Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af et tilskud til Yong Yu fra Johannes Kepler University Linz (BERM16108001).

1. DLBCL-cellelinjer med mafosfamid- eller daunorubicinbehandling for at inducere cellulær ældning
BEMÆRK: Protokollen virker også for vedhængende kræftceller. Afhængigt af cellestørrelse × frø 1-2 105 celler i en brønd af en 6-brøndplade og inkuberer pladen i en 5% CO2, 37 ° C inkubator natten over før behandling. Protokoltrinnene er de samme som for suspensionsceller, men med to undtagelser. Først skal celler prøves af pladen efter trin 3....

<ol>
	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication.">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li><li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness.">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li><li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence.">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).</li><li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer.">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li><li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype:+one+in+vivo+reality,+two+possible+definitions.">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li><li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer+and+aging.">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li><li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development.">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li><li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+senescence:+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer.">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

Denne metode undersøgte ældnings-indtastningsevnen for fire forskellige DLBCL-cellelinjer ved kemoterapibehandling med lysfeltbilleddannelse og flowcytometribaseret kvantificering. På enkeltcelleniveau påviste vi med succes større C12FDG+EdU-Ki67+ senescent populationer i behandlede KARPAS422- og WSU-DLCL2-celler og i mindre grad i OCI-LY1-celler, mens SU-DHL6-cellelinjen var resistent over for behandlingen. Forskellen i ældnings-indtastningsevne blandt cellelinjer kan fo...

En række stimuli kan udløse cellulær ældning, hvilket får celler til at komme ind i en tilstand af stabil cellecyklusstop. Disse stimuli omfatter iboende signalændringer eller ydre belastninger. Iboende signaler omfatter progressiv telomerforkortelse, ændringer i telomerstruktur, epigenetisk modifikation, proteostaseforstyrrelser, mitokondrie dysfunktion og aktivering af onkogener. Ydre belastninger omfatter inflammatoriske og / eller vævsskadesignaler, stråling eller kemisk behandling og ernæringsmæssig deprivation 1,2,3,4. Blandt forskellige typer ældning er de mest almindeligt sete og velundersøgte replikativ ældning, onkogeninduceret ældning (OIS), strålingsinduceret ældning og terapiinduceret ældning (TIS). OIS er et akut cellulært respons på genotoksisk skade forårsaget af replikativ stress genereret af afvigende onkogen aktivering og kan til en vis grad forhindre den patologiske progression fra en præneoplastisk læsion til en fuldblæst tumor. TIS sker, når tumorceller er stresset af kemoterapeutiske lægemidler eller ioniserende stråling 5,6.
Ældning betragtes som et tveægget sværd i patologi på grund af dets meget dynamiske natur. Det blev oprindeligt beskrevet som en gavnlig tumorundertrykkende mekanisme til at fjerne beskadigede celler fra den cirkulerende pool af delende celler, beskytte organernes normale funktion og hæmme tumorvækst 7,8,9. Imidlertid har nye beviser antydet en mørk side af ældning. Senescente celler udskiller proinflammatoriske cytokiner, kendt som ældningsassocieret sekretorisk fænotype (SASP), hvilket fører til fibrose og funktionsfejlsorganer og fremmer tumorinitiering og progression10. Desuden gennemgår senescente kræftceller epigenetisk og genekspressionsomprogrammering parallelt med kromatinombygning og aktivering af et vedvarende DNA-skaderespons (DDR)11,12, der for nylig har erhvervet nye kræft-stamcelleegenskaber3. Selvom ældningskompatible tumorer reagerer bedre på terapeutisk intervention sammenlignet med ældnings-uundgåelige13, kan persistensen af senescente celler føre til en dårlig langsigtet prognose, hvis de ikke effektivt identificeres og elimineres af senolytiske lægemidler5. Uanset hvad er en pålidelig metode til vurdering af ældning af betydelig klinisk interesse, ikke kun for prognosen for terapibehandling, men også for udviklingen af nye strategier rettet mod senescente celler.
Uanset forskellige udløsere udviser senescente celler nogle fælles træk, herunder forstørret, fladt, multinukleeret morfologi med store vakuoler, signifikant udvidede kerner, dannelse af H3K9me3-rig ældningsassocieret heterochromatin (SAHF) i kernen, vedvarende akkumulering af DNA-skademarkør γH2AX-foci, aktiveret p53-p21CIP1 og Rb-p16INK4a cellecyklusregulerende mekanismer, stabil G1-cellecyklusstop, massiv induktion af SASP og forhøjet ældningsassocieret β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet14. Da ingen enkelt markør er tilstrækkelig til at definere ældning, kombineres enzymatisk farvning til SA-β-gal-aktivitet, som betragtes som guldstandarden til ældningsdetektion, normalt med immunohistokemisk farvning til H3K9me3 og Ki67 for at detektere TIS15. Imidlertid er kemisk kromogenbaseret SA-β-gal vanskelig at kvantificere. Her kombinerede vi 5-dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-galactopyranosid (C12FDG) fluorescensbaseret SA-β-gal (fSA-β-gal) detektion med immunofluorescerende farvning til γH2AX og EdU-inkorporeret DNA for at identificere C12FDG + EdU-γH2AX + senescent celler ved hjælp af det avancerede billeddannelsesflowcytometersystem, som kombinerer hastighed, følsomhed og detaljerede enkeltcellebilleder med rumlig information, der ikke kan leveres af flowcytometri og mikroskopi. Denne metode muliggør hurtig generering af billeder i høj opløsning, der muliggør positionering og kvantificering af fluorescerende signaler i celler, samtidig med at den muliggør hurtig analyse af flere prøver ved at bygge standardrørledninger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

