Name: visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Deze studie werd gefinancierd door het CACMS Innovation Fund (Nr. CI2021A03407), National Natural Science Foundation of China (nr. 82004299) en de fundamentele onderzoeksfondsen voor de Central Public Welfare Research Institutes (nr. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

Deze studie werd goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Instituut voor Acupunctuur en Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (goedkeuring nr. 2021-04-15-1). Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Drie volwassen mannelijke ratten (Sprague-Dawley, gewicht 230 ± 15 g) werden gebruikt. De ratten werden gehuisvest in een 12 uur licht/donker cyclus met ge...

<ol>
	<li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells,+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats.">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+extracellular+complexity+of+neuromuscular+junction+organizers.">Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).</li><li>Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+in+health+and+disease:+molecular+mechanisms+governing+synaptic+formation+and+homeostasis.">The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).</li><li>Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+distribution+of+acetylcholine+receptors+at+developing+mouse+neuromuscular+junctions.">Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions.</a> The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).</li><li>Desaki, J., Uehara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maturation+of+subneural+apparatuses+at+neuromuscular+junctions+in+postnatal+rats:+a+scanning+and+transmission+electron+microscopical+study.">Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study.</a> Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).</li><li>Marques, M., Santo Neto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuromuscular+junctions+by+confocal+fluorescence+microscopy:+individual+endplates+seen+in+whole+muscles+with+vital+intracellular+staining+of+the+nerve+terminals.">Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals.</a> Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).</li><li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+a+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+motor+endplates+and+its+adaptive+change+in+skeletal+muscle.">Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle.</a> Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Chen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+injection+of+-bungarotoxin+to+improve+the+efficiency+of+motor+endplate+labeling.">In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling.</a> Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).</li><li>Sugiura, Y., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-glia+interactions:+the+roles+of+Schwann+cells+in+neuromuscular+synapse+formation+and+function.">Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function.</a> Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).</li><li>Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisynaptic+schwann+cells+-+The+multitasking+cells+at+the+developing+neuromuscular+junctions.">Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).</li><li>Walker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+perisynaptic+Schwann+cell+and+neuromuscular+junction+research.">Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research.</a> Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).</li><li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+defects+and+breathing+disorders+in+a+new+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+endoplasmic+reticulum+stress+in+soleus+and+gastrocnemius+muscles+and+differential+response+to+UPR+pathway+in+rats.">Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats.</a> Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).</li><li>Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle+based+on+inputs+to+motoneurons+and+on+an+algorithm+for+prediction+of+the+motor+unit+force.">A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).</li><li>Marinello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuromuscular+junctions+in+mice+by+combined+confocal+and+super-resolution+microscopy.">Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).</li><li>Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+multiple+aspects+of+neurofilament+functions,+and+their+possible+contribution+to+neurodegeneration.">Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration.</a> Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).</li><li>Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+and+neurofilament+proteins+in+health+and+disease.">Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).</li><li>Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinesterases+in+tripartite+neuromuscular+synapse.">Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).</li><li>Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).</li><li>Rudolf, R., Straka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+at+vertebrate+motor+endplates:+Endocytosis,+recycling,+and+degradation.">Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation.</a> Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).</li><li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance.">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li><li>Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+guidance+of+nerve+growth+between+synaptic+sites+explains+changes+in+the+pattern+of+muscle+innervation+and+remodeling+of+synaptic+sites+following+peripheral+nerve+injuries.">Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries.</a> Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+neuromuscular+junction.">Molecular architecture of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li></ol>

We hebben de technische details beschreven die nodig zijn voor het uitvoeren van succesvolle meervoudige kleuring van spierplakken en het gebruik van fluorescerende immunohistochemie voor het onthullen van de morfologische kenmerken van NMJ op de dikke delen van de mediale gastrocnemiusspier van de rat. Door deze benadering te gebruiken, kunnen de fijne details en ruimtelijke correlatie van de PSC's en pre- en post-synaptische elementen worden geanalyseerd en gewaardeerd onder confocale microscopie, en verder gereconstru...

