Name: visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Denna studie finansierades av CACMS Innovation Fund (nr. CI2021A03407), National Natural Science Foundation of China (nr 82004299) och grundforskningsfonderna för de centrala offentliga välfärdsforskningsinstituten (nr. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

Denna studie godkändes av etikkommittén för Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (godkännande nr 2021-04-15-1). Alla procedurer genomfördes i enlighet med National Institutes of Health Guide för vård och användning av laboratoriedjur (National Academy Press, Washington, DC, 1996). Tre vuxna hanråttor (Sprague-Dawley, vikt 230 ± 15 g) användes. Råttorna inhystes i en 12 h ljus/mörk cykel med kontrollerad temperatur och luftfuktighet och med fri tillgång till mat...

<ol>
	<li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells,+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats.">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+extracellular+complexity+of+neuromuscular+junction+organizers.">Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).</li><li>Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+in+health+and+disease:+molecular+mechanisms+governing+synaptic+formation+and+homeostasis.">The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).</li><li>Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+distribution+of+acetylcholine+receptors+at+developing+mouse+neuromuscular+junctions.">Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions.</a> The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).</li><li>Desaki, J., Uehara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maturation+of+subneural+apparatuses+at+neuromuscular+junctions+in+postnatal+rats:+a+scanning+and+transmission+electron+microscopical+study.">Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study.</a> Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).</li><li>Marques, M., Santo Neto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuromuscular+junctions+by+confocal+fluorescence+microscopy:+individual+endplates+seen+in+whole+muscles+with+vital+intracellular+staining+of+the+nerve+terminals.">Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals.</a> Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).</li><li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+a+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+motor+endplates+and+its+adaptive+change+in+skeletal+muscle.">Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle.</a> Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Chen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+injection+of+-bungarotoxin+to+improve+the+efficiency+of+motor+endplate+labeling.">In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling.</a> Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).</li><li>Sugiura, Y., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-glia+interactions:+the+roles+of+Schwann+cells+in+neuromuscular+synapse+formation+and+function.">Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function.</a> Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).</li><li>Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisynaptic+schwann+cells+-+The+multitasking+cells+at+the+developing+neuromuscular+junctions.">Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).</li><li>Walker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+perisynaptic+Schwann+cell+and+neuromuscular+junction+research.">Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research.</a> Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).</li><li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+defects+and+breathing+disorders+in+a+new+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+endoplasmic+reticulum+stress+in+soleus+and+gastrocnemius+muscles+and+differential+response+to+UPR+pathway+in+rats.">Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats.</a> Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).</li><li>Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle+based+on+inputs+to+motoneurons+and+on+an+algorithm+for+prediction+of+the+motor+unit+force.">A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).</li><li>Marinello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuromuscular+junctions+in+mice+by+combined+confocal+and+super-resolution+microscopy.">Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).</li><li>Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+multiple+aspects+of+neurofilament+functions,+and+their+possible+contribution+to+neurodegeneration.">Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration.</a> Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).</li><li>Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+and+neurofilament+proteins+in+health+and+disease.">Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).</li><li>Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinesterases+in+tripartite+neuromuscular+synapse.">Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).</li><li>Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).</li><li>Rudolf, R., Straka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+at+vertebrate+motor+endplates:+Endocytosis,+recycling,+and+degradation.">Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation.</a> Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).</li><li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance.">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li><li>Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+guidance+of+nerve+growth+between+synaptic+sites+explains+changes+in+the+pattern+of+muscle+innervation+and+remodeling+of+synaptic+sites+following+peripheral+nerve+injuries.">Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries.</a> Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+neuromuscular+junction.">Molecular architecture of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li></ol>

Vi har beskrivit de tekniska detaljer som krävs för att utföra framgångsrik multipel färgning av muskelskivor och användning av fluorescerande immunohistokemi för att avslöja de morfologiska egenskaperna hos NMJ på de tjocka delarna av råttans mediala gastrocnemiusmuskel. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan de fina detaljerna och den rumsliga korrelationen mellan PSC: erna och pre- och postsynaptiska element analyseras och uppskattas under konfokalmikroskopi och rekonstrueras ytterligare i ett tre...

