Name: retinal explant of the adult mouse retina as an ex vivo model for studying retinal neurovascular diseases
Uploaded: 2022-12-09T12:55:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases at JoVE.com

Nos gustaría agradecer la subvención de financiación del Instituto Nacional de Salud (NIH) al Instituto Nacional del Ojo (R01 EY030054) al Dr. Mohamed Al-Shabrawey. Nos gustaría agradecer a Kathy Wolosiewicz por ayudarnos con la narración del video. Nos gustaría agradecer al Dr. Ken Mitton, del laboratorio de Investigación Pediátrica de la Retina del Instituto de Investigación del Ojo, Universidad de Oakland, por su ayuda durante el uso del microscopio quirúrgico y la grabación. Este video fue editado y dirigido por el Dr. Khaled Elmasry.

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Oakland, Rochester, MI, EE.UU. y siguieron las pautas establecidas por la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO) Declaración para el Uso de Animales en Investigación Oftálmica y de la Visión.
1. Preparación de animales
<ol><li>Mantenga a los animales alojados bajo una temperatura constante en un ambient...

Nuestro laboratorio ha estado estudiando los cambios fisiopatológicos que promueven la disfunción microvascular retiniana durante años 31,32,33,34,35,36. Los explantes de retina son una de las técnicas que pueden ser de gran valor para utilizar como modelo para estudiar enfermedades de la retina como la retinopatía diab?...

Se han presentado diferentes modelos para estudiar enfermedades de la retina, incluyendo modelos tanto in vivo como in vitro. El uso de animales en la investigación sigue siendo un tema de continuo debate ético y traslacional1. Los modelos animales que involucran roedores como ratones o ratas se utilizan comúnmente en la investigación de la retina 2,3,4. Sin embargo, han surgido preocupaciones clínicas debido a las diferentes funciones fisiológicas de la retina en roedores en comparación con los humanos, como la ausencia de la mácula o las diferencias en la visión del color5. El uso de ojos postmortem humanos para la investigación de la retina también tiene muchos problemas, incluyendo pero no limitado a las diferencias en los antecedentes genéticos de las muestras originales, el historial médico de los donantes y los entornos o estilos de vida previos de los donantes6. Además, el uso de modelos in vitro en la investigación de la retina también tiene algunos inconvenientes. Los modelos de cultivo celular utilizados para estudiar enfermedades de la retina incluyen la utilización de líneas celulares de origen humano, células primarias o células madre7. Se ha demostrado que los modelos de cultivo celular utilizados tienen problemas en términos de contaminación, identificación errónea o desdiferenciación 8,9,10,11. Recientemente, la tecnología de organoides retinianos ha mostrado un progreso significativo. Sin embargo, la construcción de retinas altamente complejas in vitro tiene varias limitaciones. Por ejemplo, los organoides retinianos no tienen las mismas características fisiológicas y bioquímicas que las retinas maduras in vivo. Para superar esta limitación, la tecnología de organoides retinianos debe integrar más características biológicas y celulares, incluidas las células musculares lisas, la vasculatura y las células inmunes como la microglía12,13,14,15.
Los explantes organotípicos de retina se han convertido en una herramienta confiable para el estudio de enfermedades retinianas como la retinopatía diabética y las enfermedades degenerativas de la retina16,17,18,19. En comparación con otras técnicas existentes, el uso de explantes retinianos apoya tanto los cultivos celulares de retina in vitro como los modelos animales in vivo actuales al agregar una característica única para estudiar la diafonía entre varias células de la retina bajo los mismos parámetros bioquímicos e independientes de variables sistémicas. Los cultivos de explante permiten que diferentes células de la retina se mantengan juntas en el mismo ambiente, permitiendo la preservación de las interacciones intercelulares retinianas20,21,22. Además, un estudio previo mostró que los explantes retinianos fueron capaces de preservar la estructura morfológica y la funcionalidad de las células retinianas cultivadas23. Por lo tanto, los explantes de retina pueden proporcionar una plataforma decente para investigar posibles dianas terapéuticas para una amplia variedad de enfermedades de la retina24,25,26. Los cultivos de explantes retinianos proporcionan una técnica controlable y son un sustituto muy flexible de los mothods existentes que permiten numerosas manipulaciones farmacológicas y pueden descubrir varios mecanismos moleculares27.
El objetivo general de este trabajo es presentar la técnica de explante de retina como un sistema modelo intermedio razonable entre cultivos celulares in vitro y modelos animales in vivo . Esta técnica puede imitar las funciones de la retina de una mejor manera que las células disociadas. Como varias capas retinianas permanecen intactas, las interacciones intercelulares retinianas pueden ser evaluadas en el laboratorio bajo condiciones bioquímicas bien controladas e independientes del funcionamiento del sistema vascular28.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adult C57Bl/6J mice&#160;</td>
			<td>The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 04609, USA</td>
			<td>664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-in-One Fluorescence Microscope&#160;</td>
			<td>KEYENCE CORPORATION OF AMERICA, IL, 60143, U.S.A.</td>
			<td>BZ-X800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 supplements</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>Gibco #17504-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blockade blocking solution&#160;</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>B10710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM F12</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>Gibco #11320033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG.</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>F-2765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GSL I, BSL I (Isolectin)</td>
			<td>Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA</td>
			<td>B-1105-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Ballanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>Gibco #14175095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Scissors, 12 cm, Diamond Coated Blades</td>
			<td>World Precision Instruments,FL 34240, USA&#160;</td>
			<td>Straight (503365)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplements</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>Gibco #17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>140652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde 4% in PBS</td>
			<td>BBP, Ashland, MA, 01721 USA</td>
			<td>C25N107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>15140148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PROLONG DIAMOND ANTIFADE 4&#8242;,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</td>
			<td>Thermo scientific. Waltham, MA, 02451, USA</td>
			<td>P36962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-NeuN Antibody</td>
			<td>Abcam.,Cambridge, UK</td>
			<td>ab177487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Antibody</td>
			<td>Dako,Carpinteria, CA 93013, USA.</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Texas Red</td>
			<td>Vector Laboratories. Burlingame, CA 94010,USA</td>
			<td>SA-5006-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TritonX</td>
			<td>BioRad Hercules, CA,&#160; 94547,USA</td>
			<td>1610407</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retinal explant of the adult mouse retina as an ex vivo model for studying retinal neurovascular diseases

