Name: intracerebroventricular delivery of gut-derived microbial metabolites in freely moving mice
Uploaded: 2022-06-02T14:15:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice at JoVE.com

我们感谢国立成功大学（NCKU）实验动物中心的工作人员照顾动物。这项工作得到了正兴医学基金会黄坤彦教授教育基金的奖学金支持;台湾科技部（MOST）的资助：（本科生研究MOST 109-2813-C-006-095-B）到T.-H.Y.;（大多数 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3） 至 W.-L.W.;以及高等教育萌芽项目，教育部到NCKU大学发展总部到W.-L.W。

所有实验方案和动物护理均已获得国立成功大学（NCKU）机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1.实验动物的准备
<ol><li>从供应商处获得6-8周龄的野生型C57BL / 6JNarl雄性小鼠。</li>
	<li>将小鼠饲养在标准小鼠笼中，用标准老鼠食物和 随意消毒的水。 注意：NCKU实验动物中心的外壳条件为22±1°C温度，55%±10%湿度和13小时/ 11小时亮/暗循环。</li>
</ol><p cla...

肠道来源的代谢物与脑介导的疾病有关，没有太多精确的机制，部分原因是它们在体内的多个结合位点6，12，24。先前的报告表明，SCFAs可以作为G蛋白偶联受体的配体，表观遗传调节因子和体内多个部位的能量产生来源6，12。为了绕过源自外周的混杂因素（如免疫细胞、激素和自主?...

