Name: observation of photobehavior in chlamydomonas reinhardtii
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Observation of Photobehavior in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Denne studien ble støttet av tilskudd fra Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (https://www.jsps.go.jp/english/index.html) til NU (19K23758, 21K06295), TH (16H06556) og KW (19H03242, 20K21420, 21H00420), fra Ohsumi Frontier Science Foundation (https://www.ofsf.or.jp/en/) til KW, og fra Dynamic Alliance for Open Innovation Bridging Human, Environment and Materials (http://alliance.tagen.tohoku.ac.jp/english/) til NU, TH og KW.

I den nåværende studien ble en villtype stamme av Chlamydomonas reinhardtii, et avkom av korset CC-124 x CC-125 med agg1 + mt-, brukt21. CC-124 og CC-125 ble hentet fra Chlamydomonas Resource Center (se Materialfortegnelser) og opprettholdt på et Tris-acetat-fosfat (TAP)22, 1,5% agarose medium ved 20-25 °C. Enhver motil stamme kan brukes til denne protokollen.
1. Cellekultur
<ol><li>Kultur en inte...

<ol>
	<li>Demmig-Adams, B., Adams, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoprotection+and+other+responses+of+plants+to+high+light+stress.">Photoprotection and other responses of plants to high light stress.</a> Annual Reviews Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 43, 599-626 (1992).</li><li>Wada, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloroplast+movement.">Chloroplast movement.</a> Plant Science. 210, 177-182 (2013).</li><li>Sgarbossa, A., Checcucci, G., Lenci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreception+and+photomovements+of+microorganisms.">Photoreception and photomovements of microorganisms.</a> Photochemical &amp; Photobiological Sciences. 1 (7), 459-467 (2002).</li><li>Ueki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eyespot-dependent+determination+of+the+phototactic+sign+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Eyespot-dependent determination of the phototactic sign in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 5299-5304 (2016).</li><li>Foster, K. W., Smyth, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+antennas+in+phototactic+algae.">Light antennas in phototactic algae.</a> Microbiological Reviews. 44 (4), 572-630 (1980).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-1:+a+light-gated+proton+channel+in+green+algae.">Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae.</a> Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Sineshchekov, O. A., Jung, K. -. H., Spudich, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+rhodopsins+mediate+phototaxis+to+low-+and+high-intensity+light+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Two rhodopsins mediate phototaxis to low- and high-intensity light in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (13), 8689-8694 (2002).</li><li>Suzuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Archaeal-type+rhodopsins+in+Chlamydomonas:+model+structure+and+intracellular+localization.">Archaeal-type rhodopsins in Chlamydomonas: model structure and intracellular localization.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 711-717 (2003).</li><li>Berthold, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-1+initiates+phototaxis+and+photophobic+responses+in+Chlamydomonas+by+immediate+light-induced+depolarization.">Channelrhodopsin-1 initiates phototaxis and photophobic responses in Chlamydomonas by immediate light-induced depolarization.</a> Plant Cell. 20 (6), 1665-1677 (2008).</li><li>Deisseroth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+optical+technologies+for+illuminating+genetically+targeted+brain+circuits.">Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits.</a> Journal of Neuroscience. 26 (41), 10380-10386 (2006).</li><li>Wakabayashi, K., Isu, A., Ueki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-dependent+photo-behavioral+responses+in+the+unicellular+green+alga+Chlamydomonas+reinhardtii.">Channelrhodopsin-dependent photo-behavioral responses in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii.</a> Optogenetics (Advances in Experimental Medicine and Biology), 2nd ed. , 21-33 (2021).</li><li>R&#252;ffer, U., Nultsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+photoresponses+of+Chlamydomonas+cells+held+on+micropipettes:+II.+Change+in+flagellar+beat+pattern.">Flagellar photoresponses of Chlamydomonas cells held on micropipettes: II. Change in flagellar beat pattern.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 18 (4), 269-278 (1991).</li><li>Kamiya, R., Hasegawa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+difference+in+beat+frequency+between+the+two+flagella+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Intrinsic difference in beat frequency between the two flagella of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Experimental Cell Research. 173, 299-304 (1987).</li><li>Kamiya, R., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submicromolar+levels+of+calcium+control+the+balance+of+beating+between+the+two+flagella+in+demembranated+models+of+Chlamydomonas.">Submicromolar levels of calcium control the balance of beating between the two flagella in demembranated models of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 98 (1), 97-107 (1984).</li><li>Okita, N., Isogai, N., Hirono, M., Kamiya, R., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototactic+activity+in+Chlamydomonas+'non-phototactic'+mutants+deficient+in+Ca2+-dependent+control+of+flagellar+dominance+or+in+inner-arm+dynein.">Phototactic activity in Chlamydomonas 'non-phototactic' mutants deficient in Ca2+-dependent control of flagellar dominance or in inner-arm dynein.</a> Journal of Cell Science. 118, 529-537 (2005).</li><li>Horst, C. J., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ptx1,+a+nonphototactic+mutant+of+Chlamydomonas,+lacks+control+of+flagellar+dominance.">ptx1, a nonphototactic mutant of Chlamydomonas, lacks control of flagellar dominance.</a> Journal of Cell Biology. 120 (3), 733-741 (1993).</li><li>Hyams, J. S., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+flagellar+apparatus+of+Chlamydomonas:+characterization+of+forward+swimming+and+alteration+of+waveform+and+reversal+of+motion+by+calcium+ions+in+vitro.">Isolated flagellar apparatus of Chlamydomonas: characterization of forward swimming and alteration of waveform and reversal of motion by calcium ions in vitro.</a> Journal of Cell Science. 33, 235-253 (1978).</li><li>Bessen, M., Fay, R. B., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+waveform+in+isolated+flagellar+axonemes+of+Chlamydomonas.">Calcium control of waveform in isolated flagellar axonemes of Chlamydomonas.</a> Journal of Cell Biology. 86 (2), 446-455 (1980).</li><li>Reiter, J. F., Leroux, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+molecular+pathways+underpinning+ciliopathies.">Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 533-547 (2017).</li><li>Ide, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+agg1+mutation+responsible+for+negative+phototaxis+in+a+&amp;#34;wild-type&amp;#34;+strain+of+Chlamydomonas+reinhardtii.">Identification of the agg1 mutation responsible for negative phototaxis in a &amp;#34;wild-type&amp;#34; strain of Chlamydomonas reinhardtii.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 7, 379-385 (2016).</li><li>Gorman, D. S., Levine, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+f+and+plastocyanin:+their+sequence+in+the+photosynthetic+electron+transport+chain+of+Chlamydomonas+reinhardi.">Cytochrome f and plastocyanin: their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardi.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 54 (6), 1665-1669 (1965).</li><li>Finst, R. J., Kim, P. J., Quarmby, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+the+deflagellation+pathway+in+Chlamydomonas.">Genetics of the deflagellation pathway in Chlamydomonas.</a> Genetics. 149 (2), 927-936 (1998).