Som tre väsentliga strukturella komponenter i den neuromuskulära korsningen (NMJ)1,2,3,4 har morfologiska aspekter av de presynaptiska motoraxonterminalerna, postsynaptiska membran innehållande nikotinacetylkolinreceptorer (AchRs) och perisynaptiska Schwann-celler (PSC) undersökts omfattande. Tunna sektioner och helmonterade prover av skelettmusklerna har undersökts med olika histologiska tekniker, såsom elektronmikroskopi 5,6, konfokalmikroskopi 7,8 och ljusplåtsmikroskopi 9,10. Även om de morfologiska egenskaperna hos NMJ har demonstrerats av dessa tekniker från olika aspekter, som en jämförelse, är konfokalmikroskopi fortfarande ett idealiskt val för avbildning av NMJ: s detaljerade morfologi.
Nyligen har många nya tekniker utvecklats för att visa de strukturella komponenterna i NMJ. Till exempel har thy1-YFP transgena fluorescerande möss använts direkt för att observera motoraxoner och motorändplattor in vivo och in vitro10,11. Dessutom har intravenös injektion av fluorescerande α-BTX tillämpats för att avslöja den rumsliga fördelningen av motorändplattor i helmonterade skelettmuskler av vildtyp och transgen fluorescerande möss, genom att använda vävnadsoptisk clearingbehandling för undersökning med ljusplåtmikroskopi 9,12. Men förutom de pre- och postsynaptiska elementen som kan ses med dessa avancerade metoder kan PSC: erna inte demonstreras samtidigt.
Ackumulerande bevis tyder på att PSC, som de perifera glialcellerna, är nära associerade med de presynaptiska terminalerna som bidrar till utvecklingen och stabiliteten hos NMJ, moduleringen av synaptisk aktivitet hos NMJ under det fysiologiska tillståndet och regenereringen av NMJ efter nervskada 13,14,15 . Med tanke på NMJ: s cellulära arkitektur är detta protokoll en korrekt kandidat för att samtidigt märka PSC: erna, pre- och postsynaptiska element, och används potentiellt för att utvärdera NMJ: s integritet och plasticitet under normala och patologiska förhållanden. Jämför till exempel intensiteten hos NMJ, morfologi och volym av postsynaptiska motoriska ändplattor, innervation och denervation av NMJ och antal PSC i muskler med fysiologisk och patologisk status.
Gastrocnemiusmuskeln är den största muskeln som bildar utbuktningen i vaden, som lätt dissekeras ut genom att ta bort huden och biceps femoris-muskeln från lemmen. Muskeln väljs ofta för att bedöma muskelatrofi, neuromuskulär degeneration, muskelprestanda och motorenhetskraft ex vivo eller in vivo16,17,18. Tekniken är emellertid också lämplig för att avslöja de morfologiska egenskaperna hos NMJ från olika skelettmuskler. Samtidigt kan de tjocka muskelsektionerna avslöja mer fullständig morfologi och mängd NMJ jämfört med tunna sektioner 7,8 och retade muskelfibrer19.
I linje med dessa studier valdes den råtta mediala gastrocnemiusmuskeln som målvävnad i denna studie och skivades med en tjocklek av 80 μm för multipel fluorescerande färgning med olika typer av biomarkörer enligt de strukturella komponenterna i NMJ. Här användes neurofilament 200 (NF200)20,21, vesikulär acetylkolintransportör (VAChT)22, alfa-bungarotoxin (α-BTX)23,24 och S10025,26 för att märka nervfibrer, presynaptiska terminaler, postsynaptiska AchR respektive PSC. Dessutom motverkades bakgrunden av muskelvävnad och cellulära kärnor ytterligare med falloidin och DAPI.
I denna studie förväntar vi oss att utveckla ett raffinerat protokoll för att samtidigt färga NMJ: s cellulära arkitektur med deras motsvarande biomarkörer på tjockare fasta prover, vilket är bekvämare för användning i konfokalmikroskopi och hjälper till att få mycket mer information om den detaljerade strukturen hos PSC: erna, pre- och postsynaptiska element, liksom deras rumsliga korrelation med varandra. Ur metodologisk synvinkel kan detta protokoll dra nytta av att utvärdera de morfologiska egenskaperna hos NMJ under normala och patologiska förhållanden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>149973 (703-545-155)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Neg-50</td>
			<td>Colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>10212450C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4680</td>
			<td>Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd</td>
			<td>H37022750</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P804536</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin AF350</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision peristaltic pump</td>
			<td>Longer</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100-&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52642</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dbasic dodecahydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818118</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S817463</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818046</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4951PLUS-001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vesicular Acetylcholine Transporter</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>ANB100</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin AF647 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B35450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle

