Name: visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Denne undersøgelse blev finansieret af CACMS Innovation Fund (nr. CI2021A03407), National Natural Science Foundation of China (nr. 82004299) og grundforskningsmidlerne til de centrale offentlige velfærdsforskningsinstitutter (nr. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité for Institut for Akupunktur og Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (godkendelse nr. 2021-04-15-1). Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for pleje og brug af forsøgsdyr (National Academy Press, Washington, DC, 1996). Tre voksne hanrotter (Sprague-Dawley, vægt 230 ± 15 g) blev brugt. Rotterne blev opstaldet i en 12 timers lys/mørk cyklus med kontrolleret temperatur og fugtighed og med fri adgang...

<ol>
	<li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells,+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats.">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+extracellular+complexity+of+neuromuscular+junction+organizers.">Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).</li><li>Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+in+health+and+disease:+molecular+mechanisms+governing+synaptic+formation+and+homeostasis.">The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).</li><li>Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+distribution+of+acetylcholine+receptors+at+developing+mouse+neuromuscular+junctions.">Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions.</a> The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).</li><li>Desaki, J., Uehara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maturation+of+subneural+apparatuses+at+neuromuscular+junctions+in+postnatal+rats:+a+scanning+and+transmission+electron+microscopical+study.">Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study.</a> Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).</li><li>Marques, M., Santo Neto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuromuscular+junctions+by+confocal+fluorescence+microscopy:+individual+endplates+seen+in+whole+muscles+with+vital+intracellular+staining+of+the+nerve+terminals.">Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals.</a> Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).</li><li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+a+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+motor+endplates+and+its+adaptive+change+in+skeletal+muscle.">Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle.</a> Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Chen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+injection+of+-bungarotoxin+to+improve+the+efficiency+of+motor+endplate+labeling.">In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling.</a> Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).</li><li>Sugiura, Y., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-glia+interactions:+the+roles+of+Schwann+cells+in+neuromuscular+synapse+formation+and+function.">Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function.</a> Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).</li><li>Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisynaptic+schwann+cells+-+The+multitasking+cells+at+the+developing+neuromuscular+junctions.">Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).</li><li>Walker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+perisynaptic+Schwann+cell+and+neuromuscular+junction+research.">Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research.</a> Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).</li><li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+defects+and+breathing+disorders+in+a+new+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+endoplasmic+reticulum+stress+in+soleus+and+gastrocnemius+muscles+and+differential+response+to+UPR+pathway+in+rats.">Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats.</a> Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).</li><li>Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle+based+on+inputs+to+motoneurons+and+on+an+algorithm+for+prediction+of+the+motor+unit+force.">A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).</li><li>Marinello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuromuscular+junctions+in+mice+by+combined+confocal+and+super-resolution+microscopy.">Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).</li><li>Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+multiple+aspects+of+neurofilament+functions,+and+their+possible+contribution+to+neurodegeneration.">Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration.</a> Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).</li><li>Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+and+neurofilament+proteins+in+health+and+disease.">Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).</li><li>Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinesterases+in+tripartite+neuromuscular+synapse.">Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).</li><li>Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).</li><li>Rudolf, R., Straka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+at+vertebrate+motor+endplates:+Endocytosis,+recycling,+and+degradation.">Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation.</a> Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).</li><li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance.">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li><li>Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+guidance+of+nerve+growth+between+synaptic+sites+explains+changes+in+the+pattern+of+muscle+innervation+and+remodeling+of+synaptic+sites+following+peripheral+nerve+injuries.">Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries.</a> Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+neuromuscular+junction.">Molecular architecture of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li></ol>

Vi har beskrevet de tekniske detaljer, der kræves for at udføre vellykket multipel farvning af muskelskiver og anvendelse af fluorescerende immunohistokemi til at afsløre NMJ's morfologiske egenskaber på de tykke sektioner af rottemediale gastrocnemiusmusklen. Ved at bruge denne tilgang kan de fine detaljer og rumlige korrelation mellem PSC'erne og præ- og postsynaptiske elementer analyseres og værdsættes under konfokal mikroskopi og yderligere rekonstrueres i et tredimensionelt mønster. Her blev forskellige slag...