</li><li>Morel-Laurens, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+control+of+phototactic+orientation+in+Chlamydomonas+reinhardtii:+sign+and+strength+of+response.">Calcium control of phototactic orientation in Chlamydomonas reinhardtii: sign and strength of response.</a> Photochemistry and Photobiology. 45 (1), 119-128 (1987).</li><li>Wakabayashi, K., King, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+Chlamydomonas+reinhardtii+flagellar+motility+by+redox+poise.">Modulation of Chlamydomonas reinhardtii flagellar motility by redox poise.</a> Journal of Cell Biology. 173 (5), 743-754 (2006).</li><li>Wakabayashi, K., Misawa, Y., Mochiji, S., Kamiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction-oxidation+poise+regulates+the+sign+of+phototaxis+in+Chlamydomonas+reinhardtii.">Reduction-oxidation poise regulates the sign of phototaxis in Chlamydomonas reinhardtii.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 11280-11284 (2011).</li><li>Harris, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> in The Chlamydomonas Sourcebook Second Edition. 1, 25-64 (2009).</li><li>Mergenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+clock:+genetic+characterization+of+a+short+period+mutant+of+Chlamydomonas+reinhardii.">Circadian clock: genetic characterization of a short period mutant of Chlamydomonas reinhardii.</a> European Journal of Cell Biology. 33 (1), 13-18 (1984).</li><li>Ozasa, K., Lee, J., Song, S., Hara, M., Maeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+optical+feedback+control+of+Euglena+confined+in+closed-type+microfluidic+channels.">Two-dimensional optical feedback control of Euglena confined in closed-type microfluidic channels.</a> Lab on a Chip. 11 (11), 1933-1940 (2011).</li><li>Tanno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four-celled+Volvocales+green+alga+Tetrabaena+socialis+exhibits+weak+photobehavior+and+high-photoprotection+ability.">The four-celled Volvocales green alga Tetrabaena socialis exhibits weak photobehavior and high-photoprotection ability.</a> PLoS One. 16 (10), 0259138 (2021).</li><li>Ueno, Y., Aikawa, S., Kondo, A., Akimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+light-harvesting+functions+of+unicellular+green+algae+to+different+light+qualities.">Adaptation of light-harvesting functions of unicellular green algae to different light qualities.</a> Photosynthesis Research. 139 (1-3), 145-154 (2019).</li><li>Takahashi, T., Watanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosynthesis+modulates+the+sign+of+phototaxis+of+wild-type+Chlamydomonas+reinhardtii.+Effects+of+red+background+illumination+and+3-(3',4'-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea.">Photosynthesis modulates the sign of phototaxis of wild-type Chlamydomonas reinhardtii. Effects of red background illumination and 3-(3',4'-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea.</a> FEBS Letters. 336 (3), 516-520 (1993).</li><li>Morishita, J., Tokutsu, R., Minagawa, J., Hisabori, T., Wakabayashi, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Chlamydomonas+reinhardtii+mutants+that+exhibit+strong+positive+phototaxis.">Characterization of Chlamydomonas reinhardtii mutants that exhibit strong positive phototaxis.</a> Plants (Basel). 10 (7), (2021).</li><li>Fujiu, K., Nakayama, Y., Yanagisawa, A., Sokabe, M., Yoshimura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chlamydomonas+CAV2+encodes+a+voltage-+dependent+calcium+channel+required+for+the+flagellar+waveform+conversion.">Chlamydomonas CAV2 encodes a voltage- dependent calcium channel required for the flagellar waveform conversion.</a> Current Biology. 19 (2), 133-139 (2009).</li><li>Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+sensors+of+ciliary+outer+arm+dynein:+functions+and+phylogenetic+considerations+for+eukaryotic+evolution.">Calcium sensors of ciliary outer arm dynein: functions and phylogenetic considerations for eukaryotic evolution.</a> Cilia. 4 (1), 6 (2015).</li></ol>

