Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منحة إلى يونغ يو من جامعة يوهانس كيبلر لينز (BERM16108001).

1. خطوط الخلايا DLBCL مع مافوسفاميد أو علاج دونوروبيسين للحث على الشيخوخة الخلوية
ملاحظة: يعمل البروتوكول أيضا مع الخلايا السرطانية الملتصقة. اعتمادا على حجم الخلية ، × البذور 1-2 10 5 خلايا في بئر واحد من صفيحة من 6 آبار وتحتضن اللوحة في حاضنة5 ٪ CO2 ، 37 درجة مئوي...

<ol>
	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication.">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li><li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness.">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li><li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence.">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).</li><li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer.">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li><li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype:+one+in+vivo+reality,+two+possible+definitions.">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li><li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer+and+aging.">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li><li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development.">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li><li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+senescence:+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer.">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

فحصت هذه الطريقة القدرة على دخول الشيخوخة لأربعة خطوط مختلفة من خلايا DLBCL عند العلاج الكيميائي ، مع التصوير الساطع المجال والقياس الكمي القائم على التدفق الخلوي. على مستوى الخلية الواحدة، نجحنا في اكتشاف المجموعات السكانية الشائخة الرئيسية C12FDG+EdU-Ki67+ في خلايا KARPAS422 وWSU-DLCL...

يمكن لمجموعة متنوعة من المحفزات أن تؤدي إلى الشيخوخة الخلوية، مما يتسبب في دخول الخلايا في حالة من توقف دورة الخلية المستقرة. وتشمل هذه المحفزات تغييرات الإشارات الجوهرية أو الضغوط الخارجية. تشمل الإشارات الجوهرية تقصير التيلومير التدريجي ، والتغيرات في بنية التيلومير ، والتعديل اللاجيني ، واضطرابات البروتيوستاسيس ، وخلل الميتوكوندريا ، وتنشيط الجينات الورمية. تشمل الضغوط الخارجية إشارات تلف الالتهاب و / أو الأنسجة ، والإشعاع أو العلاج الكيميائي ، والحرمان الغذائي1،2،3،4. من بين الأنواع المتميزة من الشيخوخة ، فإن الأكثر شيوعا والمدروسة جيدا هي الشيخوخة التكرارية ، والشيخوخة التي يسببها الجين الورمي (OIS) ، والشيخوخة الناجمة عن الإشعاع ، والشيخوخة الناجمة عن العلاج (TIS). OIS هي استجابة خلوية حادة للأضرار السامة الجينية الناجمة عن الإجهاد التكراري الناتج عن تنشيط الجينات الورمية الشاذة ويمكن أن تمنع إلى حد ما التقدم المرضي من آفة ما قبل الورم إلى ورم كامل. يحدث TIS عندما يتم الضغط على الخلايا السرطانية بواسطة أدوية العلاج الكيميائي أو الإشعاع المؤين 5,6.
يعتبر الشيخوخة سيفا ذا حدين في علم الأمراض بسبب طبيعته الديناميكية للغاية. تم وصفه في البداية بأنه آلية مفيدة لقمع الورم لإزالة الخلايا التالفة من المجموعة المنتشرة للخلايا المنقسمة ، وحماية الوظيفة الطبيعية للأعضاء وتثبيط نمو الورم7،8،9. ومع ذلك ، فقد أشارت الأدلة الناشئة إلى جانب مظلم من الشيخوخة. تفرز الخلايا الشائخة السيتوكينات الالتهابية ، والمعروفة باسم النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP) ، مما يؤدي إلى التليف والأعضاء غير الوظيفية ويعزز بدء الورم وتقدمه10. علاوة على ذلك، تخضع الخلايا السرطانية الشائخة لإعادة برمجة الجينات والتعبير الجيني بالتوازي مع إعادة تشكيل الكروماتين وتنشيط استجابة مستمرة لتلف الحمض النووي (DDR)11،12، واكتساب خصائص جديدة للخلايا السرطانية الجذعية3. على الرغم من أن الأورام القادرة على الشيخوخة تستجيب بشكل أفضل للتدخل العلاجي مقارنة بالأورام غير القادرة على الشيخوخة13 ، إلا أن استمرار الخلايا الشائخة قد يؤدي إلى سوء التشخيص على المدى الطويل إذا لم يتم تحديدها والقضاء عليها بشكل فعال بواسطة الأدوية المحلل للسينوليك5. في كلتا الحالتين ، فإن الطريقة الموثوقة لتقييم الشيخوخة ذات أهمية سريرية كبيرة ، ليس فقط لتشخيص العلاج العلاجي ولكن أيضا لتطوير استراتيجيات جديدة تستهدف الخلايا الشائخة.
بغض النظر عن المحفزات المختلفة ، تظهر الخلايا الشائخة بعض السمات الشائعة ، بما في ذلك التشكل الموسع والمسطح ومتعدد النوى مع فجوات كبيرة ، ونوى موسعة بشكل كبير ، وتشكيل هيتيروكروماتين مرتبط بالشيخوخة H3K9me3 (SAHF) في النواة ، والتراكم المستمر لعلامات تلف الحمض النووي γH2AX البؤر ، وتنشيط p53-p21CIP1 و Rb-p16INK4a الآليات التنظيمية لدورة الخلية ، والقبض على دورة الخلية G1 المستقرة ، والحث الهائل ل SASP ، ونشاط β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal)14. نظرا لعدم وجود علامة واحدة كافية لتحديد الشيخوخة ، فإن التلطيخ الأنزيمي لنشاط SA-β-gal ، والذي يعتبر المعيار الذهبي للكشف عن الشيخوخة ، عادة ما يتم دمجه مع تلطيخ كيميائي نسيجي مناعي ل H3K9me3 و Ki67 للكشف عن TIS15. ومع ذلك ، من الصعب تحديد SA-β-gal القائم على الكروموجينيك الكيميائي. هنا ، قمنا بدمج 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) للكشف عن SA-β-gal القائم على التألق (fSA-β-gal) مع تلطيخ الفلورسنت المناعي ل γH2AX و EdU-incorporated DNA لتحديد الخلايا الشائخة C12FDG + EdU-γH2AX + باستخدام نظام مقياس التدفق الخلوي المتقدم للتصوير ، والذي يجمع بين السرعة والحساسية والصور التفصيلية أحادية الخلية مع المعلومات المكانية التي لا يمكن توفيرها عن طريق قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري. تتيح هذه الطريقة التوليد السريع للصور عالية الدقة مما يسمح بتحديد مواقع إشارات الفلورسنت وتحديدها كميا داخل الخلايا ، مع ترخيص التحليل السريع لعينات متعددة من خلال بناء خطوط أنابيب قياسية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