Kemoterapeutiske lægemidler kan fremkalde uoprettelig DNA-skade i kræftceller, hvilket fører til apoptose eller for tidlig ældning. I modsætning til apoptotisk celledød er ældning et fundamentalt anderledes maskineri, der begrænser udbredelsen af kræftceller. Årtiers videnskabelige undersøgelser har afsløret de komplekse patologiske virkninger af senescente kræftceller i tumorer og mikromiljøer, der modulerer kræftceller og stromale celler. Nye beviser tyder på, at ældning er en potent prognostisk faktor under kræftbehandling, og derfor er hurtig og præcis påvisning af senescente celler i kræftprøver afgørende. Dette papir præsenterer en metode til at visualisere og detektere terapiinduceret ældning (TIS) i kræftceller. Diffuse store B-celle lymfom (DLBCL) cellelinjer blev behandlet med mafosfamid (MAF) eller daunorubicin (DN) og undersøgt for ældningsmarkøren, ældningsassocieret β-galactosidase (SA-β-gal), DNA-syntesemarkøren 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (EdU) og DNA-skademarkøren gamma-H2AX (γH2AX). Flowcytometerbilleddannelse kan hjælpe med at generere højopløsnings enkeltcellebilleder på kort tid for samtidig at visualisere og kvantificere de tre markører i kræftceller.

En kompensationsmatrix blev genereret ved hjælp af billedanalysesoftware ved at indlæse registrerede data fra enkeltfarvekontrolprøver. Som vist i supplerende figur S1 blev der påvist en ikke ubetydelig (koefficientværdi ≥ 0,1) let afsmitning fra EdU til C12FDG med krydstalekoefficientværdien 0,248, mens krydstalen blandt andre kanaler ikke var signifikant. Fire forskellige DLBCL-cellelinjer blev behandlet med 5 μg / ml MAF eller 20 ng / ml DN for at inducere cellulær ældning og ana...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Her præsenterer vi en flowcytometribaseret metode til visualisering og kvantificering af flere ældningsrelaterede markører i enkeltceller.