Den nåværende protokollen er enkel og ikke tidkrevende. Hvis en C. reinhardtii mutant mistenkes for å presentere med feil i fotoreception eller ciliary bevegelse, kan denne metoden tjene som primær fenotypisk analyse.
Det finnes imidlertid noen kritiske trinn. Det ene er å bruke celler i eksperimentet i vekstfasen tidlig til midt i loggen. Etter dyrking i lange perioder blir cellene mindre motile, mindre lysfølsomme og danner til og med palmelloider (celleklumper)<sup class="xre...

Lys er en uunnværlig energikilde for fotosyntetiske organismer, men for mye lys kan forårsake fotooksidativ skade. Dermed må fototrofiske organismer overleve under moderat intensitetslys, hvor de kan fotosyntetisere, men ikke lide fotooksidativ skade1. I landplanter kan kloroplaster ikke bevege seg ut av bladet og vise fotobevegelser i cellen; kloroplaster beveger seg til periferien av cellen under høyt lys og celleoverflaten under lite lys2, mens mange motile alger viser fotobehaviors som gjør at de kan finne riktige lysforhold for fotosyntese og dermed lette deres overlevelse3.
Chlamydomonas reinhardtii er en unicellular grønn alge betraktet som en modellorganisme innen forskningsfelt som cilia (også kalt flagella), fotosyntese og fotobehavior. C. reinhardtii presenterer med en øyenskygge og to cilia per celle, som brukes til henholdsvis fotoreception og svømming. Øyepotten har to komponenter: channelrhodopsins (ChRs), lysportede ionkanaler i plasmamembranen og de karotenoidrike granulatlagene som ligger rett bak ChRs. Øyepotten fungerer som en retningslysreseptor siden de karotenoidrike granulatlagene fungerer som en lysreflektor 4,5.
ChRs ble opprinnelig identifisert som fotoreseptorer som forårsaker fotobehaviors i C. reinhardtii 6,7,8,9. Selv om to isoformer, ChR1 og ChR2, finnes i øyepotet, viste knock-down eksperimenter at ChR1 er den primære fotoreseptoren for fotobehaviors10. Til tross for dette har ChR2 fått mer oppmerksomhet og spilt en sentral rolle i utviklingen av optogenetikk, en teknikk for å kontrollere celleeksitasjon med lys11. Derfor vil det å studere reguleringsmekanismene som styrer fotobehaviors i C. reinhardtii fremme forståelsen av ChR-funksjonen og forbedre optogenetikken.
Etter fotoreception viser C. reinhardtii celler to typer fotobehaviors: fototaxis og photoshock respons12. Phototaxis er oppførselen til celler som svømmer i retning av lyskilden eller motsatt retning, henholdsvis kalt positiv eller negativ fototaxis. Photoshock-respons er en oppførsel som celler viser etter å ha merket en plutselig endring i lysintensiteten, for eksempel når de er opplyst av et blits. Celler slutter å svømme eller svømme bakover (dvs. svømme med cellekroppen fremover) i en kort periode, vanligvis <1 s.
Ciliary bevegelser i C. reinhardtii er involvert i sine fotobehaviors. To cilia slår vanligvis som et menneskes brystsvømming, og dette er modulert for fotobehaviors. For fototaxis er kreftene generert av de to cilia ubalansert ved modulering av slagfrekvensen og bølgeformamplituden til hvert cilium13. Cilium nærmest øyepotten kalles cis cilium, og den andre kalles trans cilium. Disse to ciliaene er forskjellige på ulike punkter. For eksempel er ciliary slåfrekvensen til trans cilium in vitro 30% -40% høyere14. I tillegg er deres Ca2 + følsomhet forskjellig. Reaktivering av demembranerte cellemodeller15 viste at cis cilium slår sterkere enn trans-ciliumet for Ca 2+ <1 x 10-8 M, mens det motsatte gjelder for Ca2+ >1 x 10−7 M. Denne asymmetrien i Ca2 + følsomhet er muligens viktig for fototaktiske svinger siden mutanter som mangler denne asymmetrien ikke viser normal fototaxis16,17. Omvendt er bølgeformkonvertering nødvendig for photoshock. Den ciliære bølgeformen forvandles fra den asymmetriske bølgeformen i fremoversvømming til den symmetriske bølgeformen i bakoversvømming. Denne bølgeformkonverteringen er også regulert av Ca2+, med en terskel på 1 x 10−4 M18,19. Siden defekter i regulering av ciliary bevegelser forårsaker primær ciliary dyskinesi hos mennesker, studere fotobehaviors i C. reinhardtii kan bidra til bedre forståelse av disse sykdommene og terapeutisk utvikling20.
Heri demonstreres fire enkle metoder for å observere fotobehaviors i C. reinhardtii . For det første vises en fototaxis-analyse ved hjelp av Petri-retter, og for det andre en fototaxis-analyse mot cellefjæringsdråper. Fenomenet observert i begge tilfeller er ikke strengt fototaxis, men fotoakkumulering, hvor cellene har en tendens til å samle seg nær lyskildesiden eller motsatt side. I C. reinhardtii er fotoakkumulering hovedsakelig forårsaket av fototaxis på en måte som kan brukes som en tilnærming til fototaxis. For det tredje vises en strengere analyse for fototaxis under et mikroskop, og sist er en photoshock-analyse under et mikroskop.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL conical tube</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mm Cannonball green LED</td>
			<td>Optosupply</td>
			<td>OSPG5161P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AC adaptor for the light box</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>2196161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cell counter</td>
			<td>DeNovix</td>
			<td>CellDrop BF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>06731-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera flash</td>
			<td>NEWWER</td>
			<td>TT560</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>KUBOTA</td>
			<td>2800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlamydomonas strains CC-124 and CC-125</td>
			<td>Chlamydomonas Resource Center</td>
			<td></td>
			<td>https://www.chlamycollection.org/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-mout CCD camera</td>
			<td>Wraymer</td>
			<td>1129HMN1/3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desktop darkroom</td>
			<td>Scientex</td>
			<td>B-S8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital still camera</td>
			<td>SONY</td>
			<td>RX100II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>G002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://fiji.sc/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green LED plate</td>
			<td>CCS</td>
			<td>ISLM-150X150-GG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Fujifilm WAKO</td>
			<td>080-01066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>GB70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>238514-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lightbox (Flat viewer)</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>2196160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX-53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (&#966;3.5 cm)</td>
			<td>IWAKI</td>
			<td>1000-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pottasium acetate</td>
			<td>Nakalai tesque</td>
			<td>28434-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power supply for the green LED plate</td>
			<td>CCS</td>
			<td>ISC-201-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red filter</td>
			<td>Shibuya Optical</td>
			<td>S-RG630</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