Als drie essentiële structurele componenten van de neuromusculaire junctie (NMJ)1,2,3,4, zijn morfologische aspecten van de pre-synaptische motor axonterminals, post-synaptisch membraan met nicotine-acetylcholinereceptoren (AchR's) en peri-synaptische Schwann-cellen (PSC's) uitgebreid onderzocht. Dunne secties en hele monsters van de skeletspieren zijn onderzocht met verschillende histologische technieken, zoals elektronenmicroscopie 5,6, confocale microscopie 7,8 en lichtbladmicroscopie 9,10. Hoewel de morfologische kenmerken van NMJ door deze technieken vanuit verschillende aspecten zijn aangetoond, is confocale microscopie ter vergelijking nog steeds een ideale keuze voor beeldvorming van de gedetailleerde morfologie van NMJ.
Onlangs zijn er veel nieuwe technologieën ontwikkeld voor het tonen van de structurele componenten van NMJ. Thy1-YFP transgene fluorescerende muizen zijn bijvoorbeeld direct gebruikt om motorische axonen en motoreindplaten in vivo en in vitro10,11 te observeren. Bovendien is intraveneuze injectie van fluorescerende α-BTX toegepast om de ruimtelijke verdeling van motorische eindplaten in hele skeletspieren van wild-type en transgene fluorescerende muizen te onthullen, door gebruik te maken van weefsel optische clearingbehandeling voor onderzoek met lichtplaatmicroscopie 9,12. Naast de pre- en post-synaptische elementen die met deze geavanceerde methoden kunnen worden bekeken, kunnen de PSC's echter niet tegelijkertijd worden gedemonstreerd.
Accumulerend bewijs geeft aan dat PSC's, als de perifere gliacellen, nauw verbonden zijn met de pre-synaptische terminals die bijdragen aan de ontwikkeling en stabiliteit van NMJ, de modulatie van synaptische activiteit van de NMJ onder fysiologische toestand, en de regeneratie van de NMJ na zenuwletsel 13,14,15 . Gezien de cellulaire architectuur van NMJ, is dit protocol een goede kandidaat om tegelijkertijd de PSC's, pre- en post-synaptische elementen te labelen en wordt het mogelijk gebruikt om de integriteit en plasticiteit van de NMJ onder normale en pathologische omstandigheden te evalueren. Vergelijk bijvoorbeeld de intensiteit van NMJ, morfologie en volume van post-synaptische motoreindplaten, innervatie en denervatie van NMJ en het aantal PSC's in spieren met fysiologische en pathologische status.
De gastrocnemiusspier is de grootste spier die de uitstulping in de kuit vormt, die gemakkelijk kan worden ontleed door de huid en de biceps femoris-spier uit de ledemaat te verwijderen. De spier wordt vaak gekozen om spieratrofie, neuromusculaire degeneratie, spierprestaties en motorische eenheidskracht ex vivo of in vivote beoordelen 16,17,18. De techniek is echter ook geschikt voor het onthullen van de morfologische kenmerken van NMJ van verschillende skeletspieren. Tegelijkertijd kunnen de dikke spiersecties een completere morfologie en hoeveelheid NMJ onthullen in vergelijking met dunne secties 7,8 en geplaagde spiervezels19.
In lijn met deze studies werd de mediale gastrocnemiusspier van de rat geselecteerd als het doelweefsel in deze studie en werd gesneden met een dikte van 80 μm voor meerdere fluorescerende kleuring met verschillende soorten biomarkers volgens de structurele componenten van NMJ. Hier werden neurofilament 200 (NF200)20,21, vesiculaire acetylcholinetransporter (VAChT)22, alfa-bungarotoxine (α-BTX)23,24 en S10025,26 gebruikt om respectievelijk zenuwvezels, pre-synaptische terminals, post-synaptische AchR's en PSC's te labelen. Bovendien werd de achtergrond van spierweefsel en cellulaire kernen verder bestreden met falloïdine en DAPI.
In deze studie verwachten we een verfijnd protocol te ontwikkelen voor het gelijktijdig kleuren van de cellulaire architectuur van NMJ met hun bijbehorende biomarkers op dikkere vaste monsters, wat handiger is voor gebruik in confocale microscopie en helpt om veel meer informatie te verkrijgen over de gedetailleerde structuur van de PSC's, pre- en post-synaptische elementen, evenals hun ruimtelijke correlatie met elkaar. Vanuit het perspectief van de methodologie kan dit protocol nuttig zijn om de morfologische kenmerken van NMJ onder normale en pathologische omstandigheden te evalueren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>149973 (703-545-155)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Neg-50</td>
			<td>Colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>10212450C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4680</td>
			<td>Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd</td>
			<td>H37022750</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P804536</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin AF350</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision peristaltic pump</td>
			<td>Longer</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100-&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52642</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dbasic dodecahydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818118</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S817463</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818046</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4951PLUS-001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vesicular Acetylcholine Transporter</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>ANB100</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin AF647 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B35450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle

De neuromusculaire junctie (NMJ) is een complexe structuur die dient voor de signaalcommunicatie van het motorneuron naar de skeletspier en bestaat uit drie essentiële histologische componenten: de pre-synaptische motor axonterminals, post-synaptische nicotine-acetylcholinereceptoren (AchR's) en peri-synaptische Schwann-cellen (PSC's). Om de morfologische kenmerken van NMJ aan te tonen, werd de mediale gastrocnemiusspier van de rat geselecteerd als het doelweefsel en onderzocht met behulp van meerdere fluorescerende kleuring met verschillende soorten biomarkers, waaronder neurofilament 200 (NF200) en vesiculaire acetylcholinetransporter (VAChT) voor de motorische zenuwvezels en hun pre-synaptische terminals, alfa-bungarotoxine (α-BTX) voor de post-synaptische nicotine-AchR's, en S100 voor de PSC's. In deze studie werd kleuring uitgevoerd in twee groepen: in de eerste groep werden monsters gekleurd met NF200, VAChT en α-BTX, en in de tweede groep werden monsters gekleurd met NF200, α-BTX en S100. Er werd aangetoond dat beide protocollen de gedetailleerde structuur van NMJ effectief kunnen aantonen. Met behulp van de confocale microscoop werden morfologische kenmerken van de pre-synaptische terminals, post-synaptische receptoren en PSC gezien en hun Z-stacks-afbeeldingen werden gereconstrueerd in een driedimensionaal patroon om de ruimtelijke correlatie tussen de verschillende etiketteringen verder te analyseren. Vanuit het perspectief van de methodologie bieden deze protocollen een waardevolle referentie voor het onderzoeken van de morfologische kenmerken van NMJ onder fysiologische omstandigheden, die ook geschikt kunnen zijn om de pathologische verandering van NMJ, zoals perifeer zenuwletsel en regeneratie, te evalueren.

Na meerdere fluorescerende kleuring werd de overeenkomstige etikettering ordelijk aangetoond op de 80 μm dikke delen van de rat mediale gastrocnemius-spier met NF200-positieve zenuwvezels, VAChT-positieve pre-synaptische terminals, α-BTX-positieve post-synaptische AchR's, S100-positieve PSC's, falloidine-positieve spiervezels en DAPI-gelabelde cellulaire kernen (figuur 3 en figuur 4).
Er werd aangetoond dat NF200-positieve zenuwveze...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Het protocol toont een methode om ruimtelijke correlatie tussen de pre-synaptische terminals, post-synaptische receptoren en peri-synaptische Schwann-cellen in de mediale gastrocnemius-spier van de rat te onderzoeken met behulp van fluorescerende immunohistochemie met verschillende biomarkers, namelijk neurofilament 200, vesiculaire acetylcholinetransporter, alfa-bungarotoxine en S100.

Visualisatie van de morfologische kenmerken van neuromusculaire overgang in rat mediale gastrocnemiusspier