Samtidig billeddannelse og flowcytometribaseret påvisning af flere fluorescerende ældningsmarkører i terapiinducerede senescente kræftceller

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Denne metode kan hurtigt generere billeder i høj opløsning, der muliggør en analyse af rumlig fordeling og kvantificering af fluorescerende signaler i celler, samtidig med at den muliggør hurtig analyse af flere prøver. Celler måles ved hjælp af det avancerede billeddannelsesflowcytometrisystem, der kombinerer hastighed, følsomhed og detaljerede enkeltcellebilleder med rumlig information, der giver unikke data, der ikke kan tilvejebringes ved flowoptometri eller mikroskopi. Et vigtigt råd er at give nok celler til at etablere instrumentindstillingerne, og vi suspenderer cellerne ved den høje densitet til målingerne.Bortset fra denne dataindsamling er ligetil og ligner konventionel flowcytometri. Generer først DLBCL-cellelinjerne som beskrevet i manuskriptet. Tilsæt derefter 10 millimolar EdU-opløsning i et forhold på en til 1000 i DLBCL-cellekulturen og inkuber pladen i en 5% kuldioxidinkubator ved 37 grader Celsius i tre timer efter blanding af pladen ved blid rocking.Tag pladen ud efter inkubation og tilsæt 100 millimolar chloroquinopløsning til en endelig koncentration på 75 mikromolar. Bland ved at vugge forsigtigt og inkubere i 30 minutter. Derefter tilsættes 20 millimolar C12 FDG-opløsninger til en endelig koncentration på 20 mikromolar.Efter blid blanding inkuberes pladen i en time som tidligere demonstreret. Derefter tilsættes 100 millimolar 2-phenylethyl-beta-d-thiogalactosidopløsning ved en til 50 for at stoppe FSA beta-gal-farvningen. Og drej forsigtigt pladen for at blande.Overfør cellerne til 15 ml sterile centrifugerør og drej ved 100 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Når supernatanten er kasseret, vaskes cellerne med fire milliliter PBS og centrifugeres ved 100 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Suspender derefter cellepillerne igen i 500 mikroliter ved 4% paraformaldehydfikseringsopløsning.Efter 10 minutters inkubation ved stuetemperatur centrifugeres ved 250 gange G i fem minutter ved stuetemperatur. Supernatanten kasseres, og cellerne vaskes med fire milliliter PBS to gange og centrifugeres ved 100 gange G i fem minutter ved stuetemperatur. Efter vask kasseres supernatanten og genophængning af cellepelleten i 200 mikroliter saponinpermeabiliseringsbuffer.Overfør nu suspensionen til et nyt 1,5 ml rør og inkuber i 10 minutter ved stuetemperatur. Pellet cellerne ved 250 gange G i fem minutter ved stuetemperatur. Suspender derefter cellerne igen i 200 mikroliter primær antistofopløsning og inkuberes ved fire grader Celsius natten over i mørke.Centrifuger rørene ved 250 gange G i fem minutter ved fire grader Celsius. Kassér supernatanten og vask med 100 mikroliter saponinvaskeopløsning. Efter vask af cellerne to gange, kassér supernatanten og suspender cellepillerne igen i 500 mikroliter EdU-detektionscocktail.Inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter i mørke og centrifuger ved 250 gange G i fem minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten og vask med en milliliter saponinvaskeopløsning. Gentag vasken to gange, kassér supernatanten og suspender cellepillerne igen i 20 til 50 mikroliter PBS.Før du tænder for instrumentet, skal du tømme affaldsvæskeflasken og kontrollere niveauerne af SpeedBeads, sterilisator, rengøringsmiddel, debubbler og kappe tilstrækkelige væsker. Når du har tændt for instrumentet og billedbehandlingssoftwaren, skal du klikke på startknappen for at initialisere fluidik og systemkalibrering. Indstil forstørrelsen til 40 gange, og indstil væskehastigheden til lav.Når du har tændt for laserne, skal du tænde en 405 nanometer laser for at måle EdU Pacific Blue, 488 nanometer for at måle C12-FDG og 642 nanometer for at måle Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Indstil kanal seks til spredningskanalen, kanal et og kanal ni til lysfeltet. Start derefter med prøven, der forventes at have den højeste fluorescens for at indstille