observation of photobehavior in chlamydomonas reinhardtii

For motile fototrofiske mikroorganismers overlevelse er det avgjørende å være under riktige lysforhold. Følgelig viser de fotoindusert atferd (eller fotobehavior) og endrer bevegelsesretningen som svar på lys. Typiske fotobehaviors inkluderer photoshock (eller fotofobisk) respons og fototaxis. Photoshock er et svar på en plutselig endring i lysintensiteten (f.eks. blitsbelysning), der organismer midlertidig slutter å bevege seg eller beveger seg bakover. Under fototaxis beveger organismer seg mot lyskilden eller i motsatt retning (henholdsvis kalt positiv eller negativ fototaxis). Den encellede grønne algen Chlamydomonas reinhardtii er en utmerket organisme for å studere fotobehavior fordi den raskt endrer svømmemønsteret ved å modulere juling av cilia (også kalt flagella) etter fotoreception. Her vises ulike enkle metoder for å observere fotobehaviors i C. reinhardtii. Forskning på C. reinhardtiis fotobehaviors har ført til oppdagelsen av vanlige regulatoriske mekanismer mellom eukaryotisk cilia og channelrhodopsins, noe som kan bidra til en bedre forståelse av ciliopatier og utvikling av nye optogenetiske metoder.

Typiske C. reinhardtii fototaxis og photoshock responsanalyser vises her. Etter celletetthetsestimering ble villtypecellekultur (et avkom av korset CC-124 × CC-125 med agg1 + mt -)23 vasket med fotobehavior eksperimentell løsning for fototaxis parabolen analysen. Celleopphenget ble plassert under svakt rødt lys i ~ 1 time. En 2 ml celle suspensjon ble plassert i en 3,5 cm Petri tallerken. Petri-parabolen ble ristet forsiktig, satt på en lysboks og fotografert med et kamera festet på ...

Watch this Scientific Journal Video about Observation of Photobehavior in Chlamydomonas reinhardtii at JoVE.com

Observation of Photobehavior in Chlamydomonas reinhardtii

De fleste svømmende fotoautotrofiske organismer viser fotoinduserte atferdsendringer (fotobehavior). Den nåværende protokollen observerer nevnte fotobehavior i modellorganismen Chlamydomonas reinhardtii.

Observasjon av Photobehavior i Chlamydomonas reinhardtii

For the survival of the motile phototrophic microorganisms, being under proper light conditions is crucial. Consequently, they show photo-induced ...

