Name: visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Questo studio è stato finanziato dal CACMS Innovation Fund (No. CI2021A03407), National Natural Science Foundation of China (n. 82004299) e i fondi di ricerca fondamentale per gli istituti centrali di ricerca sul benessere pubblico (n. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustione, China Academy of Chinese Medical Sciences (approvazione n. 2021-04-15-1). Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Sono stati utilizzati tre ratti maschi adulti (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). I ratti sono stati alloggiati in un ciclo luce/buio di 12 ore con temperatura e umid...

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	<li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells,+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats.">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Guarino, S. 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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+a+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+motor+endplates+and+its+adaptive+change+in+skeletal+muscle.">Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle.</a> Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Chen, W. 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(178), e63032 (2021).</li><li>Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+multiple+aspects+of+neurofilament+functions,+and+their+possible+contribution+to+neurodegeneration.">Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration.</a> Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).</li><li>Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+and+neurofilament+proteins+in+health+and+disease.">Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).</li><li>Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinesterases+in+tripartite+neuromuscular+synapse.">Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).</li><li>Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).</li><li>Rudolf, R., Straka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+at+vertebrate+motor+endplates:+Endocytosis,+recycling,+and+degradation.">Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation.</a> Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).</li><li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance.">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li><li>Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+guidance+of+nerve+growth+between+synaptic+sites+explains+changes+in+the+pattern+of+muscle+innervation+and+remodeling+of+synaptic+sites+following+peripheral+nerve+injuries.">Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries.</a> Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+neuromuscular+junction.">Molecular architecture of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li></ol>

Abbiamo descritto i dettagli tecnici necessari per eseguire con successo la colorazione multipla di fette muscolari e l'uso di immunoistochimica fluorescente per rivelare le caratteristiche morfologiche di NMJ sulle sezioni spesse del muscolo gastrocnemio mediale di ratto. Utilizzando questo approccio, i dettagli fini e la correlazione spaziale delle PSC e degli elementi pre e post-sinaptici possono essere analizzati e apprezzati sotto microscopia confocale e ulteriormente ricostruiti in un modello tridimensionale. Qui, ...

