Name: visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Bu çalışma CACMS İnovasyon Fonu (No. CI2021A03407), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 82004299) ve Merkezi Kamu Refahı Araştırma Enstitüleri için Temel Araştırma Fonları (No. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

Bu çalışma, Çin Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Akupunktur ve Moxibustion Enstitüsü Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (onay No. 2021-04-15-1). Tüm prosedürler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzu'na (National Academy Press, Washington, DC, 1996) uygun olarak yürütülmüştür. Üç yetişkin erkek sıçan (Sprague-Dawley, ağırlık 230 ± 15 g) kullanıldı. Sıçanlar, kontrollü sıcaklık ve nem ile ve yiyecek ve suya serbest erişim ile 1...

<ol>
	<li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells,+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats.">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li><li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease.">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li><li>Guarino, S. R., Canciani, A., Forneris, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+extracellular+complexity+of+neuromuscular+junction+organizers.">Dissecting the extracellular complexity of neuromuscular junction organizers.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 6, 156 (2020).</li><li>Cruz, P. M. R., Cossins, J., Beeson, D., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuromuscular+junction+in+health+and+disease:+molecular+mechanisms+governing+synaptic+formation+and+homeostasis.">The neuromuscular junction in health and disease: molecular mechanisms governing synaptic formation and homeostasis.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 610964 (2020).</li><li>Matthews-Bellinger, J., Salpeter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine+structural+distribution+of+acetylcholine+receptors+at+developing+mouse+neuromuscular+junctions.">Fine structural distribution of acetylcholine receptors at developing mouse neuromuscular junctions.</a> The Journal of Neuroscienc : the Official Journal of the Society for Neuroscience. 3 (3), 644-657 (1983).</li><li>Desaki, J., Uehara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+maturation+of+subneural+apparatuses+at+neuromuscular+junctions+in+postnatal+rats:+a+scanning+and+transmission+electron+microscopical+study.">Formation and maturation of subneural apparatuses at neuromuscular junctions in postnatal rats: a scanning and transmission electron microscopical study.</a> Developmental Biology. 119 (2), 390-401 (1987).</li><li>Marques, M., Santo Neto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuromuscular+junctions+by+confocal+fluorescence+microscopy:+individual+endplates+seen+in+whole+muscles+with+vital+intracellular+staining+of+the+nerve+terminals.">Imaging neuromuscular junctions by confocal fluorescence microscopy: individual endplates seen in whole muscles with vital intracellular staining of the nerve terminals.</a> Journal of Anatomy. 192, 425-430 (1998).</li><li>Magill, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reinnervation+of+the+tibialis+anterior+following+sciatic+nerve+crush+injury:+a+confocal+microscopic+study+in+transgenic+mice.">Reinnervation of the tibialis anterior following sciatic nerve crush injury: a confocal microscopic study in transgenic mice.</a> Experimental Neurology. 207 (1), 64-74 (2007).</li><li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+distribution+of+motor+endplates+and+its+adaptive+change+in+skeletal+muscle.">Spatial distribution of motor endplates and its adaptive change in skeletal muscle.</a> Theranostics. 9 (3), 734-746 (2019).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Chen, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+injection+of+-bungarotoxin+to+improve+the+efficiency+of+motor+endplate+labeling.">In vivo injection of -bungarotoxin to improve the efficiency of motor endplate labeling.</a> Brain and Behavior. 6 (6), 00468 (2016).</li><li>Sugiura, Y., Lin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuron-glia+interactions:+the+roles+of+Schwann+cells+in+neuromuscular+synapse+formation+and+function.">Neuron-glia interactions: the roles of Schwann cells in neuromuscular synapse formation and function.</a> Bioscience Reports. 31 (5), 295-302 (2011).</li><li>Alvarez-Suarez, P., Gawor, M., Proszynski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisynaptic+schwann+cells+-+The+multitasking+cells+at+the+developing+neuromuscular+junctions.">Perisynaptic schwann cells - The multitasking cells at the developing neuromuscular junctions.