Uno de los desafíos en la investigación de la retina es estudiar la diafonía entre diferentes células de la retina, como las neuronas de la retina, las células gliales y las células vasculares. Aislar, cultivar y mantener las neuronas de la retina in vitro tiene limitaciones técnicas y biológicas. El cultivo de explantes de retina puede superar estas limitaciones y ofrecer un modelo ex vivo único para estudiar la diafonía entre varias células de la retina con parámetros bioquímicos bien controlados e independientes del sistema vascular. Además, los explantes de retina son una herramienta de cribado eficaz para estudiar nuevas intervenciones farmacológicas en diversas enfermedades vasculares y neurodegenerativas de la retina, como la retinopatía diabética. Aquí, describimos un protocolo detallado para el aislamiento y cultivo de explantes de retina durante un período prolongado. El manuscrito también presenta algunos de los problemas técnicos durante este procedimiento que pueden afectar los resultados deseados y la reproducibilidad del cultivo de explante de retina. La inmunotinción de los vasos retinianos, las células gliales y las neuronas demostró capilares retinianos intactos y células neurogliales después de 2 semanas desde el comienzo del cultivo de explante retiniano. Esto establece los explantes de retina como una herramienta confiable para estudiar los cambios en la vasculatura retiniana y las células neurogliales en condiciones que imitan enfermedades de la retina como la retinopatía diabética.