Come tre componenti strutturali essenziali della giunzione neuromuscolare (NMJ)1,2,3,4, gli aspetti morfologici dei terminali dell'assone motorio pre-sinaptico, della membrana post-sinaptica contenente recettori nicotinici dell'acetilcolina (AchR) e delle cellule di Schwann peri-sinaptiche (PSC) sono stati ampiamente studiati. Sezioni sottili e campioni interi dei muscoli scheletrici sono stati esaminati con diverse tecniche istologiche, come la microscopia elettronica 5,6, la microscopia confocale 7,8 e la microscopia a foglio luminoso 9,10. Sebbene le caratteristiche morfologiche di NMJ siano state dimostrate da queste tecniche da diversi aspetti, come confronto, la microscopia confocale è ancora una scelta ideale per l'imaging della morfologia dettagliata di NMJ.
Recentemente, sono state sviluppate molte nuove tecnologie per mostrare i componenti strutturali di NMJ. Ad esempio, i topi fluorescenti transgenici thy1-YFP sono stati utilizzati direttamente per osservare gli assoni motori e le piastre terminali del motore in vivo e in vitro10,11. Inoltre, l'iniezione endovenosa di α-BTX fluorescente è stata applicata per rivelare la distribuzione spaziale delle piastre terminali motorie nei muscoli scheletrici a montaggio intero di topi fluorescenti wild-type e transgenici, utilizzando il trattamento di compensazione ottica dei tessuti per l'esame con microscopia a foglio luminoso 9,12. Tuttavia, a parte gli elementi pre e post-sinaptici che possono essere visualizzati con questi metodi avanzati, i PSC non possono essere dimostrati allo stesso tempo.
L'accumulo di prove indica che le PSC, come le cellule gliali periferiche, sono strettamente associate ai terminali pre-sinaptici che contribuiscono allo sviluppo e alla stabilità della NMJ, alla modulazione dell'attività sinaptica della NMJ nella condizione fisiologica e alla rigenerazione della NMJ dopo la lesione nervosa 13,14,15 . Considerando l'architettura cellulare di NMJ, questo protocollo è un candidato appropriato per etichettare contemporaneamente le PSC, gli elementi pre e post-sinaptici, ed è potenzialmente utilizzato per valutare l'integrità e la plasticità del NMJ in condizioni normali e patologiche. Ad esempio, confrontare l'intensità di NMJ, la morfologia e il volume delle placche motorie post-sinaptiche, l'innervazione e la denervazione di NMJ e il numero di PSC nei muscoli di stato fisiologico e patologico.
Il muscolo gastrocnemio è il muscolo più grande che forma il rigonfiamento nel polpaccio, che viene facilmente sezionato rimuovendo la pelle e il muscolo bicipite femorale dall'arto. Il muscolo viene spesso scelto per valutare l'atrofia muscolare, la degenerazione neuromuscolare, le prestazioni muscolari e la forza dell'unità motoria ex vivo o in vivo 16,17,18. Tuttavia, la tecnica è adatta anche per rivelare le caratteristiche morfologiche di NMJ da vari muscoli scheletrici. Allo stesso tempo, le sezioni muscolari spesse possono rivelare una morfologia e una quantità più complete di NMJ rispetto alle sezioni sottili 7,8 e alle fibre muscolari stuzzicate19.
In linea con questi studi, il muscolo gastrocnemio mediale del ratto è stato selezionato come tessuto bersaglio in questo studio ed è stato affettato ad uno spessore di 80 μm per la colorazione fluorescente multipla con vari tipi di biomarcatori in base ai componenti strutturali di NMJ. Qui, neurofilamento 200 (NF200) 20,21, trasportatore vescicolare di acetilcolina (VAChT) 22, alfa-bungarotossina (α-BTX) 23,24 e S10025,26 sono stati utilizzati per etichettare rispettivamente fibre nervose, terminali pre-sinaptici, AchR post-sinaptici e PSC. Inoltre, lo sfondo del tessuto muscolare e dei nuclei cellulari è stato ulteriormente controinziato con falloidina e DAPI.
In questo studio, ci aspettiamo di sviluppare un protocollo raffinato per colorare simultaneamente l'architettura cellulare di NMJ con i loro corrispondenti biomarcatori su campioni fissi più spessi, che è più conveniente per l'uso in microscopia confocale e aiuta a ottenere molte più informazioni sulla struttura dettagliata delle PSC, sugli elementi pre e post-sinaptici, nonché sulla loro correlazione spaziale tra loro. Dal punto di vista della metodologia, questo protocollo può trarre beneficio per valutare le caratteristiche morfologiche di NMJ in condizioni normali e patologiche.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>149973 (703-545-155)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Neg-50</td>
			<td>Colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>10212450C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4680</td>
			<td>Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd</td>
			<td>H37022750</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P804536</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin AF350</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision peristaltic pump</td>
			<td>Longer</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100-&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52642</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dbasic dodecahydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818118</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S817463</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818046</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4951PLUS-001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vesicular Acetylcholine Transporter</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>ANB100</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin AF647 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B35450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle

La giunzione neuromuscolare (NMJ) è una struttura complessa che serve per la comunicazione del segnale dal motoneurone al muscolo scheletrico ed è costituita da tre componenti istologiche essenziali: i terminali dell'assone motorio pre-sinaptico, i recettori nicotinici post-sinaptici dell'acetilcolina (AchRs) e le cellule di Schwann peri-sinaptiche (PSC). Al fine di dimostrare le caratteristiche morfologiche di NMJ, il muscolo gastrocnemio mediale del ratto è stato selezionato come tessuto bersaglio ed esaminato utilizzando colorazioni fluorescenti multiple con vari tipi di biomarcatori, tra cui neurofilamento 200 (NF200) e trasportatore vescicolare di acetilcolina (VAChT) per le fibre nervose motorie e i loro terminali pre-sinaptici, alfa-bungarotossina (α-BTX) per gli AchR nicotinici post-sinaptici, e S100 per gli sportelli unici. In questo studio, la colorazione è stata eseguita in due gruppi: nel primo gruppo, i campioni sono stati colorati con NF200, VAChT e α-BTX, e nel secondo gruppo, i campioni sono stati colorati con NF200, α-BTX e S100. È stato dimostrato che entrambi i protocolli possono dimostrare efficacemente la struttura dettagliata di NMJ. Utilizzando il microscopio confocale, sono state osservate le caratteristiche morfologiche dei terminali pre-sinaptici, dei recettori post-sinaptici e del PSC e le loro immagini Z-stacks sono state ricostruite in un modello tridimensionale per analizzare ulteriormente la correlazione spaziale tra le diverse etichette. Dal punto di vista metodologico, questi protocolli forniscono un valido riferimento per indagare le caratteristiche morfologiche della NMJ in condizioni fisiologiche, che possono essere idonee anche a valutare l'alterazione patologica della NMJ, come la lesione e la rigenerazione del nervo periferico.

Dopo una colorazione fluorescente multipla, l'etichettatura corrispondente è stata dimostrata ordinatamente sulle sezioni spesse 80 μm del muscolo gastrocnemio mediale del ratto con fibre nervose NF200-positive, terminali pre-sinaptici VAChT-positivi, AchR post-sinaptici α-BTX-positivi, PSC S100-positivi, fibre muscolari falloidine-positive e nuclei cellulari marcati CON DAPI (Figura 3 e Figura 4).
È stato dimostrato che le fibre ...

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Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Il protocollo mostra un metodo per esaminare la correlazione spaziale tra i terminali pre-sinaptici, i recettori post-sinaptici e le cellule di Schwann peri-sinaptiche nel muscolo gastrocnemio mediale del ratto utilizzando immunoistochimica fluorescente con diversi biomarcatori, vale a dire, neurofilamento 200, trasportatore vescicolare dell'acetilcolina, alfa-bungarotossina e S100.

Visualizzazione delle caratteristiche morfologiche della giunzione neuromuscolare nel muscolo gastrocnemio mediale di ratto