</a> Seminars in Cell &amp; Developmental Biology. 104, 31-38 (2020).</li><li>Walker, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+perisynaptic+Schwann+cell+and+neuromuscular+junction+research.">Progress in perisynaptic Schwann cell and neuromuscular junction research.</a> Neural Regeneration Research. 17 (6), 1273-1274 (2022).</li><li>Michaud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+defects+and+breathing+disorders+in+a+new+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Neuromuscular defects and breathing disorders in a new mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Neurobiology of Disease. 38 (1), 125-135 (2010).</li><li>Sharma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat-induced+endoplasmic+reticulum+stress+in+soleus+and+gastrocnemius+muscles+and+differential+response+to+UPR+pathway+in+rats.">Heat-induced endoplasmic reticulum stress in soleus and gastrocnemius muscles and differential response to UPR pathway in rats.</a> Cell Stress Chaperones. 26 (2), 323-339 (2021).</li><li>Raikova, R., Celichowski, J., Angelova, S., Krutki, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+of+the+rat+medial+gastrocnemius+muscle+based+on+inputs+to+motoneurons+and+on+an+algorithm+for+prediction+of+the+motor+unit+force.">A model of the rat medial gastrocnemius muscle based on inputs to motoneurons and on an algorithm for prediction of the motor unit force.</a> Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1973-1987 (2018).</li><li>Marinello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+neuromuscular+junctions+in+mice+by+combined+confocal+and+super-resolution+microscopy.">Characterization of neuromuscular junctions in mice by combined confocal and super-resolution microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (178), e63032 (2021).</li><li>Perrot, R., Berges, R., Bocquet, A., Eyer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+the+multiple+aspects+of+neurofilament+functions,+and+their+possible+contribution+to+neurodegeneration.">Review of the multiple aspects of neurofilament functions, and their possible contribution to neurodegeneration.</a> Molecular Neurobiology. 38 (1), 27-65 (2008).</li><li>Yuan, A., Rao, M. V., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilaments+and+neurofilament+proteins+in+health+and+disease.">Neurofilaments and neurofilament proteins in health and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (4), 018309 (2017).</li><li>Petrov, K. A., Proskurina, S. E., Krejci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinesterases+in+tripartite+neuromuscular+synapse.">Cholinesterases in tripartite neuromuscular synapse.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 14, 811220 (2021).</li><li>Karlin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+structure+of+the+nicotinic+acetylcholine+receptors.">Emerging structure of the nicotinic acetylcholine receptors.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 3 (2), 102-114 (2002).</li><li>Rudolf, R., Straka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotinic+acetylcholine+receptor+at+vertebrate+motor+endplates:+Endocytosis,+recycling,+and+degradation.">Nicotinic acetylcholine receptor at vertebrate motor endplates: Endocytosis, recycling, and degradation.</a> Neuroscience Letters. 711, 134434 (2019).</li><li>Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. C., Mei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cells+in+neuromuscular+junction+formation+and+maintenance.">Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).</li><li>Kang, H., Tian, L., Thompson, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schwann+cell+guidance+of+nerve+growth+between+synaptic+sites+explains+changes+in+the+pattern+of+muscle+innervation+and+remodeling+of+synaptic+sites+following+peripheral+nerve+injuries.">Schwann cell guidance of nerve growth between synaptic sites explains changes in the pattern of muscle innervation and remodeling of synaptic sites following peripheral nerve injuries.</a> Journal of Comparative Neurology. 527 (8), 1388-1400 (2019).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater.">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li><li>Hughes, B. W., Kusner, L. L., Kaminski, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+the+neuromuscular+junction.">Molecular architecture of the neuromuscular junction.</a> Muscle Nerve. 33 (4), 445-461 (2006).</li><li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction.">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li></ol>