人体胃肠道含有影响宿主的各种微生物1，2，3。这些肠道细菌在利用宿主消耗的膳食成分时可以分泌肠道衍生的代谢物4，5。有趣的是，未在外周代谢的肠道代谢物可以通过循环转运到其他器官6。值得注意的是，这些分泌的代谢物可以作为肠脑轴的介质，定义为中枢神经系统和肠道之间的双向通信7。先前的研究表明，肠道衍生的代谢物可以调节动物的复杂行为和情绪8，9，10，11。
短链脂肪酸（SCFAs）是肠道微生物群在膳食纤维和难消化碳水化合物发酵过程中产生的主要代谢物6。乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐是肠道中含量最高的 SCFAs12。SCFA是胃肠道细胞的能量来源。肠道中未代谢的SCFA可以通过门静脉运输到大脑，从而调节大脑和行为6，12。先前的研究表明，SCFA可能在神经精神疾病中起关键作用6，12。例如，在自闭症谱系障碍（ASD）的动物模型BTBR T+ Itpr3tf / J（BTBR）小鼠中腹腔注射丁酸盐挽救了他们的社会缺陷13。接受来自抑郁受试者微生物群的抗生素处理的大鼠显示出焦虑样行为和粪便SCFAs的增加14。临床上，与通常的对照组相比，在ASD患者中观察到粪便SCFAs水平的变化15，16。抑郁症患者的粪便SCFAs水平低于健康受试者17，18。这些研究表明，SCFAs可以通过各种途径改变动物和人类的行为。
微生物代谢物对体内多个部位产生多种影响，影响宿主生理和行为4，19，包括胃肠道、迷走神经和交感神经。当通过外周途径施用代谢物时，很难确定肠道来源代谢物在大脑中的确切作用。本文提出了一种基于视频的方案，用于研究肠道衍生代谢物对自由移动的小鼠大脑的影响（图1）。我们发现，在行为测试期间，可以通过引导套管急性给予SCFA。代谢物的类型、体积和输注速率可以根据目的进行修改。可以调整插管部位，以探索肠道代谢物在特定大脑区域的影响。我们的目标是为科学家提供一种方法来探索肠道来源的微生物代谢物对大脑和行为的潜在影响。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Material</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41</td>
			<td>Pfizer</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A-21206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>AB153-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 &#956;m, PES, Sterile</td>
			<td>NEST</td>
			<td>121921LA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1016</td>
			<td>ACSF: 0.14 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine scrub 2%</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-611-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhexidine solution</td>
			<td>Phoenix</td>
			<td>NDC 57319-599-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial dummy</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>62004</td>
			<td>Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial guide cannul</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>62104</td>
			<td>Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial injector</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>62204</td>
			<td>Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td>ACSF: 0.61 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental acrylic</td>
			<td>HYGENIC</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixing screws</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>62521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB104139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>16050130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BBraun</td>
			<td>XG-LBB-9151133S-1BX</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane&#160;</td>
			<td>Panion &#38; BF biotech</td>
			<td>DG-4900-250D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td>ACSF: 0.19 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketoprofen&#160;</td>
			<td>Swiss Pharmaceutical</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine&#160;</td>
			<td>AstraZeneca</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low melting point agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td>ACSF: 0.19 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope cover slips</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>101242</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4951PLUS-001E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil light, white NF</td>
			<td>Macron Fine Chemicals</td>
			<td>MA-6358-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td>ACSF: 7.46 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>ACSF: 0.18 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>ACSF: 1.76 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue)</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>3M Vetbond</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural tracer&#160;</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-358883</td>
			<td>FluoroGold</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene tube</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>62329</td>
			<td>OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puralube Vet (eye) Ointment</td>
			<td>Dechra&#160;</td>
			<td>12920060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>SCFAs: 13.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium butyrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B5887</td>
			<td>SCFAs: 8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium propionate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1880</td>
			<td>SCFAs: 5.18 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless guide cannula</td>
			<td>Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>OD 0.63 mm; Local vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stainless injector</td>
			<td>Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD.</td>
			<td>n/a</td>
			<td>OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superglue</td>
			<td>Krazy Glue</td>
			<td>KG94548R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.08603.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannula holder</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>B485-68217</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceiling camera</td>
			<td>FOSCAM</td>
			<td>R2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital stereotaxic instruments</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>INNOVIEW</td>
			<td>SEM-HT/TW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bead Sterilizer</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>RS1501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating pad</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>53800M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica microscope&#160;</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DM2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5136</td>
			<td>Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4&#34; Length&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5918</td>
			<td>4.5&#34; Angled Sharp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection controller</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>MICRO2T</td>
			<td>SMARTouch Controller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection syringe pump</td>
			<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
			<td>UMP3T-1</td>
			<td>UltraMicroPump3&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80014</td>
			<td>10 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Fiber Cold Light with double Fiber</td>
			<td>Step</td>
			<td>LGY-150</td>
			<td>Local vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pet trimmer</td>
			<td>WAHL</td>
			<td>09962-2018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaporiser for Isoflurane</td>
			<td>Step</td>
			<td>AS-01</td>
			<td>Local vendor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal behavior video tracking software</td>
			<td>Noldus</td>
			<td>EthoVision</td>
			<td>Version: 15.0.1416</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Application Suite X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LASX</td>
			<td>Version: 3.7.2.22383</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

intracerebroventricular delivery of gut-derived microbial metabolites in freely moving mice

肠道微生物群及其代谢物对宿主生理和行为的影响在这十年中得到了广泛的研究。大量研究表明，肠道微生物群衍生的代谢物通过宿主中复杂的肠脑通路调节大脑介导的生理功能。短链脂肪酸（SCFA）是肠道微生物组在膳食纤维发酵过程中产生的主要细菌衍生代谢物。来自肠道的分泌的SCFA可以在外周的多个部位起作用，由于SCFAs受体的广泛分布，影响免疫，内分泌和神经反应。因此，通过口服和腹膜内给药来区分SCFAs的中枢效应和外周效应具有挑战性。本文提出了一种基于视频的方法，通过引导套管在自由移动的小鼠中询问SCFAs 在 大脑中的功能作用。大脑中SCFA的数量和类型可以通过控制输注量和速率来调节。这种方法可以为科学家提供一种方法来了解肠道衍生代谢物在大脑中的作用。

在引导套管植入恢复后1周向小鼠注入SCFAs，以评估新型笼子中的运动活动。将小鼠放置在一个新的笼子中，并在前5分钟（输送速率为7nL / s）通过植入大脑侧脑室的商业引导套管向大脑注入2，100nL SCFAs或ACSF。输注后再记录30分钟新笼中的运动活动。在SCFAs和ACSF输注之间的新笼子中的运动活动没有观察到差异（图6）（每组n = 2只小鼠;数据显示为平均±s.e.m.并通过双向方差分析?...