Det viktigste spørsmålet denne metoden adresserer er, hvis en stamme av interessante Chlamydomonas beholder evnen til fotoatferd eller ikke. Denne metoden er enkel, rask og enkel å teste hvis en belastning av interessant viser fotoatferd. Denne metoden kan bidra til fotobiologi og cellebiologi av ciliary motility.Atsuko Isu, en labtekniker fra laboratoriet mitt, demonstrerer prosedyren. Til å begynne med, legg til to til tre milliliter celleoppheng i en 3,5 centimeter Petri-tallerken og legg parabolen på en lysboks. Rist parabolen forsiktig for å fordele cellene jevnt og få et bilde før belysning.Lys opp retten fra den ene siden med en grønn lysdiode eller LED i et mørkt skrivebordrom. La parabolen stå i ca. fem minutter før du skaffer bilder. For fototaxisanalyse ved hjelp av cellekulturdråper, plasser 25 mikroliter celleopphengsdråper direkte på en hvit plastplate ved hjelp av en mikropipette.Lys opp dråpene fra den ene siden med en grønn LED i et mørkt skrivebord og la dem stå i tre minutter før du skaffer bilder. Plasser 30 mikroliter cellefjæring på en glasssklie og legg en 18 x 18 millimeter dekselskli med avstandsstykker på siden. Lys prøvene fra den ene siden av dekselslippet uten avstandsstykke med grønn LED, og observer cellene under et darkfield-mikroskop med en 10X objektiv linse under svakt rødt lys.Etter lysbelysning, ta opp cellebelysningen i 20 sekunder ved hjelp av et kamerautstyrt mikroskop. For fotohockresponsanalysen plasserer du 30 mikroliter cellefjæring på en glasssklie, og plasserer en dekselglidning med avstandsstykker på toppen av lysbildet. Vær oppmerksom på cellen under et mikroskop med svakt rødt lys.Påfør blitsbelysning ved hjelp av en kamerablits mens du registrerer cellebevegelsen. Et representativt eksempel på negativ fototaxis i Chlamydomonas reinhardtii etter fem minutter med sidebelysning vises her. De fleste cellene akkumulert på motsatt side av lyskilden.I fotohock-responsanalysen viste nesten alle cellene photoshock-responsen. Cellene svømte bakover i en kort periode og gjenvunnet fremover svømming. For å utføre denne prosedyren, bruk aridimigudolphase celler og eksponere dem for det røde lyset før analysen.Hvis de ikke utsettes for det røde lyset, blir cellene ufølsomme for lyset. Denne teknikken isolerer ulike mutanter med unormal fototaxis av photoshock-responser. I tillegg er det identifisert ulike intracellulære og ekstracellulære faktorer som påvirker fotoatferd.

Research

JoVE Journal

Biology

Observation of Photobehavior in Chlamydomonas reinhardtii

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Grunnleggende<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering og observasjon

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Flat Mount Preparation for Observation and Analysis of Zebrafish Embryo Specimens Stained by Whole Mount In situ Hybridization

Flat Mount Forberedelse for observasjon og analyse av Sebrafisk Embryo prøver farget av Whole Mount<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering

The zebrafish embryo is now commonly used for basic and biomedical research to investigate the genetic control of developmental processes and to model ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Internalisering og Observasjon av Fluorescent biomolekyler i levende mikroorganismer via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observasjon og Kvantifisering av telomere og repeterende sekvenser med fluoresens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH) med PNA prober i<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Observasjon og Kvantifisering av Mating Behavior i Pinewood nematode,<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

Dissection and Observation of Honey Bee Dorsal Vessel for Studies of Cardiac Function

Disseksjon og Observasjon av Honey Bee Dorsal Vessel for studier av hjertefunksjonen

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

Utarbeidelse og Observasjon av Thick biologiske prøver av Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolasjon og fluorescens Imaging for Single-partikkel rekonstruksjon av Chlamydomonas Centrioles

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

Reactivation of Demembranated Cell Models in Chlamydomonas reinhardtii

Reaktivering av demembranerte cellemodeller i Chlamydomonas reinhardtii

Since the historical experiment on the contraction of glycerinated muscle by adding ATP, which Szent-Gy&#246;rgyi demonstrated in the mid-20th century, in ...