل المقارنة ، لا يزال المجهر البؤري خيارا مثاليا لتصوير المورفولوجيا التفصيلية ل NMJ.
في الآونة الأخيرة ، تم تطوير العديد من التقنيات الجديدة لإظهار المكونات الهيكلية ل NMJ. على سبيل المثال ، تم استخدام الفئران الفلورية المعدلة وراثيا الخاصة بك 1-YFP مباشرة لمراقبة محاور المحرك ولوحات نهاية المحرك في الجسم الحي وفي المختبر10,11. بالإضافة إلى ذلك ، تم تطبيق الحقن الوريدي للفلورسنت α-BTX للكشف عن التوزيع المكاني للوحات نهاية المحرك في العضلات الهيكلية الكاملة للفئران الفلورية من النوع البري والمعدلة وراثيا ، باستخدام علاج إزالة الأنسجة البصرية للفحص باستخدام المجهر الضوئي 9,12. ومع ذلك ، إلى جانب العناصر قبل وبعد المشبكية التي يمكن عرضها بواسطة هذه الأساليب المتقدمة ، لا يمكن إثبات PSCs في نفس الوقت.
تشير الأدلة المتراكمة إلى أن PSCs ، باعتبارها الخلايا الدبقية الطرفية ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالأطراف ما قبل المشبكية التي تساهم في تطوير واستقرار NMJ ، وتعديل النشاط المشبكي ل NMJ في ظل الحالة الفسيولوجية ، وتجديد NMJ بعد إصابة الأعصاب13,14,15 . بالنظر إلى البنية الخلوية ل NMJ ، يعد هذا البروتوكول مرشحا مناسبا لتسمية PSCs في وقت واحد ، والعناصر قبل وبعد المشبكي ، ومن المحتمل أن يستخدم لتقييم سلامة ومرونة NMJ في ظل الظروف الطبيعية والمرضية. على سبيل المثال ، قارن شدة NMJ ، ومورفولوجيا وحجم الألواح الطرفية الحركية بعد المشبكي ، وتعصيب وإزالة NMJ ، وعدد PSCs في عضلات الحالة الفسيولوجية والمرضية.
العضلة المعدية هي أكبر عضلة تشكل الانتفاخ في ربلة الساق ، والتي يتم تشريحها بسهولة عن طريق إزالة الجلد وعضلة عظم الفخذ ذات الرأسين من الطرف. غالبا ما يتم اختيار العضلات لتقييم ضمور العضلات ، والتنكس العصبي العضلي ، وأداء العضلات ، وقوة الوحدة الحركية خارج الجسم الحي أو في الجسم الحي16،17،18. ومع ذلك ، فإن هذه التقنية مناسبة أيضا للكشف عن الخصائص المورفولوجية ل NMJ من مختلف العضلات الهيكلية. في الوقت نفسه ، يمكن أن تكشف أقسام العضلات السميكة عن مورفولوجيا وكمية أكثر اكتمالا من NMJ مقارنة بالأقسام الرقيقة 7,8 وألياف العضلات الضايقة19.
تمشيا مع هذه الدراسات ، تم اختيار عضلة gastrocnemius الإنسية للفئران كنسيج مستهدف في هذه الدراسة وتم تقطيعها بسماكة 80 ميكرومتر لتلطيخ الفلورسنت المتعدد بأنواع مختلفة من المؤشرات الحيوية وفقا للمكونات الهيكلية ل NMJ. هنا ، تم استخدام الخيوط العصبية 200 (NF200) 20,21 ، ناقل الأسيتيل كولين الحويصلي (VAChT)22 ، ألفا بونغاروتوكسين (α-BTX) 23,24 ، و S100 25,26 لتسمية الألياف العصبية ، والمحطات الطرفية قبل المشبكية ، و AchRs بعد المشبكية ، و PSCs على التوالي. بالإضافة إلى ذلك ، تم مواجهة خلفية الأنسجة العضلية والنوى الخلوية بشكل أكبر مع phalloidin و DAPI.
في هذه الدراسة ، نتوقع تطوير بروتوكول مكرر لتلطيخ البنية الخلوية ل NMJ في وقت واحد مع المؤشرات الحيوية المقابلة لها على عينات ثابتة أكثر سمكا ، وهو أكثر ملاءمة للاستخدام في الفحص المجهري البؤري ويساعد على الحصول على مزيد من المعلومات حول البنية التفصيلية ل PSCs ، والعناصر قبل وبعد المشبكي ، وكذلك ارتباطها المكاني ببعضها البعض. من منظور المنهجية ، قد يفيد هذا البروتوكول في تقييم الخصائص المورفولوجية ل NMJ في ظل الظروف الطبيعية والمرضية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>149973 (703-545-155)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Neg-50</td>
			<td>Colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>10212450C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4680</td>
			<td>Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd</td>
			<td>H37022750</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P804536</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin AF350</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision peristaltic pump</td>
			<td>Longer</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100-&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52642</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dbasic dodecahydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818118</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S817463</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818046</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4951PLUS-001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vesicular Acetylcholine Transporter</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>ANB100</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin AF647 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B35450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle

الوصلة العصبية العضلية (NMJ) هي بنية معقدة تعمل على توصيل الإشارة من الخلية العصبية الحركية إلى العضلات الهيكلية وتتكون من ثلاثة مكونات نسيجية أساسية: أطراف المحور العصبي الحركي قبل المشبكي ، ومستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية بعد المشبكي (AchRs) ، وخلايا شوان شبه المشبكية (PSCs). من أجل إثبات الخصائص المورفولوجية ل NMJ ، تم اختيار عضلة gastrocnemius الإنسية للفئران كنسيج مستهدف وفحصها باستخدام تلطيخ فلورسنت متعدد مع أنواع مختلفة من المؤشرات الحيوية ، بما في ذلك الخيوط العصبية 200 (NF200) وناقل الأسيتيل كولين الحويصلي (VAChT) للألياف العصبية الحركية ومحطاتها قبل المشبكية ، ألفا بونغاروتوكسين (α-BTX) ل AchRs النيكوتينية بعد المشبكية ، و S100 ل PSCs. في هذه الدراسة ، تم إجراء التلطيخ في مجموعتين: في المجموعة الأولى ، تم تلطيخ العينات ب NF200 و VAChT و α-BTX ، وفي المجموعة الثانية ، تم تلطيخ العينات ب NF200 و α-BTX و S100. وقد تبين أن كلا البروتوكولين يمكن أن يظهرا بفعالية الهيكل التفصيلي لل NMJ. باستخدام المجهر البؤري ، شوهدت الخصائص المورفولوجية للمحطات الطرفية ما قبل المشبكي ، والمستقبلات ما بعد المشبكي ، و PSC ، وتم إعادة بناء صور مكدسات Z الخاصة بهم في نمط ثلاثي الأبعاد لمواصلة تحليل الارتباط المكاني بين العلامات المختلفة. من منظور المنهجية ، توفر هذه البروتوكولات مرجعا قيما للتحقيق في الخصائص المورفولوجية ل NMJ في ظل الظروف الفسيولوجية ، والتي قد تكون مناسبة أيضا لتقييم التغيير المرضي ل NMJ ، مثل إصابة الأعصاب الطرفية وتجديدها.

بعد تلطيخ الفلورسنت المتعدد ، تم عرض العلامات المقابلة بشكل منظم على الأقسام التي يبلغ سمكها 80 ميكرومتر من عضلة المعدة الإنسية للفئران مع ألياف عصبية إيجابية NF200 ، وأطراف ما قبل المشبك إيجابية VAChT ، و AchRs إيجابية α BTX ، و PSCs إيجابية S100 ، وألياف عضلية إيجابية الفيلويدين ، ونوى خلوية تحمل علام?...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

يوضح البروتوكول طريقة لفحص الارتباط المكاني بين المحطات الطرفية قبل المشبكي ، والمستقبلات ما بعد المشبكي ، وخلايا شوان شبه المشبكية في عضلة المعدة الإنسية للفئران باستخدام الكيمياء النسيجية المناعية الفلورية مع مؤشرات حيوية مختلفة ، وهي الخيوط العصبية 200 ، ناقل الأسيتيل كولين الحويصلي ، ألفا بونغاروتوكسين ، و S100.

