Name: visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Denne studien ble finansiert av CACMS Innovation Fund (nr. CI2021A03407), National Natural Science Foundation of China (nr. 82004299) og de grunnleggende forskningsfondene for de sentrale offentlige velferdsforskningsinstituttene (nr. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

Denne studien ble godkjent av etikkkomiteen for Institutt for akupunktur og Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (godkjenning nr. 2021-04-15-1). Alle prosedyrer ble utført i samsvar med National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, DC, 1996). Tre voksne hannrotter (Sprague-Dawley, vekt 230 ± 15 g) ble brukt. Rottene ble plassert i en 12 timers lys/mørk syklus med kontrollert temperatur og fuktighet og med fri tilgang til mat og vann. I...

<ol>
	<li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells,+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats.">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+extracellular+complexity+of+neuromuscular+junction+organizers.">Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).</li><li>Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+in+health+and+disease:+molecular+mechanisms+governing+synaptic+formation+and+homeostasis.">The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).</li><li>Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+distribution+of+acetylcholine+receptors+at+developing+mouse+neuromuscular+junctions.">Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions.</a> The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).</li><li>Desaki, J., Uehara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maturation+of+subneural+apparatuses+at+neuromuscular+junctions+in+postnatal+rats:+a+scanning+and+transmission+electron+microscopical+study.">Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study.</a> Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).</li><li>Marques, M., Santo Neto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuromuscular+junctions+by+confocal+fluorescence+microscopy:+individual+endplates+seen+in+whole+muscles+with+vital+intracellular+staining+of+the+nerve+terminals.">Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals.</a> Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).</li><li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+a+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+motor+endplates+and+its+adaptive+change+in+skeletal+muscle.">Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle.</a> Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Chen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+injection+of+-bungarotoxin+to+improve+the+efficiency+of+motor+endplate+labeling.">In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling.</a> Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).</li><li>Sugiura, Y., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-glia+interactions:+the+roles+of+Schwann+cells+in+neuromuscular+synapse+formation+and+function.">Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function.</a> Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).</li><li>Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisynaptic+schwann+cells+-+The+multitasking+cells+at+the+developing+neuromuscular+junctions.">Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).</li><li>Walker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+perisynaptic+Schwann+cell+and+neuromuscular+junction+research.">Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research.</a> Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).</li><li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+defects+and+breathing+disorders+in+a+new+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+endoplasmic+reticulum+stress+in+soleus+and+gastrocnemius+muscles+and+differential+response+to+UPR+pathway+in+rats.">Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats.</a> Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).</li><li>Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle+based+on+inputs+to+motoneurons+and+on+an+algorithm+for+prediction+of+the+motor+unit+force.">A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).</li><li>Marinello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuromuscular+junctions+in+mice+by+combined+confocal+and+super-resolution+microscopy.">Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).</li><li>Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+multiple+aspects+of+neurofilament+functions,+and+their+possible+contribution+to+neurodegeneration.">Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration.</a> Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).</li><li>Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+and+neurofilament+proteins+in+health+and+disease.">Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).</li><li>Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinesterases+in+tripartite+neuromuscular+synapse.">Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).</li><li>Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).</li><li>Rudolf, R., Straka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+at+vertebrate+motor+endplates:+Endocytosis,+recycling,+and+degradation.">Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation.</a> Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).</li><li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance.">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li><li>Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+guidance+of+nerve+growth+between+synaptic+sites+explains+changes+in+the+pattern+of+muscle+innervation+and+remodeling+of+synaptic+sites+following+peripheral+nerve+injuries.">Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries.</a> Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+neuromuscular+junction.">Molecular architecture of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li></ol>

Vi har beskrevet de tekniske detaljene som kreves for å utføre vellykket multippel farging av muskelskiver og bruk av fluorescerende immunhistokjemi for å avsløre NMJs morfologiske egenskaper på de tykke delene av rottemediale gastrocnemiusmuskelen. Ved å bruke denne tilnærmingen kan de fine detaljene og romlige korrelasjonen til PSC-ene og pre- og postsynaptiske elementer analyseres og verdsettes under konfokal mikroskopi, og videre rekonstrueres i et tredimensjonalt mønster. Her ble ulike typer biomarkører bru...