يمكن أن تحفز أدوية العلاج الكيميائي تلف الحمض النووي الذي لا يمكن إصلاحه في الخلايا السرطانية ، مما يؤدي إلى موت الخلايا المبرمج أو الشيخوخة المبكرة. على عكس موت الخلايا الماصة ، فإن الشيخوخة هي آلية مختلفة اختلافا جوهريا تقيد انتشار الخلايا السرطانية. كشفت عقود من الدراسات العلمية عن الآثار المرضية المعقدة للخلايا السرطانية الشائخة في الأورام والبيئات الدقيقة التي تعدل الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية. تشير الأدلة الجديدة إلى أن الشيخوخة هي عامل تنبؤ قوي أثناء علاج السرطان ، وبالتالي فإن الكشف السريع والدقيق عن الخلايا الشائخة في عينات السرطان أمر ضروري. تقدم هذه الورقة طريقة لتصور واكتشاف الشيخوخة الناجمة عن العلاج (TIS) في الخلايا السرطانية. عولجت خطوط الخلايا اللمفاوية الكبيرة المنتشرة بالخلايا البائية (DLBCL) باستخدام المافوسفاميد (MAF) أو الدونوروبيسين (DN) وتم فحصها بحثا عن علامة الشيخوخة ، β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal) ، وعلامة تخليق الحمض النووي 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) ، وعلامة تلف الحمض النووي gamma-H2AX (γH2AX). يمكن أن يساعد تصوير مقياس التدفق الخلوي في توليد صور أحادية الخلية عالية الدقة في فترة زمنية قصيرة لتصور العلامات الثلاثة في الخلايا السرطانية وتحديدها كميا في وقت واحد.

تم إنشاء مصفوفة تعويض باستخدام برنامج تحليل الصور عن طريق تحميل البيانات المسجلة لعينات التحكم أحادية اللون. كما هو موضح في الشكل التكميلي S1 ، تم الكشف عن امتداد ضوئي لا يكاد يذكر (قيمة المعامل ≥ 0.1) من EdU إلى C12FDG بقيمة معامل المحادثة المتقاطعة 0.248 ، في حين أن المحادثة المتقاط...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

نقدم هنا طريقة قائمة على قياس التدفق الخلوي للتصور والقياس الكمي للعلامات المتعددة المرتبطة بالشيخوخة في الخلايا المفردة.