تصور الخصائص المورفولوجية للوصلة العصبية العضلية في عضلة الجرذ الإنسية المعدية

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم سلامة ومرونة التقاطع العصبي العضلي في ظل الظروف الطبيعية والمرضية. هذه التقنية هي تسمية خلايا شوان المختبر قبل وبعد في وقت واحد على أقسام العضلات المفردة. بعد القتل الرحيم للفئران الذكور البالغة ، ضع الفئران في غطاء المحرك وافتح التجويف الصدري للوصول إلى القلب باستخدام المقص والملقط.أدخل قسطرة وريدية من البطين القلبي الأيسر باتجاه الشريان الأورطي واقطع أوراكل الأيمن. بعد ذلك ، ابدأ التروية ب 100 ملليلتر من محلول ملحي طبيعي بنسبة 0.9٪ حتى يصبح الدم الخارج من أوراكل الأيمن واضحا. ثم استمر في التعمق مع 250 إلى 300 ملليلتر من 4٪ بارافورمالديهايد في 0.1 مخزن مؤقت للفوسفات المولي أو PB pH 7.4 لمدة 10 دقائق.بعد التروية ، قم بإزالة جلد الطرف الخلفي الثنائي باستخدام شفرة جراحية وفضح العصب الوركي الثنائي وعضلة المعدة الإنسية. تشريح عضلة المعدة الإنسية الثنائية بعناية من الطرف الخلفي باستخدام شفرة وتثبيت العضلة بأكملها في 10 ملليلتر من 4٪ بارافورمالديهايد. بعد ساعتين ، قم بإزالة العضلات من المحلول وقم بحمايتها بالتبريد في 10 ملليلتر من 25٪ من السكروز في 0.1 PB مولاري لمدة يوم واحد عند أربع درجات مئوية.بمجرد غمر الأنسجة العضلية في محلول السكروز ، قم بتثبيته على مرحلة التجميد لنظام microtome المنزلق باستخدام وسط مقطع مجمد. قم بتقطيع العضلة أفقيا على طول المحور الطويل للعضلة بسماكة 80 ميكرون. باستخدام فرشاة ، ضع سبعة أقسام تبريد لكل بئر بطريقة منظمة في لوحة زراعة ستة آبار مع 10 ملليلتر من 0.1 PB المولي. لتلطيخ الفلورسنت ، احتضن أربعة أقسام لكل بئر مع 1.5 ملليلتر من 0.1 PB المولي الذي يحتوي على 75 ميكرولتر من 10٪ Triton X 100 و 45 ميكرولتر من مصل الحمير العادي على شاكر مداري عند 20 دورة في الدقيقة.بعد 30 دقيقة ، انقل الأقسام إلى 1.5 ملليلتر من محلول مختلط من الأجسام المضادة الأولية التي تحتوي على خيوط أرنب مضادة للأعصاب 200 ، ونقل أستيل كولين مضاد للحويصلات في 0.1 مللي بايت ، في مصل الحمير الطبيعي بنسبة 1٪ ، و 0.5٪ Triton X 100 واحتضان بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل الأقسام ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها في 0.1 PB مولية في الاهتزاز المداري عند 20 دورة في الدقيقة. بعد الغسيل الأخير ، احتضن القسم في محلول مختلط من الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على الحمار المضاد للأرانب AF 488 والحمار المضاد للماعز AF 546 ، بالإضافة إلى المؤشرات الحيوية لتوكسين ألفا بونغارو AF 647 و phalloidin 350 التي تحتوي على 0.1 M PB تحتوي على 1٪ مصل الحمير العادي و 0.5 Triton x 100 لمدة ساعة واحدة ، حمايتهم من الضوء.بعد الحضانة ، اغسل الأقسام في PB وقم بتركيبها على شريحة مجهرية. ضع زجاج الغطاء على القسم باستخدام 50٪ من الجلسرين في الماء المقطر. راقب العينة وصورها باستخدام نظام تصوير بؤري مخدع مجهز بعدسة ذاتية 20 × مع فتحة رقمية 0.75 وعدسة 40 × بفتحة عددية تبلغ 0.95.بالنسبة للتصوير الفلوري المتعدد ، قم بتعيين الأطوال الموجية للإثارة والانبعاثات لكل علامة حيوية كما هو موضح في مخطوطة النص. اضبط دقة التقاط الصور على 640 × 640 بكسل. بعد ذلك ، قم بتعيين المستوى البؤري للبداية والنهاية.