Som tre essensielle strukturelle komponenter i det nevromuskulære veikrysset (NMJ)1,2,3,4 har morfologiske aspekter ved de presynaptiske motoraksonterminalene, postsynaptisk membran som inneholder nikotin-acetylkolinreseptorer (AchRs) og perisynaptiske Schwann-celler (PSC) blitt grundig undersøkt. Tynne snitt og helmonterte prøver av skjelettmuskulaturen er undersøkt med ulike histologiske teknikker, som elektronmikroskopi 5,6, konfokalmikroskopi 7,8 og lysarkmikroskopi 9,10. Selv om de morfologiske egenskapene til NMJ har blitt demonstrert av disse teknikkene fra forskjellige aspekter, er konfokal mikroskopi som en sammenligning fortsatt et ideelt valg for avbildning av den detaljerte morfologien til NMJ.
Nylig har mange nye teknologier blitt utviklet for å vise de strukturelle komponentene i NMJ. For eksempel har thy1-YFP transgene fluorescerende mus blitt direkte brukt til å observere motoraksoner og motoriske endeplater in vivo og in vitro10,11. I tillegg har intravenøs injeksjon av fluorescerende α-BTX blitt brukt for å avsløre den romlige fordelingen av motoriske endeplater i helmonterte skjelettmus av villtype og transgene fluorescerende mus, ved å bruke vevsoptisk clearingbehandling for undersøkelse med lysarkmikroskopi 9,12. Men i tillegg til de pre- og postsynaptiske elementene som kan sees ved hjelp av disse avanserte metodene, kan ikke PSC-ene demonstreres samtidig.
Akkumulerende bevis indikerer at PSC, som perifere gliaceller, er nært forbundet med de presynaptiske terminalene som bidrar til utvikling og stabilitet av NMJ, modulering av synaptisk aktivitet av NMJ under fysiologisk tilstand, og regenerering av NMJ etter nerveskade 13,14,15 . Med tanke på NMJs cellulære arkitektur er denne protokollen en riktig kandidat til samtidig å merke PSC-ene, pre- og postsynaptiske elementer, og brukes potensielt til å evaluere NMJs integritet og plastisitet under normale og patologiske forhold. For eksempel, sammenlign intensiteten av NMJ, morfologi og volum av postsynaptiske motoriske endeplater, innervering og denervering av NMJ, og antall PSC i muskler av fysiologisk og patologisk status.
Gastrocnemiusmuskelen er den største muskelen som danner bulen i leggen, som lett dissekeres ut ved å fjerne huden og biceps femorismuskelen fra lemmen. Muskelen velges ofte for å vurdere muskelatrofi, nevromuskulær degenerasjon, muskelytelse og motorisk enhetskraft ex vivo eller in vivo 16,17,18. Teknikken er imidlertid også egnet til å avsløre nmjs morfologiske egenskaper fra ulike skjelettmuskler. Samtidig kan de tykke muskelseksjonene avsløre mer komplett morfologi og mengde NMJ sammenlignet med tynne seksjoner 7,8 og ertede muskelfibre19.
I tråd med disse studiene ble den mediale gastrocnemiusmuskelen fra rotter valgt som målvev i denne studien og ble skåret med en tykkelse på 80 μm for multippel fluorescerende farging med ulike typer biomarkører i henhold til strukturkomponentene i NMJ. Her ble nevrofilament 200 (NF200)20,21, vesikulær acetylkolintransportør (VAChT)22, alfa-bungarotoxin (α-BTX)23,24 og S10025,26 brukt til å merke nervefibre, presynaptiske terminaler, postsynaptiske AchR og PSC-er. I tillegg ble bakgrunnen til muskelvev og cellulære kjerner ytterligere motvirket med falloidin og DAPI.
I denne studien forventer vi å utvikle en raffinert protokoll for samtidig farging av NMJs cellulære arkitektur med tilhørende biomarkører på tykkere faste prøver, noe som er mer praktisk for bruk i konfokal mikroskopi og bidrar til å få mye mer informasjon om den detaljerte strukturen til PSCene, pre- og postsynaptiske elementer, samt deres romlige korrelasjon til hverandre. Fra et metodikkperspektiv kan denne protokollen ha nytte av å evaluere NMJs morfologiske egenskaper under normale og patologiske forhold.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>149973 (703-545-155)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Neg-50</td>
			<td>Colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>10212450C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4680</td>
			<td>Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd</td>
			<td>H37022750</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P804536</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin AF350</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision peristaltic pump</td>
			<td>Longer</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100-&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52642</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dbasic dodecahydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818118</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S817463</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818046</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4951PLUS-001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vesicular Acetylcholine Transporter</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>ANB100</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin AF647 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B35450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle

Det nevromuskulære krysset (NMJ) er en kompleks struktur som tjener til signalkommunikasjonen fra motorneuronet til skjelettmuskulaturen og består av tre essensielle histologiske komponenter: de presynaptiske motoraksonterminalene, postsynaptiske nikotiniske acetylkolinreseptorer (AchRs) og perisynaptiske Schwann-celler (PSC). For å demonstrere nmjs morfologiske egenskaper ble den mediale gastrocnemiusmuskelen fra rotter valgt som målvev og undersøkt ved hjelp av flere fluorescerende flekker med ulike typer biomarkører, inkludert nevrofilament 200 (NF200) og vesikulær acetylkolintransportør (VAChT) for de motoriske nervefibrene og deres presynaptiske terminaler, alfa-bungarotoxin (α-BTX) for de postsynaptiske nikotiniske AchRs, og S100 for PSC-ene. I denne studien ble farging utført i to grupper: i den første gruppen ble prøvene farget med NF200, VAChT og α-BTX, og i den andre gruppen ble prøvene farget med NF200, α-BTX og S100. Det ble vist at begge protokollene effektivt kan demonstrere den detaljerte strukturen til NMJ. Ved hjelp av konfokalmikroskopet ble morfologiske egenskaper til de presynaptiske terminalene, postsynaptiske reseptorer og PSC sett, og deres Z-stacks-bilder ble rekonstruert i et tredimensjonalt mønster for ytterligere å analysere den romlige korrelasjonen mellom de forskjellige merkingene. Fra metodikkens perspektiv gir disse protokollene en verdifull referanse for å undersøke NMJs morfologiske egenskaper under fysiologiske forhold, som også kan være egnet til å evaluere den patologiske endringen av NMJ, for eksempel perifer nerveskade og regenerering.

Etter multippel fluorescerende farging ble den tilsvarende merkingen ordnet demonstrert på de 80 μm tykke delene av rottemedial gastrocnemius-muskelen med NF200-positive nervefibre, VAChT-positive presynaptiske terminaler, α-BTX-positive postsynaptiske AchRs, S100-positive PSC, falloidin-positive muskelfibre og DAPI-merkede cellulære kjerner (figur 3 og figur 4).
Det ble vist at NF200-positive nervefibre løp i bunt og ga ut grene...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Protokollen viser en metode for å undersøke romlig korrelasjon mellom presynaptiske terminaler, postsynaptiske reseptorer og perisynaptiske Schwann-celler i rottemedial gastrocnemius-muskelen ved bruk av fluorescerende immunhistokjemi med forskjellige biomarkører, nemlig nevrofilament 200, vesikulær acetylkolintransportør, alfa-bungarotoxin og S100.

Visualisere de morfologiske egenskapene til nevromuskulært veikryss i rottemedial gastrocnemiusmuskel