التصوير المتزامن والكشف القائم على قياس التدفق الخلوي لعلامات الشيخوخة الفلورية المتعددة في الخلايا السرطانية الشائخة الناجمة عن العلاج

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

يمكن لهذه الطريقة توليد صور عالية الدقة بسرعة تسمح بتحليل التوزيع المكاني وتحديد كمية إشارات الفلورسنت داخل الخلايا مع السماح بالتحليل السريع لعينات متعددة. يتم قياس الخلايا باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي المتقدم للتصوير ، والذي يجمع بين السرعة والحساسية والصور التفصيلية أحادية الخلية مع المعلومات المكانية التي تنتج بيانات فريدة لا يمكن توفيرها بواسطة قياس بصريات التدفقات أو الفحص المجهري. إحدى النصائح المهمة هي توفير خلايا كافية لإنشاء إعدادات الأداة ونقوم بتعليق الخلايا عند الكثافة العالية للقياسات.بصرف النظر عن هذا الحصول على البيانات هو مباشر ومشابه لقياس التدفق الخلوي التقليدي. قم أولا بإنشاء خطوط خلايا DLBCL كما هو موضح في المخطوطة. ثم أضف محلول EdU 10 ملليمولار بنسبة واحد إلى 1000 في مزرعة خلايا DLBCL واحتضن اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات بعد خلط اللوحة عن طريق الهزاز اللطيف.أخرج الصفيحة بعد الحضانة وأضف محلول كلوروكين 100 مللي مولا إلى تركيز نهائي من 75 ميكرومولار. تخلط عن طريق الهزاز بلطف وتحضن لمدة 30 دقيقة. ثم أضف 20 ملليمولار C12 FDG إلى تركيز نهائي من 20 ميكرومولار.بعد الخلط اللطيف ، احتضن الطبق لمدة ساعة واحدة كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، أضف محلول 100 ملليمولار 2-فينيل إيثيل-بيتا-د-ثيوغالاكتوسيد في واحد إلى 50 لوقف تلطيخ بيتا غال FSA. وقم بتدوير اللوحة بلطف للخلط.انقل الخلايا إلى أنابيب طرد مركزي معقمة سعة 15 ملليلتر وتدور بسرعة 100 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بمجرد التخلص من المادة الفائقة ، اغسل الخلايا بأربعة ملليلترات من PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 100 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم أعد تعليق كريات الخلايا في 500 ميكرولتر عند محلول تثبيت بارافورمالديهايد بنسبة 4٪.بعد 10 دقائق من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، قم بجهاز طرد مركزي عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الفائقة واغسل الخلايا بأربعة ملليلترات من PBS مرتين وأجهزة الطرد المركزي بسرعة 100 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الغسيل ، تخلص من supernatant وأعد تعليق بيليه الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لنفاذية الصابونين.الآن انقل التعليق إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. اضرب الخلايا عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية واحتضنها عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها، في الظلام.الطرد المركزي للأنابيب عند 250 مرة G لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من السوبر ناتانت واغسله ب 100 ميكرولتر من محلول غسيل الصابونين. بعد غسل الخلايا مرتين ، تخلص من supernatant وأعد تعليق كريات الخلايا في 500 ميكرولتر من كوكتيل الكشف عن EdU.احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في الظلام وأجهزة الطرد المركزي في 250 مرة G لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السوبر ناتانت واغسله بملليلتر واحد من محلول غسل الصابونين. كرر الغسيل مرتين ، وتخلص من supernatant وأعد تعليق كريات الخلايا في 20 إلى 50 ميكرولتر من PBS.قبل تشغيل الجهاز ، أفرغ زجاجة سائل النفايات وتحقق من مستويات SpeedBeads والمعقم والمنظف ومزيل الفقاعات وغمد السوائل الكافية. بعد تشغيل الجهاز وبرنامج التصوير ، انقر فوق زر بدء التشغيل لتهيئة الموائع ومعايرة النظام. اضبط التكبير على 40 مرة واضبط سرعة الانسيابية على منخفضة.بعد تشغيل الليزر ، قم بتشغيل ليزر 405 نانومتر لقياس EdU Pacific Blue ، و 488 نانومتر لقياس C12-FDG و 642 نانومتر لقياس Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. قم بتعيين القناة السادسة للقناة المبعثرة والقناة الأولى والقناة التاسعة للحقل الساطع. ثم ابدأ بالعينة المتوقع أن يكون لها أعلى تألق لإعداد شدة الليزر وقلب أنبوب العينة بلطف للخلط.بعد فتح غطاء الأنبوب، أدخل أنبوب العينة في قفص الاتهام. انقر فوق تحميل لبدء وفتح مؤامرة مبعثرة. بعد ذلك ، حدد منطقة الميزات ، وقم بتسطير MO1 ونسبة العرض إلى الارتفاع تسطير MO1 للمحورين X و Y على التوالي.قم بتعيين بوابة فوق نسبة العرض إلى الارتفاع تبلغ 0.5 لاستبعاد الثنائيات ومجاميع الخلايا أسفل الجانب الأيمن وعلى الجانب الأيمن ومجموعة SpeedBead على الجانب الأيسر. الآن ، افتح مخطط الرسم البياني وحدد معلم الجذر المتدرج متوسط مربع القناع واحد والقناة الأولى للمحور X. اختر المجموعة السكانية المفردة واضبط البوابة للتحديد للخلايا المركزة.افتح مخطط الرسم البياني وحدد كثافة البكسل القصوى الخام لقناة المحور X الثانية والسابعة و11. ثم اضبط قوى الليزر لليزر 488 نانومتر و 405 نانومتر و 642 نانومتر للقناة الثانية والسابعة و 11 على التوالي بحيث يكون لكل فلوروكروم قيمة بكسل قصوى خام بين 100 و 4000 لتجنب الإفراط في التشبع. اختر المجموعة المركزة لتسجيلها وانقر فوق اكتساب لقياس عينات DLBCL بإعدادات متسقة.عند تغيير العينات للقياس ، انقر فوق الرجوع لاستعادة أنبوب العينة. اضغط على تحميل لتجاهل العينة. بعد قياس جميع العينات ، قم بإيقاف تشغيل الليزر الساطع والتشتت.قم بقياس عينات التحكم بلون واحد لإنشاء مصفوفة تعويض. انقر فوق إيقاف التشغيل لإغلاق نظام التصوير. تحليل البيانات في برنامج تحليل الصور.استخدم أداة Spot Wizard الخاصة ببرنامج تحليل الصور لحساب بؤر غاما H2AX النووية وصور الخلايا الحية وقياسها كميا تلقائيا. حدد مجموعتين من الخلايا، واحدة ذات عدد نقاط مرتفع والأخرى ذات عدد نقاط منخفض لتدريب معالج البقع على مزيد من التحليل التلقائي لعدد النقاط. أظهرت طريقة قياس التدفق الخلوي في صور الخلية الواحدة زيادة إيجابية C12-FDG ، وسلبية EdU ، وإيجابية غاما H2AX ، وعدد السكان المسنين و KARPAS422.خلايا WSU-DLCL2 و OCI-LY1 ، ولكن ليس في خلايا SU-DHL6. قدم التحليل القائم على التصوير أعدادا أعلى بكثير من بؤر غاما H2AX و KARPAS422 و WSU-DLCL2 و OCI-LY1 ، ولكن ليس في خلايا SU-DHL6. ومثلت نتائج مماثلة ببيانات التواتر والقياس الكمي.تعد إضافة الصابونين إلى تعليق الخلية أمرا بالغ الأهمية ، وإلا فلن تتمكن الأجسام المضادة من الوصول إلى المستضدات الداخلية للخلية وتؤدي المنظفات القاسية إلى فقدان إشارة C12-FTG يعد قياس الخلايا التصويري مثاليا لتحليل التغيرات في توطين العلامات مثل نقل عامل النسخ إلى النواة استجابة لبعض المحفزات. يمكن أيضا تحقيق مثل هذا التحليل باستخدام بروتوكولنا. تسمح هذه الطريقة بتصور علامات الفلورسنت المتعددة على مستوى خلية واحدة مما يساعد على اكتشاف وجود الإشارات الفردية وكثافتها وتوطينها.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