Den neuromuskulära korsningen (NMJ) är en komplex struktur som tjänar till signalkommunikationen från motorneuronen till skelettmuskeln och består av tre väsentliga histologiska komponenter: de presynaptiska motoraxonterminalerna, postsynaptiska nikotinacetylkolinreceptorer (AchRs) och peri-synaptiska Schwann-celler (PSC). För att demonstrera de morfologiska egenskaperna hos NMJ valdes den råtta mediala gastrocnemiusmuskeln som målvävnad och undersöktes med hjälp av flera fluorescerande färgning med olika typer av biomarkörer, inklusive neurofilament 200 (NF200) och vesikulär acetylkolintransportör (VAChT) för motornervfibrerna och deras presynaptiska terminaler, alfa-bungarotoxin (α-BTX) för postsynaptiska nikotiniska AchR, och S100 för PSC: erna. I denna studie utfördes färgning i två grupper: i den första gruppen färgades prover med NF200, VAChT och α-BTX, och i den andra gruppen färgades prover med NF200, α-BTX och S100. Det visades att båda protokollen effektivt kan visa nmj:s detaljerade struktur. Med hjälp av konfokalmikroskopet sågs morfologiska egenskaper hos de presynaptiska terminalerna, postsynaptiska receptorerna och PSC, och deras Z-stacksbilder rekonstruerades i ett tredimensionellt mönster för att ytterligare analysera den rumsliga korrelationen mellan de olika märkningarna. Ur metodologiskt perspektiv ger dessa protokoll en värdefull referens för att undersöka de morfologiska egenskaperna hos NMJ under fysiologiska förhållanden, vilket också kan vara lämpligt för att utvärdera den patologiska förändringen av NMJ, såsom perifer nervskada och regenerering.

Efter flera fluorescerande färgning demonstrerades motsvarande märkning ordnat på de 80 μm tjocka sektionerna av råttamediala gastrocnemiusmuskeln med NF200-positiva nervfibrer, VAChT-positiva pre-synaptiska terminaler, α-BTX-positiva postsynaptiska AchR, S100-positiva PSC, falloidinpositiva muskelfibrer och DAPI-märkta cellulära kärnor (Figur 3 och Figur 4).
Det visades att NF200-positiva nervfibrer sprang i bunt och gav ut ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Protokollet visar en metod för att undersöka rumslig korrelation mellan de presynaptiska terminalerna, postsynaptiska receptorerna och perisynaptiska Schwann-celler i råttamediala gastrocnemiusmuskeln med hjälp av fluorescerande immunohistokemi med olika biomarkörer, nämligen neurofilament 200, vesikulär acetylkolintransportör, alfa-bungarotoxin och S100.

Visualisera de morfologiska egenskaperna hos neuromuskulär korsning i råtta medial gastrocnemiusmuskel