Kas dilimlerinin başarılı çoklu boyanması ve sıçan medial gastroknemius kasının kalın kesitlerinde NMJ'nin morfolojik özelliklerini ortaya çıkarmak için floresan immünohistokimyasının kullanılması için gerekli teknik detayları açıkladık. Bu yaklaşımı kullanarak, PSC'lerin ve sinaptik öncesi ve sonrası elemanların ince detayları ve mekansal korelasyonu, konfokal mikroskopi altında analiz edilebilir ve takdir edilebilir ve üç boyutlu bir düzende yeniden yapılandırılabilir. Burada, NMJ'...

Nöromüsküler bileşke (NMJ)1,2,3,4'ün üç temel yapısal bileşeni olarak, sinaptik öncesi motor akson terminallerinin, nikotinik asetilkolin reseptörleri (AchR'ler) içeren post-sinaptik membranın ve peri-sinaptik Schwann hücrelerinin (PSC'ler) morfolojik yönleri kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır. İskelet kaslarının ince kesitleri ve tam montajlı örnekleri, elektron mikroskobu 5,6, konfokal mikroskopi 7,8 ve ışık tabakası mikroskobu 9,10 gibi farklı histolojik tekniklerle incelenmiştir. NMJ'nin morfolojik özellikleri bu tekniklerle farklı yönlerden gösterilmiş olsa da, karşılaştırma olarak, konfokal mikroskopi, NMJ'nin ayrıntılı morfolojisinin görüntülenmesi için hala ideal bir seçimdir.
Son zamanlarda, NMJ'nin yapısal bileşenlerini göstermek için birçok yeni teknoloji geliştirilmiştir. Örneğin, thy1-YFP transgenik floresan fareleri, motor aksonları ve motor uç plakalarını in vivo ve in vitro 10,11'i gözlemlemek için doğrudan kullanılmıştır. Ek olarak, floresan α-BTX'in intravenöz enjeksiyonu, ışık tabakası mikroskobu 9,12 ile inceleme için doku optik temizleme tedavisi kullanılarak, vahşi tip ve transgenik floresan farelerin tüm montajlı iskelet kaslarındaki motor uç plakalarının mekansal dağılımını ortaya çıkarmak için uygulanmıştır. Bununla birlikte, bu gelişmiş yöntemlerle görülebilen sinaptik öncesi ve sonrası elemanların yanı sıra, PSC'ler aynı anda gösterilemez.
Biriken kanıtlar, PSC'lerin, periferik glial hücreler olarak, NMJ'nin gelişimine ve stabilitesine, fizyolojik durum altında NMJ'nin sinaptik aktivitesinin modülasyonuna ve sinir hasarından sonra NMJ'nin rejenerasyonuna katkıda bulunan pre-sinaptik terminallerle yakından ilişkili olduğunu göstermektedir13,14,15 . NMJ'nin hücresel mimarisi göz önüne alındığında, bu protokol PSC'leri, sinaptik öncesi ve sonrası elemanları aynı anda etiketlemek için uygun bir adaydır ve NMJ'nin bütünlüğünü ve plastisitesini normal ve patolojik koşullar altında değerlendirmek için potansiyel olarak kullanılır. Örneğin, NMJ'nin yoğunluğunu, post-sinaptik motor uç plakalarının morfolojisini ve hacmini, NMJ'nin innervasyonu ve denervasyonunu ve fizyolojik ve patolojik durumdaki kaslardaki PSC'lerin sayısını karşılaştırın.
Gastroknemius kası, baldırdaki şişkinliği oluşturan en büyük kastır ve cildin ve biseps femoris kasının uzuvdan çıkarılmasıyla kolayca diseke edilir. Kas genellikle kas atrofisi, nöromüsküler dejenerasyon, kas performansı ve motor ünite kuvveti ex vivo veya in vivo16,17,18'i değerlendirmek için seçilir. Bununla birlikte, teknik, NMJ'nin morfolojik özelliklerini çeşitli iskelet kaslarından ortaya çıkarmak için de uygundur. Aynı zamanda, kalın kas bölümleri, ince bölümler 7,8 ve alaylı kas lifleri19'a kıyasla daha eksiksiz bir morfoloji ve NMJ miktarı ortaya çıkarabilir.
Bu çalışmalar doğrultusunda, bu çalışmada sıçan medial gastroknemius kası hedef doku olarak seçilmiş ve NMJ'nin yapısal bileşenlerine göre çeşitli biyobelirteçlerle çoklu floresan boyama için 80 μm kalınlığında dilimlenmiştir. Burada, sinir liflerini, sinaptik öncesi terminalleri, post-sinaptik AchR'leri ve PSC'leri etiketlemek için sırasıyla nörofilament 200 (NF200) 20,21, veziküler asetilkolin taşıyıcı (VAChT) 22, alfa-bungarotoksin (α-BTX)23,24 ve S100 25,26 kullanıldı. Ek olarak, kas dokusunun ve hücresel çekirdeklerin arka planı falloidin ve DAPI ile daha da boyandı.
Bu çalışmada, NMJ'nin hücresel mimarisini, daha kalın sabit örnekler üzerinde karşılık gelen biyobelirteçlerle aynı anda boyamak için rafine bir protokol geliştirmeyi bekliyoruz; bu, konfokal mikroskopide kullanım için daha uygundur ve PSC'lerin ayrıntılı yapısı, sinaptik öncesi ve sonrası elemanlar ve birbirleriyle uzamsal korelasyonları hakkında çok daha fazla bilgi edinmeye yardımcı olur. Metodoloji açısından bakıldığında, bu protokol normal ve patolojik koşullar altında NMJ'nin morfolojik özelliklerini değerlendirmek için yararlı olabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken AF488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>149973 (703-545-155)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-goat AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A11056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-rabbit AF546</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A10040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen Section Medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>Neg-50</td>
			<td>Colorless</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover glass</td>
			<td>Citotest</td>
			<td>10212450C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament 200</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab4680</td>
			<td>Chicken</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>017-000-12</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal saline</td>
			<td>Shandong Hualu Pharmaceutical Co.Ltd</td>
			<td>H37022750</td>
			<td>250 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P804536</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin AF350</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A22281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision peristaltic pump</td>
			<td>Longer</td>
			<td>BT100-2J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>S100-&#946;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab52642</td>
			<td>Rabbit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dbasic dodecahydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818118</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S817463</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S818046</td>
			<td>500g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>4951PLUS-001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Solarbio Life Sciences</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vesicular Acetylcholine Transporter</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>ANB100</td>
			<td>Goat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-bungarotoxin AF647 conjugate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B35450</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing the morphological characteristics of neuromuscular junction in rat medial gastrocnemius muscle

