Name: visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
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Este estudio fue financiado por el Fondo de Innovación del CACMS (No. CI2021A03407), La Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82004299) y los Fondos de Investigación Fundamental para los Institutos Centrales de Investigación de Bienestar Público (No. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Instituto de Acupuntura y Moxibustión, Academia China de Ciencias Médicas Chinas (aprobación No. 2021-04-15-1). Todos los procedimientos se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Se utilizaron tres ratas macho adultas (Sprague-Dawley, peso 230 ± 15 g). Las ratas fueron alojadas en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h con temperatu...

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	<li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells,+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats.">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+extracellular+complexity+of+neuromuscular+junction+organizers.">Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).</li><li>Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+in+health+and+disease:+molecular+mechanisms+governing+synaptic+formation+and+homeostasis.">The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).</li><li>Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+distribution+of+acetylcholine+receptors+at+developing+mouse+neuromuscular+junctions.">Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions.</a> The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).</li><li>Desaki, J., Uehara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maturation+of+subneural+apparatuses+at+neuromuscular+junctions+in+postnatal+rats:+a+scanning+and+transmission+electron+microscopical+study.">Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study.</a> Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).</li><li>Marques, M., Santo Neto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuromuscular+junctions+by+confocal+fluorescence+microscopy:+individual+endplates+seen+in+whole+muscles+with+vital+intracellular+staining+of+the+nerve+terminals.">Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals.</a> Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).</li><li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+a+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+motor+endplates+and+its+adaptive+change+in+skeletal+muscle.">Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle.</a> Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Chen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+injection+of+-bungarotoxin+to+improve+the+efficiency+of+motor+endplate+labeling.">In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling.</a> Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).</li><li>Sugiura, Y., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-glia+interactions:+the+roles+of+Schwann+cells+in+neuromuscular+synapse+formation+and+function.">Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function.</a> Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).</li><li>Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. 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(178), e63032 (2021).</li><li>Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+multiple+aspects+of+neurofilament+functions,+and+their+possible+contribution+to+neurodegeneration.">Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration.</a> Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).</li><li>Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+and+neurofilament+proteins+in+health+and+disease.">Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).</li><li>Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinesterases+in+tripartite+neuromuscular+synapse.">Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).</li><li>Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).</li><li>Rudolf, R., Straka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+at+vertebrate+motor+endplates:+Endocytosis,+recycling,+and+degradation.">Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation.</a> Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).</li><li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance.">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li><li>Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+guidance+of+nerve+growth+between+synaptic+sites+explains+changes+in+the+pattern+of+muscle+innervation+and+remodeling+of+synaptic+sites+following+peripheral+nerve+injuries.">Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries.</a> Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+neuromuscular+junction.">Molecular architecture of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li></ol>

Hemos descrito los detalles técnicos necesarios para realizar con éxito la tinción múltiple de cortes musculares y el uso de inmunohistoquímica fluorescente para revelar las características morfológicas de NMJ en las secciones gruesas del músculo gastrocnemio medial de rata. Mediante el uso de este enfoque, los detalles finos y la correlación espacial de las PSC y los elementos pre y postsinápticos pueden analizarse y apreciarse bajo microscopía confocal, y reconstruirse aún más en un patrón tridimensional....