Watch this Scientific Journal Video about Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice at JoVE.com

Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice

肠道来源的微生物代谢物具有多方面的作用，导致动物的复杂行为。我们的目标是提供一种循序渐进的方法，通过引导套管通过脑室内输送来描述肠道来源的微生物代谢物在大脑中的作用。

自由移动小鼠中肠道来源的微生物代谢物的脑室内递送

The impact of gut microbiota and their metabolites on host physiology and behavior has been extensively investigated in this decade. Numerous studies have ...

肠道微生物群释放的代谢物对宿主产生复杂的影响。该协议提供了一种询问肠道代谢物在小鼠大脑和行为中的作用的方法。该技术提供了一种精确，细致且经过验证的方法，可将自由移动的小鼠的肠道代谢物输送到大脑中。我们为深入了解肠脑轴研究提供了全面和生理学的最佳方法。将鼠标放在立体定位框架上，并将鼠标门牙固定在立体定位门牙支架中的门牙杆上。用鼻锥面罩遮住鼻子。然后通过顶部捏反射评估小鼠的伤害感受，并确保在切开手术部位之前保持恒定的呼吸频率。一旦用胶带去除头上修剪过的皮毛，皮下注射镇痛药酮洛芬以缓解疼痛并涂抹眼膏。接下来，通过将尖头耳杆插入耳道来固定头部。拧紧门牙支架上的鼻夹，轻轻按压头部以确保头部固定。使用3次氯己定拭子交替擦洗对头皮进行消毒。现在，使用解剖手术刀在头皮上以前后方式切开小于一厘米的切口。打开切口后，用微解剖钳固定的棉签擦拭头骨。根据立体定位坐标，识别并标记手稿中描述的右侧心室位置。接下来，使用立体定位钻在标记部位的头骨上钻一个孔，然后在头骨上再钻两到四个孔。用利多卡因棉签擦拭头骨，并在孔上安装 2 到 4 个不锈钢螺钉。将商业导向套管放在立体定位套管支架上，并在150摄氏度下用玻璃速度灭菌器进行消毒。然后，将立体定位套管支架移动到为侧脑室钻孔的孔中，并将商业导向套管缓慢插入孔中，直到达到所需的深度。现在涂上10微升氰基丙烯酸正丁酯粘合剂，将商业导引套管固定在钻孔中，等待3至4分钟。从立体定位套管支架中轻轻松开商业导引套管，然后将亚克力牙科涂在切开的头皮上以固定商业导引套管并等待至少 5 分钟。将商业假人植入商业导引套管中。然后，将鼠标放入一个新的笼子中，下面有一个加热垫，以便从麻醉中恢复，并不断观察直到小鼠完全醒来。将装有10微升蒸馏水的微升注射器安装在显微注射泵上。使用胰岛素注射器，用蒸馏水填充聚乙烯管，并将微升注射器连接到悬挂的聚乙烯管。打开显微注射控制器并按显示所有通道以访问命令屏幕。接下来，按配置并将体积目标设置为 9， 800 纳升，输送速率为每秒 100 纳升。然后按方向切换到注入模式，并按运行从连接到微升注射器的聚乙烯管注入9， 800纳升蒸馏水。现在，将注射器放入装有矿物油的小瓶中，按压配置并将体积目标设置为3， 000纳升，输送速率为每秒100纳升。要提取 3， 000 纳升矿物油，请按方向切换到提取模式，然后按运行。从微升注射器针头上拆卸聚乙烯管。要从微升注射器针头中吐出 3， 000 纳升蒸馏水，请按方向切换到输注模式并按运行。然后将微升注射器插回聚乙烯管中。将注射器放入含有SCFA的小瓶中。按配置并将体积目标设置为 9， 500 纳升，输送速率为 100 纳升/秒。通过按方向提取9， 500纳升SCFA切换到提取模式并按运行。标记油 SCFA 相以验证 SCFA 是否成功注入。按配置并将所需的体积目标设置为每秒 7 纳升。按方向切换到注入模式。按运行向前注入微升注射器，直到液体从商业注射器的前端流出，然后将注射器插入套管以进行SCFAs注射。麻醉小鼠后，将商业注射器插入商业导引套管中。一旦小鼠从麻醉中恢复过来，将其放在一个新的笼子里，让它自由探索35分钟。在前 5 分钟内，目标体积为 2， 100 纳升，以每秒 7 纳升的输送速率注入 SCFA。然后按方向进入注入模式并按运行。行为测试后，从商业导引套管中取出商业注射器。以每秒7纳升的输送速率注入2， 100纳升的中性示踪剂，以验证输注部位。使用荧光显微镜对输注部位的荧光信号进行成像。ACSF和SCFAs注入的小鼠都在一个新的笼子中旅行总共35分钟。在SCFAs和ACSF输注之间的新笼中运动活动没有观察到差异。当注入商业引导套管时，在侧脑室和小鼠大脑的周围区域检测到荧光染料。同样，通过不锈钢导管输注导致在侧脑室和小鼠大脑周围区域检测信号。将这一程序与基于电路的神经技术相结合，将使科学家能够深入了解基于回路的大脑控制和肠道代谢物贡献的行为。这项技术为研究人员探索微生物群和代谢物在复杂的肠道脑轴中的作用铺平了道路。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