Supervivencia de las células retinianas neuronales y vasculares del explante retiniano en medios de cultivo ex vivo durante un tiempo prolongado Al cultivar un explante de retina utilizando nuestro protocolo, tuvimos éxito en el mantenimiento de diferentes células de la retina que eran viables hasta por 2 semanas. Para verificar la presencia de diferentes células retinianas, se realizó una tinción de inmunofluorescencia del explante retiniano utilizando...

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Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

Este protocolo presenta y describe los pasos para el aislamiento, disección, cultivo y tinción de explantes de retina obtenidos de un ratón adulto. Este método es beneficioso como modelo ex vivo para estudiar diferentes enfermedades neurovasculares de la retina como la retinopatía diabética.

Explante retiniano de la retina de ratón adulto como modelo ex vivo para el estudio de enfermedades neurovasculares retinianas

One of the challenges in retina research is studying the cross-talk between different retinal cells such as retinal neurons, glial cells, and vascular ...

Uno de los desafíos en la investigación de la retina es estudiar la diafonía entre diferentes células, como las neuronas de la retina, las células gliales y las células vasculares. En particular, el aislamiento y el cultivo de las neuronas de la retina es un desafío. Creemos que el explante retiniano cultivado puede superar esta limitación y ofrecer un sistema ex vivo único que nos permita estudiar la diafonía entre diferentes células de la retina, bajo parámetros bioquímicos bien controlados e independientes del sistema vascular.Además, un explante de retina es una herramienta de cribado destacada para estudiar nuevas intervenciones farmacológicas en diversas enfermedades retinovasculares y neurodegenerativas, como la retinopatía diabética, que se caracteriza por lesiones vasculares y neuronales. Nuestro laboratorio ha estado estudiando los cambios fisiopatológicos, promoviendo la disfunción microvascular de la retina durante años. La utilización de una amplia variedad de modelos, incluidos los modelos in vivo e in vitro, nos permitió optimizar muchas técnicas dentro de nuestro laboratorio.Aquí, describimos un protocolo detallado para los explantes de retina derivados de un ratón adulto de tipo salvaje que se puede mantener en cultivo durante dos semanas. Mantenga a los animales alojados bajo temperatura constante y ambiente con luz controlada. Inspeccione la salud, la alimentación adecuada y el agua de cada animal.Asegúrese de proporcionar a los animales alimentos frescos y agua limpia. Cambie las jaulas sucias diariamente o según sea necesario para la salud de los animales. Use ratones machos negros 6 de más de 12 semanas de edad.Eutanasia de los animales en su jaula doméstica por inhalación de sobredosis de dióxido de carbono. Después de completar el procedimiento, confirme la muerte del animal mediante un método apropiado, como confirmar un paro cardíaco y respiratorio u observar las pupilas fijas y dilatadas del animal. Siga la confirmación de la muerte mediante un método secundario de eutanasia, como la luxación cervical.Aplique presión sobre la órbita usando pinzas curvas hasta que el globo sobresalga. Cierre suavemente los fórceps en la porción posterior del ojo y levántelos en un movimiento continuo. Sumerja el globo ocular en un tubo de 1,5 mililitros que contenga un HBSS helado de un mililitro.Transfiera el globo ocular a un tubo de 1,5 o dos mililitros que contenga medios completos. Ahora está listo para la disección. Este diagrama ilustra los pasos consecutivos que se mostrarán para diseccionar el globo ocular del ratón para crear el explante de retina.La incisión circunferencial se hace a lo largo del limbo para abrir el globo ocular. La córnea se extrae mediante disección a lo largo de la incisión limbal. Luego se retiran el cristalino y el vítreo, dejando un ocular vacío.Al sostener la región de la cabeza del nervio óptico con los fórceps finos, se despega suavemente la capa externa del ojo. Gran atención durante la extracción de la capa externa para no lesionar la retina neural y tener la retina totalmente intacta. Luego, la retina se cortará en trozos más pequeños.Esto será una gran ventaja, porque te permitirá tener un experimento donde tu grupo de control y grupos experimentales se derivan del mismo animal. Sin embargo, cortar la retina en trozos pequeños hará que su manejo sea más difícil. Por lo tanto, desarrollamos una técnica para el manejo de estas pequeñas piezas retinianas para garantizar la orientación adecuada del cultivo de retina.Vaya con la hoja de tijera de disección abierta justo debajo de la pieza retiniana. Eleve lentamente la pieza retiniana con la punta de una hoja de tijera abierta y transfiérala suavemente a la placa de cultivo. Los explantes se transferirán por separado a inserciones de cultivo celular en placas de múltiples pocillos, cada una de las cuales contiene 300 microlitros de medios de explante retiniano con el lado de la retina neural hacia arriba.Los cultivos de explantes de retina se mantendrán en incubadoras humidificadas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Asegúrese de que la superficie de la retina esté orientada hacia arriba. Si la pieza retiniana está volteada o doblada, intente ajustarla suavemente a la orientación correcta.Si no se coloca el explante de retina en la orientación correcta con la retina neural hacia arriba, se producirá el fracaso del crecimiento adecuado de las células de la retina en cultivo. Aquí, podemos ver la inmunofluorescencia que tiñe los explantes retinianos teñidos en cultivo durante dos semanas. Los explantes se fijaron y se tiñeron con NeuN para las neuronas de la retina, GFAP para las células gliales y lectina para los vasos sanguíneos.La tinción mostró células retinianas y vasos retinianos bien desarrollados. Aquí, podemos ver tinción de inmunofluorescencia de explantes retinianos fijados y teñidos con GFAP para células gliales y lectina para vasos sanguíneos. Las imágenes muestran tinciones defectuosas y subdesarrollo tanto de las células de la retina como de los vasos retinianos.Esto se debe a que el explante retiniano estaba plegado y no estaba orientado correctamente sobre la placa de cultivo. Se debe tener mucho cuidado para la correcta orientación del explante con la retina hacia arriba. Que el grupo de control se derive del mismo animal que el grupo tratado hace que sea de gran ventaja tener una comparación más confiable de diferentes condiciones experimentales.Los implantes de retina pueden proporcionar una plataforma decente para investigar posibles objetivos terapéuticos para una amplia variedad de enfermedades de la retina, como la retinopatía diabética y las enfermedades degenerativas de la retina.