Como tres componentes estructurales esenciales de la unión neuromuscular (NMJ)1,2,3,4, se han investigado ampliamente los aspectos morfológicos de los terminales axónicos motores presinápticos, la membrana postsináptica que contiene receptores nicotínicos de acetilcolina (AchR) y las células de Schwann perisinápticas (PSC). Se han examinado secciones delgadas y especímenes de montaje entero de los músculos esqueléticos con diferentes técnicas histológicas, como la microscopía electrónica 5,6, la microscopía confocal 7,8 y la microscopía de lámina de luz 9,10. Aunque las características morfológicas de NMJ han sido demostradas por estas técnicas desde diferentes aspectos, como comparación, la microscopía confocal sigue siendo una opción ideal para la obtención de imágenes de la morfología detallada de NMJ.
Recientemente, se han desarrollado muchas tecnologías nuevas para mostrar los componentes estructurales de NMJ. Por ejemplo, los ratones fluorescentes transgénicos thy1-YFP se han utilizado directamente para observar axones motores y placas finales motoras in vivo e in vitro10,11. Además, se ha aplicado la inyección intravenosa de fluorescente α-BTX para revelar la distribución espacial de las placas terminales motoras en músculos esqueléticos de montaje completo de ratones fluorescentes de tipo salvaje y transgénicos, mediante el uso de tratamiento de limpieza óptica de tejidos para su examen con microscopía de lámina de luz 9,12. Sin embargo, además de los elementos pre y postsinápticos que pueden ser vistos por estos métodos avanzados, las PSC no se pueden demostrar al mismo tiempo.
La evidencia acumulada indica que las PSC, como las células gliales periféricas, están estrechamente asociadas con los terminales presinápticos que contribuyen al desarrollo y la estabilidad de la NMJ, la modulación de la actividad sináptica de la NMJ bajo la condición fisiológica y la regeneración de la NMJ después de una lesión nerviosa 13,14,15 . Teniendo en cuenta la arquitectura celular de NMJ, este protocolo es un candidato adecuado para etiquetar simultáneamente las PSC, elementos pre y postsinápticos, y se utiliza potencialmente para evaluar la integridad y plasticidad de la NMJ en condiciones normales y patológicas. Por ejemplo, compare la intensidad de NMJ, la morfología y el volumen de las placas terminales motoras postsinápticas, la inervación y la denervación de NMJ, y el número de PSC en músculos de estado fisiológico y patológico.
El músculo gastrocnemio es el músculo más grande que forma la protuberancia en la pantorrilla, que se disecciona fácilmente mediante la eliminación de la piel y el músculo bíceps femoral de la extremidad. El músculo a menudo se elige para evaluar la atrofia muscular, la degeneración neuromuscular, el rendimiento muscular y la fuerza de la unidad motora ex vivo o in vivo 16,17,18. Sin embargo, la técnica también es adecuada para revelar las características morfológicas de NMJ de varios músculos esqueléticos. Al mismo tiempo, las secciones musculares gruesas pueden revelar una morfología y cantidad más completas de NMJ en comparación con las secciones delgadas 7,8 y las fibras muscularesburladas 19.
En línea con estos estudios, el músculo gastrocnemio medial de rata fue seleccionado como tejido diana en este estudio y se cortó en rodajas a un grosor de 80 μm para múltiples tinciones fluorescentes con varios tipos de biomarcadores de acuerdo con los componentes estructurales de NMJ. Aquí, el neurofilamento 200 (NF200)20,21, el transportador vesicular de acetilcolina (VAChT)22, la alfa-bungarotoxina (α-BTX)23,24 y el S10025,26 se utilizaron para etiquetar fibras nerviosas, terminales presinápticas, afrrómetros postsinápticos y PSC respectivamente. Además, el fondo del tejido muscular y los núcleos celulares se contrateñeron aún más con faloidina y DAPI.
En este estudio, esperamos desarrollar un protocolo refinado para teñir simultáneamente la arquitectura celular de NMJ con sus correspondientes biomarcadores en muestras fijas más gruesas, que es más conveniente para su uso en microscopía confocal y ayuda a obtener mucha más información sobre la estructura detallada de las PSC, elementos pre y postsinápticos, así como su correlación espacial entre sí. Desde la perspectiva de la metodología, este protocolo puede beneficiarse para evaluar las características morfológicas de NMJ en condiciones normales y patológicas.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>149973 (703-545-155)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Neg-50</td>
			<td>Colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>10212450C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4680</td>
			<td>Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd</td>
			<td>H37022750</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P804536</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin AF350</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision peristaltic pump</td>
			<td>Longer</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100-&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52642</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dbasic dodecahydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818118</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S817463</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818046</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4951PLUS-001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vesicular Acetylcholine Transporter</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>ANB100</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin AF647 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B35450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle

La unión neuromuscular (NMJ) es una estructura compleja que sirve para la comunicación de señales desde la neurona motora hasta el músculo esquelético y consta de tres componentes histológicos esenciales: los terminales axónicos motores presinápticos, los receptores nicotínicos de acetilcolina postsinápticos (AchR) y las células de Schwann perisinápticas (PSC). Con el fin de demostrar las características morfológicas de la NMJ, el músculo gastrocnemio medial de rata se seleccionó como tejido objetivo y se examinó mediante el uso de múltiples tinciones fluorescentes con varios tipos de biomarcadores, incluido el neurofilamento 200 (NF200) y el transportador vesicular de acetilcolina (VAChT) para las fibras nerviosas motoras y sus terminales presinápticas, alfa-bungarotoxina (α-BTX) para las AchR nicotínicas postsinápticas, y S100 para los PSC. En este estudio, la tinción se realizó en dos grupos: en el primer grupo, las muestras se tiñeron con NF200, VAChT y α-BTX, y en el segundo grupo, las muestras se tiñeron con NF200, α-BTX y S100. Se demostró que ambos protocolos pueden demostrar efectivamente la estructura detallada de NMJ. Utilizando el microscopio confocal, se observaron las características morfológicas de los terminales presinápticos, los receptores postsinápticos y el PSC, y se reconstruyeron sus imágenes de pilas Z en un patrón tridimensional para analizar más a fondo la correlación espacial entre los diferentes etiquetados. Desde la perspectiva de la metodología, estos protocolos proporcionan una referencia valiosa para investigar las características morfológicas de la NMJ en condiciones fisiológicas, que también pueden ser adecuadas para evaluar la alteración patológica de la NMJ, como la lesión y regeneración de los nervios periféricos.

Después de múltiples tinciones fluorescentes, el etiquetado correspondiente se demostró ordenadamente en las secciones de 80 μm de espesor del músculo gastrocnemio medial de rata con fibras nerviosas NF200 positivas, terminales presinápticos VAChT positivos, AchRs postsinápticas positivas α-BTX, PSC S100 positivas, fibras musculares positivas para faloidinas y núcleos celulares marcados con DAPI (Figura 3 y Figura 4).
Se demo...

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Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

El protocolo muestra un método para examinar la correlación espacial entre los terminales presinápticos, los receptores postsinápticos y las células de Schwann perisinápticas en el músculo gastrocnemio medial de la rata utilizando inmunohistoquímica fluorescente con diferentes biomarcadores, a saber, neurofilamento 200, transportador vesicular de acetilcolina, alfa-bungarotoxina y S100.

Visualización de las características morfológicas de la unión neuromuscular en el músculo gastrocnemio medial de rata