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

Detta protokoll kan användas för att utvärdera integritet och plasticitet hos en neuromuskulär korsning under normala och patologiska förhållanden. Denna teknik är en att samtidigt märka Schwann-cellerna och före och efter försöksdjur på enstaka muskelsektioner. Efter avlivning av den vuxna hanråttan, placera råttan i huven och öppna brösthålan för att komma åt hjärtat med sax och pincett.Sätt in och intravenös kateter från vänster hjärtkammare mot aortan och skär höger orakel. Starta sedan perfusionen med 100 ml 0,9% normal saltlösning tills blodet som går ut från rätt orakel är klart. Fortsätt sedan att perfusera med 250 till 300 ml 4% paraformaldehyd i 0,1 molfosfatbuffert eller PB pH 7,4 i 10 minuter.Efter perfusion, ta bort huden på den bilaterala bakbenet med ett kirurgiskt blad och exponera den bilaterala ischiasnerven och den mediala gastrocnemiusmuskeln. Dissekera ut den bilaterala mediala gastrocnemiusmuskeln försiktigt från bakbenet med ett blad och postfixera hela muskeln i 10 ml 4% paraformaldehyd. Efter två timmar, ta bort muskeln från lösningen och kryoskydda den i 10 ml 25% sackaros i 0,1 molar PB i en dag vid fyra grader celsius.När muskelvävnaden är nedsänkt i sackaroslösningen, fixa den på ett fryssteg i ett glidande mikrotomsystem med hjälp av ett fruset sektionsmedium. Skiva muskeln horisontellt längs muskelns långa axel med en tjocklek av 80 mikron. Använd en borste och placera sju kryosektioner per brunn på ett ordnat sätt i en sexbrunnsodlingsplatta med 10 ml 0,1 molar PB. För fluorescerande färgning, inkubera fyra sektioner per brunn med 1,5 ml 0,1 molar PB innehållande 75 mikroliter av 10% Triton X 100 och 45 mikroliter av normalt åsneserum på en orbital shaker vid 20 rpm.Efter 30 minuter överför sektionerna till 1,5 ml av en blandad lösning av primära antikroppar innehållande kanin-anti-neuro filament 200, get anti-vesikulär acetylkolintransportör i 0,1 molär PB, i 1% normalt åsneserum och 0,5% Triton X 100 och inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag, tvätta sektionerna tre gånger i fem minuter vardera i 0,1 molar PB på i orbital shaker vid 20 rpm. Efter den sista tvätten inkubera sektionen i en blandad lösning av sekundära antikroppar innehållande åsna anti-kanin AF 488 och åsna anti-get AF 546, liksom biomarkörerna för alfa bungaro toxin AF 647 och falloidin 350 innehållande i 0,1 M PB innehållande 1% normalt åsneserum och 0,5 Triton x 100 i en timme, Skydda dem från ljus.Tvätta sektionerna i PB efter inkubation och montera dem på ett mikroskopglas. Applicera täckglas på sektionen med 50% glycerin i destillerat vatten. Observera och avbilda provet med hjälp av ett konfokalt bildsystem utrustat med en 20 x subjektiv lins med en numerisk bländare på 0,75 och en 40 x lins med en numerisk bländare på 0,95.För multipel fluorescerande avbildning, ställ in excitations- och emissionsvåglängderna för varje biomarkör enligt beskrivningen i textmanuskriptet. Ställ in upplösningen för bildtagning till 640 x 640 pixlar. Ställ sedan in start- och slutfokalplanet.Ställ in stegstorlek till antingen en eller två mikron. Välj sedan djupmönster, bildtagning och Z-serie. För de lägre förstoringsbilderna vid 20 X tar du 40 Z stackbilder i två mikron stegstorlek med ett 105 mikron pinhål.Välj projektion eller topografiläge och intensitetsprojektion över Z-axeln för att integrera alla bilder i ett enda fokus. För bilder med högre förstoring vid 40 X, ta 80 Z stackbilder i en mikron stegstorlek med zoom inställd på två och ett 105 mikron pinhål. Integrera alla bilder i ett enda fokus.Rekonstruera bilderna i det tredimensionella mönstret med bildbehandlingssystemet. Den representativa spaciala korrelationen mellan den mediala gastrocnemius-muskeln med neurofilament 200 positiva nervfibrer, vesikulär acetylkolintransportör positiv pre-synaptisk terminal, alfa bungaro-toxinpositiv post-synaptiska acetylkolinreceptorer, S100-positiva perisynaptiska Schwann-celler, falloidinpositiva muskelfibrer och DAPI-märkta cellulära kärnor demonstreras här. Neurofilament 200 positiva nervfibrer sprang i bunt.Dessa nervfibrer gav grenar till vesikulär acetylkolintransportör positiva presynaptiska terminaler, som bildade ett spegelförhållande med alfa bungaro-toxinpositiva postsynaptiska acetylkolinreceptorer. Dessutom detekterades de S100-positiva perisynaptiska Schwann-cellerna runt neurofilamentet 200 positiva nervfibrer nära de pre-synaptiska terminalerna. Den rumsliga korrelationen uppvisades vidare i ett tredimensionellt mönster som visar de detaljerade morfologiska egenskaperna hos den neuromuskulära korsningen ur olika perspektiv.För att observera mer avbildning i muskelsektioner är det viktigt att skära muskeln horisontellt längs den långa axeln med en tjocklek av 80 mikron.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissekering och Imaging av Active Zoner i Drosophila Neuromuskulära förbindelsen

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sekventiell fotoblekningsreaktion att avgränsa Single Schwann celler vid den neuromuskulära förbindelsen

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissekering av Transversus Abdominis muskel för hela berget Neuromuskulär junction analys

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detektion av<em&gt; In situ</em&gt; Protein-proteinkomplex på<em&gt; Drosophila</em&gt; Larv Neuromuskulära förbindelsen Använda Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Den neuromuskulära förbindelsen: Mäta Synapse Storlek, fragmentering och Förändringar i Synaptic Protein Densitet Använda Confocal fluorescensmikroskopi

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Varför kvantifiering Matters: karakterisering av fenotyper vid<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvernas Neuromuskulära förbindelsen

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Fylla på en kalciumfärg i fröens nervändamål via nervstubben: Kalciumtransientregistrering i Neuromuskulär Junction

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Mäta neuromuskulära förbindelsen funktionalitet

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch inspelningar av Synaptic strömmar från den Drosophila Larval neuromuskulära förbindelsen

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

Muskelhastighet Återhämtning cykler för att undersöka muskelmembran egenskaper

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...