Da tre væsentlige strukturelle komponenter i det neuromuskulære kryds (NMJ)1,2,3,4 er morfologiske aspekter af de præsynaptiske motoraksonterminaler, postsynaptisk membran indeholdende nikotinacetylcholinreceptorer (AchR'er) og perisynaptiske Schwann-celler (PSC'er) blevet grundigt undersøgt. Tynde sektioner og helmonterede prøver af skeletmusklerne er blevet undersøgt med forskellige histologiske teknikker, såsom elektronmikroskopi 5,6, konfokal mikroskopi 7,8 og lysarkmikroskopi 9,10. Selvom NMJ's morfologiske egenskaber er blevet demonstreret af disse teknikker fra forskellige aspekter, er konfokal mikroskopi som sammenligning stadig et ideelt valg til billeddannelse af NMJ's detaljerede morfologi.
For nylig er der udviklet mange nye teknologier til at vise de strukturelle komponenter i NMJ. For eksempel er thy1-YFP transgene fluorescerende mus blevet direkte brugt til at observere motoraksoner og motoriske endeplader in vivo og in vitro10,11. Derudover er intravenøs injektion af fluorescerende α-BTX blevet anvendt til at afsløre den rumlige fordeling af motoriske endeplader i helmonterede skeletmuskler af vildtype og transgene fluorescerende mus ved hjælp af vævsoptisk clearingbehandling til undersøgelse med lysarkmikroskopi 9,12. Ud over de præ- og postsynaptiske elementer, der kan ses ved hjælp af disse avancerede metoder, kan kvikskrankerne imidlertid ikke påvises på samme tid.
Akkumulerende beviser indikerer, at PSC'er, som de perifere gliaceller, er tæt forbundet med de præsynaptiske terminaler, der bidrager til udviklingen og stabiliteten af NMJ, modulering af NMJ's synaptiske aktivitet under den fysiologiske tilstand og regenerering af NMJ efter nerveskade 13,14,15 . I betragtning af NMJ's cellulære arkitektur er denne protokol en passende kandidat til samtidig at mærke PSC'erne, præ- og postsynaptiske elementer og bruges potentielt til at evaluere NMJ's integritet og plasticitet under normale og patologiske forhold. Sammenlign for eksempel intensiteten af NMJ, morfologi og volumen af postsynaptiske motoriske endeplader, innervering og denervation af NMJ og antal PSC'er i muskler med fysiologisk og patologisk status.
Gastrocnemiusmusklen er den største muskel, der danner bulen i læggen, som let dissekeres ved at fjerne huden og biceps femoris-musklen fra lemmen. Musklen vælges ofte til at vurdere muskelatrofi, neuromuskulær degeneration, muskelydelse og motorisk enhedskraft ex vivo eller in vivo 16,17,18. Teknikken er imidlertid også velegnet til at afsløre NMJ's morfologiske egenskaber fra forskellige skeletmuskler. Samtidig kan de tykke muskelsektioner afsløre mere komplet morfologi og mængde NMJ sammenlignet med tynde sektioner 7,8 og drillede muskelfibre19.
I overensstemmelse med disse undersøgelser blev rottemediale gastrocnemiusmuskel valgt som målvæv i denne undersøgelse og blev skåret i en tykkelse på 80 μm til multipel fluorescerende farvning med forskellige slags biomarkører i henhold til de strukturelle komponenter i NMJ. Her blev neurofilament 200 (NF200)20,21, vesikulær acetylcholintransportør (VAChT)22, alfa-bungarotoxin (α-BTX)23,24 og S10025,26 brugt til at mærke henholdsvis nervefibre, præsynaptiske terminaler, postsynaptiske AchR'er og PSC'er. Derudover blev baggrunden for muskelvæv og cellulære kerner yderligere modvirket med phalloidin og DAPI.
I denne undersøgelse forventer vi at udvikle en raffineret protokol til samtidig farvning af NMJ's cellulære arkitektur med deres tilsvarende biomarkører på tykkere faste prøver, hvilket er mere praktisk til brug i konfokal mikroskopi og hjælper med at opnå meget mere information om den detaljerede struktur af PSC'erne, præ- og postsynaptiske elementer samt deres rumlige sammenhæng med hinanden. Fra metodologisk perspektiv kan denne protokol med fordel evaluere NMJ's morfologiske egenskaber under normale og patologiske forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>149973 (703-545-155)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Neg-50</td>
			<td>Colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>10212450C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4680</td>
			<td>Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd</td>
			<td>H37022750</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P804536</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin AF350</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision peristaltic pump</td>
			<td>Longer</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100-&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52642</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dbasic dodecahydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818118</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S817463</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818046</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4951PLUS-001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vesicular Acetylcholine Transporter</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>ANB100</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin AF647 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B35450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle

Det neuromuskulære kryds (NMJ) er en kompleks struktur, der tjener til signalkommunikation fra motorneuronen til skeletmuskulaturen og består af tre væsentlige histologiske komponenter: de præsynaptiske motor axonterminaler, postsynaptiske nikotinacetylcholinreceptorer (AchR'er) og perisynaptiske Schwann-celler (PSC'er). For at demonstrere NMJ's morfologiske egenskaber blev rottemediale gastrocnemiusmuskel udvalgt som målvæv og undersøgt ved anvendelse af flere fluorescerende farvninger med forskellige slags biomarkører, herunder neurofilament 200 (NF200) og vesikulær acetylcholintransportør (VAChT) til motornervefibrene og deres præsynaptiske terminaler, alfa-bungarotoxin (α-BTX) til de postsynaptiske nikotiniske AchR'er, og S100 til kvikskrankerne. I denne undersøgelse blev farvning udført i to grupper: i den første gruppe blev prøver farvet med NF200, VAChT og α-BTX, og i den anden gruppe blev prøver farvet med NF200, α-BTX og S100. Det blev vist, at begge protokoller effektivt kan demonstrere NMJ's detaljerede struktur. Ved hjælp af det konfokale mikroskop blev morfologiske egenskaber ved de præsynaptiske terminaler, postsynaptiske receptorer og PSC set, og deres Z-stakkebilleder blev rekonstrueret i et tredimensionelt mønster for yderligere at analysere den rumlige sammenhæng mellem de forskellige mærkninger. Fra metodologisk perspektiv giver disse protokoller en værdifuld reference til undersøgelse af NMJ's morfologiske egenskaber under fysiologiske forhold, hvilket også kan være egnet til at evaluere den patologiske ændring af NMJ, såsom perifer nerveskade og regenerering.

Efter flere fluorescerende farvninger blev den tilsvarende mærkning ordnet demonstreret på de 80 μm tykke sektioner af rottemediale gastrocnemiusmuskel med NF200-positive nervefibre, VAChT-positive præsynaptiske terminaler, α-BTX-positive postsynaptiske AchR'er, S100-positive PSC'er, phalloidin-positive muskelfibre og DAPI-mærkede cellulære kerner (figur 3 og figur 4).
Det blev vist, at NF200-positive nervefibre løb i bundt og...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Protokollen viser en metode til at undersøge rumlig korrelation mellem de præsynaptiske terminaler, postsynaptiske receptorer og perisynaptiske Schwann-celler i rottemediale gastrocnemiusmuskel ved hjælp af fluorescerende immunohistokemi med forskellige biomarkører, nemlig neurofilament 200, vesikulær acetylcholintransportør, alfa-bungarotoxin og S100.

Visualisering af de morfologiske egenskaber ved neuromuskulært kryds i rotte medial gastrocnemius muskel