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

Denne protokollen kan brukes til å evaluere integriteten og plastisiteten til et nevromuskulært veikryss under normale og patologiske forhold. Denne teknikken er en å samtidig merke Schwann-cellene og pre- og postlaboratoriedyr på enkeltmuskelseksjoner. Etter å ha avlivet den voksne hannrotten, plasser rotta i hetten og åpne brysthulen for å få tilgang til hjertet ved hjelp av saks og tang.Sett inn og intravenøst kateter fra venstre hjerteventrikkel mot aorta og kutt høyre orakel. Deretter starter perfusjonen med 100 ml 0,9% normal saltvann til blodet som kommer ut fra høyre orakel er klart. Fortsett deretter å perfuse med 250 til 300 ml 4% paraformaldehyd i 0, 1 molar fosfatbuffer eller PB pH 7, 4 i 10 minutter.Etter perfusjon, fjern huden på den bilaterale bakbenet ved hjelp av et kirurgisk blad og utsett den bilaterale isjiasnerven og mediale gastrocnemiusmuskelen. Disseker ut den bilaterale mediale gastrocnemius muskelen forsiktig fra bakbenet ved hjelp av et blad og postfikser hele muskelen i 10 milliliter 4% paraformaldehyd. Etter to timer, fjern muskelen fra løsningen og kryobeskytte den i 10 milliliter 25% sukrose i 0,1 molar PB i en dag ved fire grader celsius.Når muskelvevet er nedsenket i sukroseoppløsningen, fest det på et frysestadium i et glidende mikrotomsystem ved hjelp av et frosset seksjonsmedium. Skjær muskelen horisontalt langs muskelens lange akse med en tykkelse på 80 mikron. Bruk en børste til å plassere syv kryoseksjoner per brønn på en ordnet måte i en seks brønns kulturplate med 10 milliliter 0,1 molar PB. For fluorescerende farging, inkubere fire seksjoner per brønn med 1,5 milliliter 0,1 molar PB som inneholder 75 mikroliter på 10% Triton X 100 og 45 mikroliter av normalt eselserum på en orbital shaker ved 20 rpm.Etter 30 minutter, overfør seksjonene til 1,5 milliliter av en blandet løsning av primære antistoffer som inneholder kanin-anti-neuro filament 200, geit anti-vesikulær acetylkolintransportør i 0,1 molar PB, i 1% normalt eselserum og 0,5% Triton X 100 og inkuberes over natten ved fire grader Celsius. Neste dag vasker du seksjonene tre ganger i fem minutter hver i 0,1 molar PB på i orbital shaker ved 20 o / min. Etter siste vask inkuberes seksjonen i en blandet oppløsning av sekundære antistoffer som inneholder esel antikanin AF 488 og esel anti-geit AF 546, samt biomarkørene av alfa bungarotoksin AF 647 og phalloidin 350 som inneholder 0,1 M PB som inneholder 1% normalt eselserum og 0,5 Triton x 100 i en time, Beskytter dem mot lys.Etter inkubering, vask seksjonene i PB og monter dem på et mikroskopglass. Påfør dekselglass på seksjonen ved å bruke 50% glyserin i destillert vann. Observer og avbilde prøven ved hjelp av et con focal imaging system utstyrt med en 20 x subjektiv linse med en numerisk blenderåpning på 0,75 og en 40 x linse med en numerisk blenderåpning på 0,95.For flere fluorescerende bilder, angi eksitasjons- og emisjonsbølgelengdene til hver biomarkør som beskrevet i tekstmanuskriptet. Sett oppløsningen på bildeopptak til 640 x 640 piksler. Deretter angir du start- og sluttfokalplanet.Angi trinnstørrelse til enten én eller to mikron. Velg deretter dybdemønster, bildeopptak og Z-serie. For de lavere forstørrelsesbildene ved 20 X, ta 40 Z-stakkbilder i to mikron trinnstørrelse ved hjelp av et 105 mikron pinhole.Velg projeksjons- eller topografimodus og intensitetsprojeksjon over Z-aksen for å integrere alle bilder i ett enkelt fokus. For de høyere forstørrelsesbildene ved 40 X, ta 80 Z-stakkbilder i en mikron trinnstørrelse med zoom satt til to og et 105 mikron pinhole. Integrer alle bildene i ett enkelt fokus.Rekonstruer bildene i det tredimensjonale mønsteret med bildebehandlingssystemet. Den representative spaciale korrelasjonen mellom den mediale gastrocnemiusmuskelen med nevrofilament 200 positive nervefibre, vesikulære acetylkolintransportør positive presynaptiske terminal, alfa bungaro toksin positive postsynaptiske acetylkolinreseptorer, S100 positive perisynaptiske Schwann-celler, phalloidin-positive muskelfibre og DAPI-merkede cellulære kjerner er demonstrert her. Nevrofilamentet 200 positive nervefibre løp i bunt.Disse nervefibrene ga grener til vesikulær acetylkolintransportør positive presynaptiske terminaler, som dannet et speilforhold med alfa bungaro-toksinpositive postsynaptiske acetylkolinreseptorer. I tillegg ble S100-positive perisynaptiske Schwann-celler påvist rundt nevrofilamentet 200 positive nervefibre nær de presynaptiske terminalene. Den romlige korrelasjonen ble videre utstilt i et tredimensjonalt mønster som viser de detaljerte morfologiske egenskapene til det nevromuskulære krysset fra forskjellige perspektiver.For å observere mer avbildning i muskulære seksjoner, er det viktig å skjære muskelen horisontalt langs den lange aksen med en tykkelse på 80 mikron.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sekvensiell Foto bleking å avgrense Enkelt Schwann celler på nevromuskulær Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Disseksjon av Transversus Abdominis Muscle for hel-mount Neuromuscular Junction Analyse

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Påvisning av<em&gt; In Situ</em&gt; Protein-protein komplekser på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Nevromuskulær Junction hjelp Proximity Ligation analysen

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nevromuskulære krysset: Måling Synapse Størrelse, fragmentering og endringer i Synaptic Protein Tetthet Bruke Confocal Fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Hvorfor Kvantifisering Matters: Karakterisering av fenotyper på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve Nevromuskulær Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Laster et kalsiumfargestoff inn i froskens nerveender gjennom nervestubben: Kalsiumtransientregistrering i Frog Neuromuscular Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Måle nevromuskulær Junction funksjonalitet

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Fokal Macropatch opptak av Synaptic strøm fra Drosophila larver nevromuskulær krysset

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

Muskel hastighet recovery sykluser for å undersøke muskelmembran egenskaper

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...