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

Este protocolo se puede utilizar para evaluar la integridad y plasticidad de una unión neuromuscular en condiciones normales y patológicas. Esta técnica consiste en etiquetar simultáneamente las células de Schwann y los animales de laboratorio pre y post en secciones musculares individuales. Después de sacrificar a la rata macho adulta, coloque la rata en la capucha y abra la cavidad torácica para acceder al corazón con tijeras y fórceps.Inserte un catéter intravenoso desde el ventrículo cardíaco izquierdo hacia la aorta y corte el oráculo derecho. A continuación, comience la perfusión con 100 mililitros de solución salina normal al 0,9% hasta que la sangre que sale del oráculo derecho esté clara. Luego continúe perfundiendo con 250 a 300 mililitros de paraformaldehído al 4% en tampón de fosfato molar 0.1 o pH PB 7.4 durante 10 minutos.Después de la perfusión, retire la piel de la extremidad posterior bilateral con una cuchilla quirúrgica y exponga el nervio ciático bilateral y el músculo gastrocnemio medial. Diseccionar el músculo gastrocnemio medial bilateral cuidadosamente de la extremidad posterior usando una cuchilla y colocar todo el músculo en 10 mililitros de paraformaldehído al 4%. Después de dos horas, retire el músculo de la solución y crioprotegalo en 10 mililitros de sacarosa al 25% en PB molar 0.1 durante un día a cuatro grados centígrados.Una vez que el tejido muscular se sumerge en la solución de sacarosa, fíjelo en una etapa de congelación de un sistema de microtomo deslizante utilizando un medio de sección congelado. Corte el músculo horizontalmente a lo largo del eje largo del músculo con un grosor de 80 micras. Usando un cepillo, coloque siete secciones criogénicas por pozo de manera ordenada en una placa de cultivo de seis pozos con 10 mililitros de PB molar 0.1. Para la tinción fluorescente, incube cuatro secciones por pozo con 1,5 mililitros de PB molar 0,1 que contengan 75 microlitros de Tritón X 100 al 10% y 45 microlitros de suero de burro normal en un agitador orbital a 20 rpm.Después de 30 minutos, transfiera las secciones a 1,5 mililitros de una solución mixta de anticuerpos primarios que contengan anti-filamento neuro de conejo 200, transportador de acetilcolina antivesicular de cabra en PB molar 0,1, en suero de burro normal al 1% y 0,5% Tritón X 100 e incube durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, lave las secciones tres veces durante cinco minutos cada una en PB molar 0.1 en agitador orbital a 20 rpm. Después del último lavado, incubar la sección en una solución mixta de anticuerpos secundarios que contengan burro anti-conejo AF 488 y burro anti-cabra AF 546, así como los biomarcadores de toxina alfa bungaro AF 647 y faloidina 350 que contiene en 0.1 M PB que contiene 1% de suero de burro normal y 0.5 Tritón x 100 durante una hora, Protegiéndolos de la luz.Después de la incubación, lave las secciones en PB y móntelas en un portaobjetos de microscopio. Aplique vidrio de cubierta en la sección con 50% de glicerina en agua destilada. Observe e imagine la muestra utilizando un sistema de imágenes focales equipado con una lente subjetiva de 20 x con una apertura numérica de 0,75 y una lente de 40 x con una apertura numérica de 0,95.Para múltiples imágenes fluorescentes, establezca las longitudes de onda de excitación y emisión de cada biomarcador como se describe en el manuscrito de texto. Establezca la resolución de captura de imagen en 640 por 640 píxeles. A continuación, establezca el plano focal inicial y final.Establezca el tamaño del paso en una o dos micras. A continuación, elija el patrón de profundidad, la captura de imágenes y la serie Z. Para las imágenes de menor aumento a 20 X, capture imágenes de pila de 40 Z en un tamaño de paso de dos micras utilizando un agujero de alfiler de 105 micras.Elija el modo de proyección o topografía y la proyección de intensidad sobre el eje Z para integrar todas las imágenes en un solo enfoque. Para las imágenes de mayor aumento a 40 X, capture imágenes de pila de 80 Z en un tamaño de paso de micra con zoom establecido en dos y un agujero de alfiler de 105 micras. Integre todas las imágenes en un solo enfoque.Reconstruya las imágenes en el patrón tridimensional con el sistema de procesamiento de imágenes. Aquí se demuestra la correlación espacial representativa del músculo gastrocnemio medial con el filamento neuro 200 fibras nerviosas positivas, el transportador vesicular de acetilcolina terminal presináptico positivo, los receptores de acetilcolina postsinápticos positivos para la toxina alfa bungaro, las células de Schwann perisinápticas S100 positivas, las fibras musculares positivas para faloidina y los núcleos celulares marcados con DAPI. El neurofilamento 200 fibras nerviosas positivas corrió en haz.Estas fibras nerviosas dieron ramas a los terminales presinápticos positivos del transportador de acetilcolina vesicular, que formaron una relación espejo con los receptores de acetilcolina postsinápticos positivos de la toxina alfa bungaro. Además, las células de Schwann perisinápticas S100 positivas se detectaron alrededor del neurofilamento 200 fibras nerviosas positivas cerca de los terminales presinápticos. La correlación espacial se exhibió además en un patrón tridimensional que muestra las características morfológicas detalladas de la unión neuromuscular desde diferentes perspectivas.Para observar más imágenes en las secciones musculares, es fundamental cortar el músculo horizontalmente a lo largo del eje largo a un grosor de 80 micras.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

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La disección y la imagen de zonas activas en el Drosophila La unión neuromuscular

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Investigación

Neurociencias

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Secuencial Foto-blanqueamiento para Precisar las células individuales de Schwann en la unión neuromuscular

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

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Disección Del Músculo Transverso Abdominis Para El Análisis De La Unión Neuromuscular De Montaje Completo

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

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Detección de<em&gt; In Situ</em&gt; Complejos proteína-proteína en la<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular Usando proximidad Ligadura Ensayo

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

La unión neuromuscular: Medición Synapse Tamaño, fragmentación y los cambios en la densidad de proteína sináptica Uso confocal microscopía de fluorescencia

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

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¿Por qué importa la cuantificación: Caracterización de fenotipos en el<em&gt; Drosophila</em&gt; Larval unión neuromuscular

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

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One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

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Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

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Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

Ciclos de recuperación de velocidad muscular para examinar las propiedades de la membrana muscular

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...