اضبط حجم الخطوة على ميكرون واحد أو ميكرون. ثم اختر نمط العمق والتقاط الصور وسلسلة Z. بالنسبة لصور التكبير الأقل عند 20 X، التقط صور مكدسة بحجم 40 Z بحجم خطوتين ميكرون باستخدام ثقب 105 ميكرون.اختر وضع الإسقاط أو الطبوغرافيا وإسقاط الكثافة على محور Z لدمج جميع الصور في تركيز بؤري واحد. للحصول على صور تكبير أعلى بمعدل 40 X، يمكنك التقاط صور مكدسة بحجم 80 Z بحجم خطوة ميكرون واحد مع ضبط التكبير/التصغير على اثنين وثقب 105 ميكرون. دمج جميع الصور في تركيز بؤري واحد.أعد بناء الصور في النمط ثلاثي الأبعاد باستخدام نظام معالجة الصور. يتم توضيح العلاقة المكانية التمثيلية لعضلة المعدة الإنسية مع الخيوط العصبية 200 الألياف العصبية الإيجابية ، وناقل الأسيتيل كولين الحويصلي الإيجابي قبل المشبكي ، ومستقبلات الأسيتيل كولين الإيجابية لسموم ألفا بونغارو الإيجابية بعد المشبكي ، وخلايا شوان الإيجابية حول المشبكي S100 ، والألياف العضلية الإيجابية الفيلويدين ، والنوى الخلوية المسماة DAPI هنا. تم تشغيل الخيوط العصبية 200 من الألياف العصبية الإيجابية في حزمة.أعطت هذه الألياف العصبية فروعا لمحطات الأسيتيل كولين الحويصلية الناقلة الإيجابية قبل المشبكي ، والتي شكلت علاقة مرآة مع مستقبلات الأستيل كولين الإيجابية لسم ألفا بونغارو بعد المشبكي. بالإضافة إلى ذلك ، تم الكشف عن خلايا شوان الإيجابية حول المشبكية S100 حول الخيوط العصبية 200 الألياف العصبية الإيجابية بالقرب من المحطات الطرفية قبل المشبكي. تم عرض الارتباط المكاني بشكل أكبر في نمط ثلاثي الأبعاد يوضح الخصائص المورفولوجية التفصيلية للتقاطع العصبي العضلي من وجهات نظر مختلفة.من أجل مراقبة المزيد من التصوير في الأقسام العضلية ، من الأهمية بمكان تقطيع العضلات أفقيا على طول المحور الطويل بسماكة 80 ميكرون.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

صور متتابعة تبيض لتحديد خلايا شوان واحدة عند تقاطع الاعصاب

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

تشريح العضلات Abdominis المستعرض لتحليل تقاطع العصبية والعضلية جبل كامل

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

الكشف عن<em&gt; في الموقع</em&gt; مجمعات البروتين البروتين في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقية الموصل العصبي العضلي عن طريق القرب ربط الفحص

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

على الموصل العصبي العضلي: قياس المشبك الحجم، التغييرات تجزئة ومتشابك الكثافة البروتين عن طريق متحد البؤر مضان المجهر

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

لماذا الكمي المسائل: توصيف الظواهر في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; اليرقات عصبي عضلي مفرق

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

تحميل صبغ الكالسيوم إلى نهايات العصب الضفدع من خلال الجذع العصبي: تسجيل الكالسيوم العابر في الضفدع العصبي العضلي تقاطع

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

قياس الأداء الوظيفي الوصلات العصبية العضلية

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

تسجيلات ماكروباتش المحورية للتيارات متشابك من الوصلات العصبية العضلية اليرقات المورفولوجية

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

دورات استعادة سرعة العضلات لفحص خصائص غشاء العضلات

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...