Nöromüsküler bileşke (NMJ), motor nörondan iskelet kasına sinyal iletişimi için hizmet eden karmaşık bir yapıdır ve üç temel histolojik bileşenden oluşur: sinaptik öncesi motor akson terminalleri, sinaptik sonrası nikotinik asetilkolin reseptörleri (AchR'ler) ve peri-sinaptik Schwann hücreleri (PSC'ler). NMJ'nin morfolojik özelliklerini göstermek için, sıçan medial gastroknemius kası hedef doku olarak seçildi ve motor sinir lifleri ve bunların pre-sinaptik terminalleri için nörofilament 200 (NF200) ve veziküler asetilkolin taşıyıcı (VAChT), post-sinaptik nikotinik AchR'ler için alfa-bungarotoksin (α-BTX) dahil olmak üzere çeşitli biyobelirteçlerle çoklu floresan boyama kullanılarak incelendi. ve PSC'ler için S100. Bu çalışmada boyama iki grupta yapıldı: Birinci grupta örnekler NF200, VAChT ve α-BTX ile boyandı ve ikinci grupta örnekler NF200, α-BTX ve S100 ile boyandı. Her iki protokolün de NMJ'nin ayrıntılı yapısını etkili bir şekilde gösterebileceği gösterilmiştir. Konfokal mikroskop kullanılarak, sinaptik öncesi terminallerin, post-sinaptik reseptörlerin ve PSC'nin morfolojik özellikleri görüldü ve Z-yığınları görüntüleri, farklı etiketlemeler arasındaki uzamsal korelasyonu daha fazla analiz etmek için üç boyutlu bir desende yeniden yapılandırıldı. Metodoloji perspektifinden bakıldığında, bu protokoller fizyolojik koşullar altında NMJ'nin morfolojik özelliklerini araştırmak için değerli bir referans sağlar ve bu da periferik sinir hasarı ve rejenerasyon gibi NMJ'nin patolojik değişikliğini değerlendirmek için uygun olabilir.

Çoklu floresan boyama işleminden sonra, karşılık gelen etiketleme, NF200-pozitif sinir lifleri, VAChT-pozitif pre-sinaptik terminaller, α-BTX-pozitif post-sinaptik AchR'ler, S100-pozitif PSC'ler, faloidin-pozitif kas lifleri ve DAPI etiketli hücresel çekirdekler ile sıçan medial gastroknemius kasının 80 μm kalınlığındaki bölümlerinde düzenli olarak gösterilmiştir (Şekil 3 ve Şekil 4).
NF200-pozitif sinir lifler...