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

Denne protokol kan bruges til at evaluere integritet og plasticitet af et neuromuskulært kryds under normale og patologiske forhold. Denne teknik er en til samtidig at mærke Schwann-cellerne og præ- og postlaboratoriedyrene på enkeltmuskelsektioner. Efter aflivning af den voksne hanrotte skal du placere rotten i emhætten og åbne brysthulen for at få adgang til hjertet ved hjælp af saks og tang.Indsæt og intravenøst kateter fra venstre hjerte ventrikel mod aorta og skær det højre orakel. Start derefter perfusionen med 100 ml 0,9% normal saltvand, indtil blodet, der kommer ud af det højre orakel, er klart. Fortsæt derefter med at gennembløde med 250 til 300 ml 4% paraformaldehyd i 0,1 molær phosphatbuffer eller PB pH 7,4 i 10 minutter.Efter perfusion skal du fjerne huden på det bilaterale bagben ved hjælp af et kirurgisk blad og udsætte den bilaterale iskiasnerve og mediale gastrocnemius muskel. Disseker den bilaterale mediale gastrocnemius muskel omhyggeligt fra bagbenet ved hjælp af et blad og postfiks hele musklen i 10 ml 4% paraformaldehyd. Efter to timer fjernes musklen fra opløsningen og kryobeskyttes i 10 ml 25% saccharose i 0,1 molær PB i en dag ved fire grader celsius.Når muskelvævet er nedsænket i saccharoseopløsningen, fastgøres det på et frysestadium i et glidende mikrotomsystem ved hjælp af et frosset sektionsmedium. Skær musklen vandret langs muskelens lange akse i tykkelsen af 80 mikron. Brug en børste til at placere syv kryoafsnit pr. Brønd på en ordnet måde i en seks brøndkulturplade med 10 ml 0,1 molær PB. Til fluorescerende farvning inkuberes fire sektioner pr. Brønd med 1,5 ml 0,1 molær PB indeholdende 75 mikroliter 10% Triton X 100 og 45 mikroliter normalt æselserum på en orbitalryster ved 20 o / min.Efter 30 minutter overføres sektionerne til 1,5 ml af en blandet opløsning af primære antistoffer indeholdende kanin anti-neuro filament 200, ged anti-vesikulær acetylcholintransportør i 0,1 molar PB, i 1% normalt æselserum og 0,5% Triton X 100 og inkuberes natten over ved fire grader Celsius. Den næste dag vaskes sektionerne tre gange i fem minutter hver i 0,1 molar PB på i orbital shaker ved 20 o / min. Efter den sidste vask inkuberes sektionen i en blandet opløsning af sekundære antistoffer indeholdende æsel anti-kanin AF 488 og æsel anti-ged AF 546 samt biomarkørerne for alfa bungarotoksin AF 647 og phalloidin 350 indeholdende i 0,1 M PB indeholdende 1%normalt æselserum og 0,5 Triton x 100 i en time, Beskytter dem mod lys.Efter inkubation vaskes sektionerne i PB og monteres på et mikroskopglas. Påfør dækglas på sektionen ved hjælp af 50% glycerin i destilleret vand. Observere og afbilde prøven ved hjælp af et con focal imaging system udstyret med en 20 x subjektiv linse med en numerisk blænde på 0,75 og en 40 x linse med en numerisk blænde på 0,95.For multipel fluorescerende billeddannelse skal du indstille excitations- og emissionsbølgelængderne for hver biomarkør som beskrevet i tekstmanuskriptet. Indstil opløsningen af billedoptagelse til 640 x 640 pixels. Indstil derefter start- og slutfokusplanet.Indstil trinstørrelse til enten en eller to mikron. Vælg derefter dybdemønster, billedoptagelse og Z-serie. For de lavere forstørrelsesbilleder ved 20 X skal du tage 40 Z stakbilleder i to mikron trinstørrelse ved hjælp af et 105 mikron pinhole.Vælg projektion eller topografitilstand og intensitetsprojektion over Z-aksen for at integrere alle billeder i et enkelt i fokus. For de højere forstørrelsesbilleder ved 40 X skal du tage 80 Z stakbilleder i en mikron trinstørrelse med zoom indstillet til to og et 105 mikron pinhole. Integrer alle billeder i et enkelt i fokus.Rekonstruere billederne i det tredimensionelle mønster med billedbehandlingssystemet. Den repræsentative rumlige korrelation af den mediale gastrocnemius muskel med neuro filament 200 positive nervefibre, vesikulær acetylcholintransportør positiv præsynaptisk terminal, alfa bungaro toksin positive postsynaptiske acetylcholin receptorer, S100 positive perisynaptiske Schwann celler, phalloidin positive muskelfibre og DAPI mærkede cellulære kerner er demonstreret her. Neurofilament 200 positive nervefibre løb i bundt.Disse nervefibre gav grene til vesikulær acetylcholintransportør positive præsynaptiske terminaler, som dannede et spejlforhold med alfa-bungarotoksinpositive postsynaptiske acetylcholinreceptorer. Derudover blev de S100 positive perisynaptiske Schwann-celler detekteret omkring neurofilamentet 200 positive nervefibre tæt på de præsynaptiske terminaler. Den rumlige korrelation blev yderligere udstillet i et tredimensionelt mønster, der viser de detaljerede morfologiske egenskaber ved det neuromuskulære kryds fra forskellige perspektiver.For at observere mere billeddannelse i muskulære sektioner er det afgørende at skære musklen vandret langs den lange akse i en tykkelse på 80 mikron.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sekventiel fotoblegende at afgrænse Single Schwann-celler ved den neuromuskulære overgang

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissektion af Transversus Abdominis Muscle for Hele mount Neuromuskulære Junction Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Påvisning af<em&gt; In Situ</em&gt; Protein-protein-komplekser på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Neuromuskulær Junction Brug Proximity ligeringsassayet

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulære forbindelse: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og ændringer i Synaptic Protein Density Brug Konfokal Fluorescens mikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Hvorfor Kvantificering Matters: Karakterisering af fænotyper på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Neuromuskulær Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Indlæsning af et calciumfarvestof i frøens nerveender gennem nervestumpen: Kalktransient registrering i Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Måling af neuromuskulære Junction funktionalitet

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch optagelser af Synaptic strømninger fra Drosophila larve neuromuskulære Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

Muskel hastighed Recovery Cykler til at undersøge muskelmembranegenskaber

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...