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

Questo protocollo può essere utilizzato per valutare l'integrità e la plasticità di una giunzione neuromuscolare in condizioni normali e patologiche. Questa tecnica è quella di etichettare contemporaneamente le cellule di Schwann e gli animali pre e post laboratorio su singole sezioni muscolari. Dopo l'eutanasia del ratto maschio adulto, posizionare il ratto nel cappuccio e aprire la cavità toracica per accedere al cuore usando forbici e pinze.Inserire e catetere endovenoso dal ventricolo cardiaco sinistro verso l'aorta e tagliare l'oracolo destro. Quindi, iniziare la perfusione con 100 millilitri di 0,9% di soluzione salina normale fino a quando il sangue che esce dall'oracolo destro è chiaro. Quindi continuare a perfondere con 250-300 millilitri di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato molare 0,1 o PB pH 7,4 per 10 minuti.Dopo la perfusione, rimuovere la pelle dell'arto posteriore bilaterale utilizzando una lama chirurgica ed esporre il nervo sciatico bilaterale e il muscolo gastrocnemio mediale. Sezionare accuratamente il muscolo gastrocnemio mediale bilaterale dall'arto posteriore usando una lama e postfiggere l'intero muscolo in 10 millilitri di paraformaldeide al 4%. Dopo due ore, rimuovere il muscolo dalla soluzione e crioproteggerlo in 10 millilitri di saccarosio al 25% in 0,1 PB molare per un giorno a quattro gradi Celsius.Una volta che il tessuto muscolare è immerso nella soluzione di saccarosio, fissarlo su uno stadio di congelamento di un sistema di microtomo scorrevole utilizzando un mezzo di sezione congelato. Affettare il muscolo orizzontalmente lungo l'asse lungo del muscolo allo spessore di 80 micron. Usando un pennello, posizionare sette sezioni criometriche per pozzetto in modo ordinato in una piastra di coltura a sei pozzetti con 10 millilitri di 0,1 PB molare. Per la colorazione fluorescente, incubare quattro sezioni per pozzetto con 1,5 millilitri di PB molare 0,1 contenenti 75 microlitri del 10% di Triton X 100 e 45 microlitri di normale siero d'asino su uno shaker orbitale a 20 giri / min.Dopo 30 minuti, trasferire le sezioni in 1,5 millilitri di una soluzione mista di anticorpi primari contenenti filamento anti-neuro di coniglio 200, trasportatore di acetilcolina anti-vescicolare di capra in 0,1 PB molare, in siero d'asino normale all'1% e 0,5% Triton X 100 e incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna in 0,1 PB molare su scuotitore orbitale a 20 giri / min. Dopo l'ultimo lavaggio, incubare la sezione in una soluzione mista di anticorpi secondari contenenti asino anti-coniglio AF 488 e asino anti-capra AF 546, nonché i biomarcatori della tossina alfa bungaro AF 647 e falloidina 350 contenenti in 0,1 M PB contenenti l'1% di siero d'asino normale e 0,5 Triton x 100 per un'ora, Proteggerli dalla luce.Dopo l'incubazione, lavare le sezioni in PB e montarle su un vetrino per microscopio. Applicare il vetro di copertura sulla sezione utilizzando il 50% di glicerina in acqua distillata. Osservare e fotografare il campione utilizzando un sistema di imaging con focale dotato di un obiettivo soggettivo 20 x con un'apertura numerica di 0,75 e un obiettivo 40 x con un'apertura numerica di 0,95.Per l'imaging fluorescente multiplo, impostare le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di ciascun biomarcatore come descritto nel manoscritto di testo. Impostare la risoluzione dell'acquisizione dell'immagine su 640 x 640 pixel. Quindi, impostare il piano focale iniziale e finale.Impostare la dimensione del passo su uno o due micron. Quindi scegli il modello di profondità, l'acquisizione dell'immagine e la serie Z. Per le immagini a basso ingrandimento a 20 X, acquisire immagini stack 40 Z in due micron step utilizzando un foro stenopeico da 105 micron.Scegli la modalità di proiezione o topografia e la proiezione di intensità sull'asse Z per integrare tutte le immagini in un'unica messa a fuoco. Per le immagini con ingrandimento più elevato a 40 X, cattura immagini stack 80 Z in un passo micron con zoom impostato su due e un foro stenopeico da 105 micron. Integra tutte le immagini in un'unica messa a fuoco.Ricostruire le immagini nel modello tridimensionale con il sistema di elaborazione delle immagini. La correlazione spaziale rappresentativa del muscolo gastrocnemio mediale con il filamento neuro 200 fibre nervose positive, il terminale pre-sinaptico positivo del trasportatore vescicolare dell'acetilcolina, il terminale pre-sinaptico positivo alla tossina alfa bungaro, i recettori dell'acetilcolina post-sinaptica positiva alla tossina alfa bungaro, le cellule di Schwann perisinaptiche S100 positive, le fibre muscolari positive alla falloidina e i nuclei cellulari marcati DAPI sono dimostrati qui. Il neurofilamento 200 fibre nervose positive correva in fascio.Queste fibre nervose hanno dato rami ai terminali presinaptici positivi del trasportatore vescicolare dell'acetilcolina, che formavano una relazione speculare con i recettori dell'acetilcolina post-sinaptica positiva della tossina alfa bungaro. Inoltre, le cellule di Schwann perisinaptiche S100 positive sono state rilevate intorno al neurofilamento 200 fibre nervose positive vicino ai terminali pre-sinaptici. La correlazione spaziale è stata ulteriormente esposta in un modello tridimensionale che mostra le caratteristiche morfologiche dettagliate della giunzione neuromuscolare da diverse prospettive.Per osservare più immagini nelle sezioni muscolari, è fondamentale tagliare il muscolo orizzontalmente lungo l'asse lungo ad uno spessore di 80 micron.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

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Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Ricerca

Neuroscienze

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Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

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Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

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