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle at JoVE.com

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

Protokol, sıçan medial gastroknemius kasındaki pre-sinaptik terminaller, post-sinaptik reseptörler ve peri-sinaptik Schwann hücreleri arasındaki uzamsal korelasyonu, farklı biyobelirteçlerle, yani nörofilament 200, veziküler asetilkolin taşıyıcısı, alfa-bungarotoksin ve S100 ile floresan immünohistokimya kullanarak incelemek için bir yöntem göstermektedir.

Sıçan Medial Gastroknemius Kasında Nöromüsküler Kavşağın Morfolojik Özelliklerinin Görselleştirilmesi

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

Bu protokol, normal ve patolojik koşullar altında nöromüsküler kavşağın bütünlüğünü ve plastisitesini değerlendirmek için kullanılabilir. Bu teknik, Schwann hücrelerini ve laboratuvar hayvanlarını tek kas bölümlerinde aynı anda etiketlemek için kullanılır. Yetişkin erkek sıçanı ötenazi yaptıktan sonra, sıçanı kaputun içine yerleştirin ve makas ve forseps kullanarak kalbe erişmek için göğüs boşluğunu açın.Sol kardiyak ventrikülden aort yönünde intravenöz kateter yerleştirin ve sağ kahili kesin. Daha sonra, sağ kahinin içinden çıkan kan temizlenene kadar perfüzyona 100 mililitre% 0.9 normal salin ile başlayın. Daha sonra 10 dakika boyunca 0.1 molar fosfat tamponunda veya PB pH 7.4'te 250 ila 300 mililitre% 4 paraformaldehit ile perfüzyona devam edin.Perfüzyondan sonra, cerrahi bir bıçak kullanarak bilateral arka ekstremitenin derisini çıkarın ve bilateral siyatik sinir ve medial gastroknemius kasını açığa çıkarın. İki taraflı medial gastroknemius kasını bir bıçak kullanarak arka bacaklardan dikkatlice diseke edin ve tüm kası 10 mililitre% 4 paraformaldehit içine sabitleyin. İki saat sonra, kası çözeltiden çıkarın ve kriyodört santigrat derecede bir gün boyunca 0.1 molar PB'de 10 mililitre% 25 sakkarozda koruyun.Kas dokusu sakkaroz çözeltisine daldırıldıktan sonra, dondurulmuş bir kesit ortamı kullanarak sürgülü bir mikrotom sisteminin donma aşamasına sabitleyin. Kasları, kasın uzun ekseni boyunca yatay olarak 80 mikron kalınlığında dilimleyin. Bir fırça kullanarak, kuyu başına yedi kriyo bölümünü, 10 mililitre 0,1 molar PB içeren altı kuyucuklu bir kültür plakasına düzenli bir şekilde yerleştirin. Floresan boyama için, 20 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda 75 mikrolitre% 10 Triton X 100 ve 45 mikrolitre normal eşek serumu içeren 1.5 mililitre 0.1 molar PB ile kuyu başına dört bölüm inkübe edin.30 dakika sonra, bölümleri tavşan anti-nöro filament 200, keçi anti-veziküler asetilkolin taşıyıcısı,% 1 normal eşek serumunda veya% 0.5 Triton X 100 içeren karışık bir primer antikor çözeltisinin 1.5 mililitresine aktarın ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, bölümleri 20 rpm'de orbital çalkalayıcıda 0.1 molar PB'de her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, bölümü, eşek anti-tavşan AF 488 ve eşek anti-keçi AF 546 içeren karışık bir ikincil antikorlar çözeltisinin yanı sıra,% 1 normal eşek serumu ve% 1 Triton x 100 içeren 0.1 M PB'de bulunan alfa bungaro toksini AF 647 ve falloidin 350'nin biyobelirteçlerini bir saat boyunca inkübe edin, Onları ışıktan korumak.Kuluçkadan sonra, bölümleri PB'de yıkayın ve mikroskop slaytına monte edin. Damıtılmış suda% 50 gliserin kullanarak bölüme kapak camı uygulayın. Sayısal diyafram açıklığına sahip 20 x öznel lens ve 0,95 sayısal diyafram açıklığına sahip 40 x lens ile donatılmış bir con focal görüntüleme sistemi kullanarak numuneyi gözlemleyin ve görüntüleyin.Çoklu floresan görüntüleme için, her bir biyobelirtecin uyarma ve emisyon dalga boylarını metin makalesinde açıklandığı gibi ayarlayın. Görüntü yakalama çözünürlüğünü 640 x 640 piksel olarak ayarlayın. Ardından, başlangıç ve bitiş odak düzlemini ayarlayın.Adım boyutunu bir veya iki mikrona ayarlayın. Ardından derinlik deseni, görüntü yakalama ve Z serisini seçin. 20 X'te daha düşük büyütmeli görüntüler için, 105 mikronluk bir iğne deliği kullanarak iki mikron adım boyutunda 40 Z yığın görüntüleri yakalayın.Tüm görüntüleri tek bir odakta bütünleştirmek için Z ekseni üzerinden projeksiyon veya topografya modunu ve yoğunluk projeksiyonunu seçin. 40 X'te daha yüksek büyütmeli görüntüler için, yakınlaştırma iki olarak ayarlanmış ve 105 mikron iğne deliği ile bir mikron adım boyutunda 80 Z yığın görüntüleri yakalayın. Tüm görüntüleri tek bir odak noktasında bütünleştirin.Görüntü işleme sistemi ile görüntüleri üç boyutlu desende yeniden oluşturun. Medial gastroknemius kasının nöro filament 200 pozitif sinir lifleri, veziküler asetilkolin taşıyıcı pozitif presinaptik terminal, alfa bungaro toksin pozitif post-sinaptik asetilkolin reseptörleri, S100 pozitif perisinaptik Schwann hücreleri, faloidin pozitif kas lifleri ve DAPI işaretli hücresel çekirdekler ile temsili uzaysal korelasyonu burada gösterilmiştir. Nörofilament 200 pozitif sinir lifleri demet halinde koştu.Bu sinir lifleri, veziküler asetilkolin taşıyıcı pozitif presinaptik terminallere dallar verdi ve bu da alfa bungaro toksini pozitif post-sinaptik asetilkolin reseptörleri ile ayna ilişkisi oluşturdu. Ek olarak, S100 pozitif perisinaptik Schwann hücreleri, pre-sinaptik terminallere yakın nörofilament 200 pozitif sinir lifleri etrafında tespit edildi. Uzamsal korelasyon ayrıca nöromüsküler kavşağın ayrıntılı morfolojik özelliklerini farklı perspektiflerden gösteren üç boyutlu bir desende sergilendi.Kas kesitlerinde daha fazla görüntüleme gözlemlemek için, kası uzun eksen boyunca yatay olarak 80 mikron kalınlığında dilimlemek çok önemlidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sıralı Nöromusküler Kavşağı&#39;nda Tek Schwann Hücreleri belirginleştiren Photo-beyazlatma