High-density EEG Recordings of the Freely Moving Mice using Polyimide-based Microelectrode

高密度的自由移动，使用基于聚酰亚胺的微电极的小鼠的脑电图记录

Electroencephalogram (EEG) indicates the averaged electrical activity of the neuronal populations on a large-scale level. It is widely utilized as a ...

科研

神经科学

Recording Single Neurons' Action Potentials from Freely Moving Pigeons Across Three Stages of Learning

自由移动鸽子穿越三个阶段学习记录单个神经元&#39;动作电位

While the subject of learning has attracted immense interest from both behavioral and neural scientists, only relatively few investigators have observed ...

Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method

使用新颖的方法在自由移动的新生大鼠中记录脑电图

EEG is a useful method to detect electrical activity in the brain. Moreover, it is a widely used diagnostic tool for various neurological conditions, such ...

Intracerebroventricular Treatment with Resiniferatoxin and Pain Tests in Mice

小鼠用树脂叶毒素和疼痛测试进行脑血管内治疗

The transient receptor potential vanilloid type 1 (TRPV1), a thermosensitive cation channel, is known to trigger pain in the peripheral nerves. In ...

Noninvasive EEG Recordings from Freely Moving Piglets

自由移动仔猪的无创脑电图记录

The method allows the recording of high-quality electroencephalograms (EEGs) from freely moving piglets directly in the pigpen. We use a one-channel ...

Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

自由运动大鼠脑电图记录过程中兴奋氨基酸的微透析

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...

Long-term Sensory Conflict in Freely Behaving Mice

自由生育小鼠的长期感觉冲突

Long-term sensory conflict protocols are a valuable means of studying motor learning. The presented protocol produces a persistent sensory conflict for ...

Hybrid Microdrive System with Recoverable Opto-Silicon Probe and Tetrode for Dual-Site High Density Recording in Freely Moving Mice

混合微驱系统,带可回收的光电探头和Tetrode,用于自由移动小鼠的双位点高密度记录

Multi-regional neural recordings can provide crucial information to understanding fine-timescale interactions between multiple brain regions. However, ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

多纤维光测量记录自由移动动物的神经活动

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...

Extracellular Electrophysiological Recording in the Motor Cortex of Mice

Multichannel Extracellular Recording in Freely Moving Mice

Advancements in Multichannel Extracellular Recording for Studying Neuronal Activity in Freely Moving Mice (Video) | JoVE

自由移动小鼠的多通道细胞外记录

The protocol aims to uncover the properties of neuronal firing and network local field potentials (LFPs) in behaving mice carrying out specific tasks by ...