تدفق المخدرات على أساس الخلوي فحص النظام لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تعزز التمايز الخلوي للخلايا الجذعية جليوبلاستوما

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

التصوير التصوير المقطعي المتعدد الوسائط طرحه والانبعاثات Positronic التصوير المقطعي/الحسابية للورم النخاعي المتعدد تكثيفها نخاع العظام في الفئران وتد

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

الكشف عن تطور ورم الرئة في الفئران عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

في فيفو استهداف الخلايا السرطانية البشرية Xenografted مع وظيفية السيليكا النانوية في حمار وحشي

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

تصوير الفلورا المناعية لتلف الحمض النووي وإصلاح البؤر في خلايا سرطان القولون البشري

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

مسبار β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة الفلورية الحمراء البعيدة لتحديد وإثراء الخلايا السرطانية الهرمة عن طريق قياس التدفق الخلوي

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

نمذجة ورم خبيث في الدماغ عن طريق حقن الشريان السباتي الداخلي للخلايا السرطانية

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

مقايسة ربط بروتين سطح الخلية القائمة على قياس التدفق الخلوي لتقييم انتقائية وخصوصية أبتامير مضاد للسرطان

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

زرع تقويم العظام للخلايا السرطانية المشتقة من المريض في الفئران يلخص سرطان القولون والمستقيم المتقدم

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...