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Algılama<em&gt; In Situ</emEn&gt; Protein-protein kompleksleri<em&gt; Drosophila</emProximity ligasyon Testi Kullanımı&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Nöromusküler Kavşak: Ölçme Synapse Boyut, Konfokal Floresan Mikroskobu kullanılarak sinaptik Protein Yoğunluk Parçalanma ve Değişiklikler

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

En fenotip Karakterizasyonu: Niceleme Matters Neden<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva Nöromüsküler Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

Loading a Calcium Dye into Frog Nerve Endings Through the Nerve Stump: Calcium Transient Registration in the Frog Neuromuscular Junction

Kurbağa Sinir Uçlarına Sinir Kütüğü Vasıtasıyla Kalsiyum Boyası Yükleme: Kurbağa Nöromüsküler Kavşağında Kalsiyum Geçici Kayıt

One of the most feasible methods of measuring presynaptic calcium levels in presynaptic nerve terminals is optical recording. It is based on using ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila larva nöromüsküler kavşak sinaptik akımlardan Fokal Macropatch kayıtları

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Muscle Velocity Recovery Cycles to Examine Muscle Membrane Properties

Kas Hızı Kurtarma Döngüleri Kas Membranı Özelliklerini İncelemek için

Although conventional nerve conduction studies (NCS) and electromyography (EMG) are suitable for the diagnosis of neuromuscular disorders, they provide ...