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

Dit protocol kan worden gebruikt om de integriteit en plasticiteit van een neuromusculaire overgang onder normale en pathologische omstandigheden te evalueren. Deze techniek is om tegelijkertijd de Schwann-cellen en pre- en postlaboratoria op afzonderlijke spiersecties te labelen. Nadat u de volwassen mannelijke rat hebt geëuthanaseerd, plaatst u de rat in de kap en opent u de thoracale holte om toegang te krijgen tot het hart met behulp van een schaar en een tang.Breng een intraveneuze katheter in van de linker hartkamer naar de aorta en snijd het rechter orakel. Start vervolgens de perfusie met 100 milliliter van 0,9% normale zoutoplossing totdat het bloed dat uit het rechter orakel komt helder is. Blijf vervolgens perfuseren met 250 tot 300 milliliter 4% paraformaldehyde in 0,1 molaire fosfaatbuffer of PB pH 7,4 gedurende 10 minuten.Verwijder na perfusie de huid van de bilaterale achterpoot met behulp van een chirurgisch mes en stel de bilaterale heupzenuw en mediale gastrocnemiusspier bloot. Ontleed de bilaterale mediale gastrocnemiusspier voorzichtig uit de achterste ledemaat met behulp van een mes en postfixeer de hele spier in 10 milliliter van 4% paraformaldehyde. Verwijder na twee uur de spier uit de oplossing en cryoprotectieer deze in 10 milliliter van 25% sucrose in 0,1 molaire PB gedurende één dag bij vier graden Celsius.Zodra het spierweefsel is ondergedompeld in de sucrose-oplossing, fixeert u het op een vriesstadium van een glijdend microtoomsysteem met behulp van een bevroren sectiemedium. Snijd de spier horizontaal langs de lange as van de spier met een dikte van 80 micron. Plaats met een borstel zeven cryosecties per put op een ordelijke manier in een kweekplaat met zes putten met 10 milliliter van 0,1 kies PB. Voor fluorescerende kleuring incubeer je vier secties per put met 1,5 milliliter 0,1 molair PB met 75 microliter van 10% Triton X 100 en 45 microliter normaal ezelserum op een orbitale shaker bij 20 rpm.Breng na 30 minuten de secties over in 1,5 milliliter van een gemengde oplossing van primaire antilichamen met konijnenanti-neurofilament 200, geiten-anti-vesiculaire acetylcholinetransporter in 0,1 molair PB, in 1% normaal ezelserum en 0,5% Triton X 100 en incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Was de volgende dag de secties drie keer gedurende vijf minuten elk in 0,1 kies PB op in orbitale shaker bij 20 tpm. Incubeer na de laatste wasbeurt de sectie in een gemengde oplossing van secundaire antilichamen die ezel anti-konijn AF 488 en ezel anti-geit AF 546 bevatten, evenals de biomarkers van alfa bungaro toxine AF 647 en falloidine 350 bevattende in 0,1 M PB met 1% normaal ezelsserum en 0,5 Triton x 100 gedurende een uur, Ze beschermen tegen licht.Was na incubatie de secties in PB en monteer ze op een microscoopglaasje. Breng afdekglas aan op de sectie met 50% glycerine in gedestilleerd water. Observeer en beeld het monster af met behulp van een con focal imaging-systeem uitgerust met een 20 x subjectieve lens met een numeriek diafragma van 0,75 en een 40 x lens met een numeriek diafragma van 0,95.Voor meervoudig fluorescerende beeldvorming stelt u de excitatie- en emissiegolflengten van elke biomarker in zoals beschreven in het tekstmanuscript. Stel de resolutie van het vastleggen van afbeeldingen in op 640 bij 640 pixels. Stel vervolgens het begin- en eindfocusvlak in.Stel de stapgrootte in op één of twee micron. Kies vervolgens dieptepatroon, beeldopname en Z-serie. Voor de afbeeldingen met een lagere vergroting bij 20 X legt u 40 Z-stackafbeeldingen vast in stappen van twee micron met behulp van een gaatje van 105 micron.Kies de projectie- of topografiemodus en intensiteitsprojectie over de Z-as om alle afbeeldingen in één scherpstel te integreren. Voor de hogere vergrotingsafbeeldingen bij 40 X legt u 80 Z stack-afbeeldingen vast in één micron stapgrootte met zoom ingesteld op twee en een gaatje van 105 micron. Integreer alle afbeeldingen in één scherpstel.Reconstrueer de beelden in het driedimensionale patroon met het beeldverwerkingssysteem. De representatieve ruimtelijke correlatie van de mediale gastrocnemiusspier met neurofilament 200 positieve zenuwvezels, vesiculaire acetylcholine transporter positieve pre-synaptische terminal, alfa bungaro toxine positieve post-synaptische acetylcholine receptoren, S100 positieve perisynaptische Schwann cellen, falloidine positieve spiervezels en DAPI gelabelde cellulaire kernen worden hier gedemonstreerd. Het neurofilament 200 positieve zenuwvezels liep in bundel.Deze zenuwvezels gaven takken aan de vesiculaire acetylcholine transporter positieve presynaptische terminals, die een spiegelrelatie vormden met de alfa bungaro toxine positieve post-synaptische acetylcholine receptoren. Bovendien werden de S100-positieve perisynaptische Schwann-cellen gedetecteerd rond het neurofilament 200 positieve zenuwvezels dicht bij de pre-synaptische terminals. De ruimtelijke correlatie werd verder tentoongesteld in een driedimensionaal patroon dat de gedetailleerde morfologische kenmerken van de neuromusculaire junctie vanuit verschillende perspectieven weergeeft.Om meer beeldvorming in spiersecties te observeren, is het van cruciaal belang om de spier horizontaal langs de lange as te snijden met een dikte van 80 micron.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissectie en Imaging van Active Zones in de Drosophila Neuromusculaire Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential Photo-bleken om Single Schwann cellen afbakenen op de neuromusculaire junctie

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissectie van de Transversus Abdominis Spier voor Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detectie van<em&gt; In Situ</em&gt; Eiwit-eiwit complexen in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction Met behulp van Proximity ligatiebepaling

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

De neuromusculaire junctie: Meten Synapse Maat, Fragmentatie en Veranderingen in Synaptic Protein dichtheid met behulp van confocale fluorescentie microscopie

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Waarom kwantificering Matters: karakterisering van fenotypes bij de<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Neuromusculaire Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Een calciumkleurstofverf in de zenuwlengte van de kikker laden door de zenuwstomp: Calcium Transient Registratie in de Kikker Neuromusculaire Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Meten van de motorische eindplaat functionaliteit

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch opnames van Synaptic stromingen uit de larvale Drosophila motorische eindplaat

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

Spiersnelheid Recovery Cycli om spiermembraan eigenschappen te onderzoeken

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...