Research

JoVE Journal

Medicine

Retinal Explant of the Adult Mouse Retina as an Ex Vivo Model for Studying Retinal Neurovascular Diseases

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Desprendimiento de Retina modelo en roedores por inyección subretiniana de Hialuronato de Sodio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Investigación

Medicina

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Trasplante Subretinal De Macs Purificado Fotorreceptores Precursores De Células En La Retina Del Ratón Adulto

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo para estudiar la acción hormonal en el pecho humano

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Cuantitativa del fondo de ojo autofluorescencia para la Evaluación de Enfermedades de la Retina

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Un Paso a Paso Protocolo para la cirugía subretiniana en conejos

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

Un modelo agudo de retina para evaluar sanguíneos de la retina barrera violación, así como potenciales fármacos para el tratamiento

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

Etiquetado de colorantes fluorescentes de eritrocitos y leucocitos para estudiar la dinámica de flujo en la circulación de la retina del ratón

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

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Pasos de preparación para la medición de la reactividad en ratón arteriolas retinianas Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

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Estudiar la Diabetes a través de los ojos de un pez: Microdissection, visualización y análisis de la vasculatura de retina de pez cebra de adulto tg(fli:EGFP)

Diabetic retinopathy is the leading cause of blindness among middle-aged adults. The rising prevalence of diabetes worldwide will make the prevention of ...

Murine Precision-Cut Liver Slices as an Ex Vivo Model of Liver Biology

Rebanadas de hígado cortadas con precisión de la murino como modelo Ex Vivo de biología hepática

Understanding the mechanisms of liver injury, hepatic fibrosis, and cirrhosis that underlie chronic liver diseases (i.e., viral hepatitis, non-alcoholic ...