intensiteten af laserne, og vend forsigtigt prøverøret for at blande.Når du har åbnet rørlåget, skal du indsætte prøverøret på docken. Klik på Indlæs for at starte og åbne et scatter-plot. Vælg derefter området Funktioner, understreg MO1 og billedformat understreg MO1 for henholdsvis X- og Y-akserne.Indstil en port over billedformatet på 0,5 for at udelukke dubletter og celleaggregater under og på højre side og SpeedBead-populationen på venstre side. Åbn nu Histogram Plot og vælg funktionsgradientrodens gennemsnitlige kvadrat af maske et og kanal et for X-aksen. Vælg singletpopulationen, og indstil porten til at vælge for fokuserede celler.Åbn et histogramplot, og vælg rå maksimale pixelintensiteter for X-aksekanal to, syv og 11. Juster derefter lasereffekterne på 488 nanometer, 405 nanometer og 642 nanometer lasere til henholdsvis kanal to, syv og 11, så hver fluorokom har en rå maksimal pixelværdi mellem 100 og 4.000 for at undgå overmætning. Vælg den fokuserede population, der skal registreres, og klik på Anskaf for at måle DLBCL-prøverne med ensartede indstillinger.Når du ændrer prøver til måling, skal du klikke på retur for at genvinde prøverøret. Tryk på Indlæs for at kassere eksemplet. Når alle prøverne er målt, skal du slukke for lysfeltet og sprede laseren.Mål enkeltfarvekontrolprøver for at generere en kompensationsmatrix. Klik på Luk for at lukke billeddannelsessystemet. Analyser dataene i billedanalysesoftwaren.Brug Spot Wizard-værktøjet i billedanalysesoftwaren til automatisk at tælle og kvantificere nukleare gamma H2AX-foci og levende cellebilleder. Vælg to cellepopulationer, en med høj og en med lavt plettal for at træne Spot Wizard til yderligere automatisk spottællingsanalyse. Flowcytometrimetoden i enkeltcellebilleder viste øget C12-FDG-positiv, EdU-negativ, gamma H2AX-positiv, senesceret population og KARPAS422.WSU-DLCL2- og OCI-LY1-celler, men ikke i SU-DHL6-celler. Den billeddiagnostiske analyse præsenterede signifikant højere antal gamma H2AX foci og KARPAS422, WSU-DLCL2 og OCI-LY1, men ikke i SU-DHL6-celler. Lignende resultater var repræsenteret af frekvens- og kvantificeringsdata.Tilføjelse af saponin til cellesuspensionen er afgørende, ellers kan antistofferne ikke nå cellens interne antigener, og hårde vaskemidler fører til tab af C12-FTG-signal Billeddannelsescytometri er optimal til analyse af ændringer i markørlokalisering som translokation af en transkriptionsfaktor til kernen som reaktion på visse stimuli. En sådan analyse kan også opnås med vores protokol. Denne metode gør det muligt at visualisere flere fluorescerende markører på et enkeltcelleniveau, som hjælper med at detektere tilstedeværelsen, intensiteten og lokaliseringen af de enkelte signaler.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow flowcytometri-baserede stof Screening System til identifikation af små molekyler, der fremmer Celledifferentiering glioblastom stamceller

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multimodal en bioluminescerende og Positron-emissions-tomografi/edb tomografi billeddannelse af myelomatose knoglemarv Xenografts i NOG mus

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Påvisning af Protease aktivitet af fluorescerende peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Påvisning af lungetumorprogression hos mus ved ultralydsscanning

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

I Vivo Målretning af Xenografted humane kræftceller med funktionaliserede fluorescerende Silica nanopartikler i zebrafisk

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescens Imaging af DNA-skader og reparation Foci i Human Colon Cancer Cells

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-rød fluorescerende senescens-associeret β-galactosidase sonde til identifikation og berigelse af senescent tumorceller ved flow cytometri

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modellering af hjernemetastase ved intern halspulsåreinjektion af kræftceller

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Et flowcytometribaseret celleoverfladeproteinbindende assay til vurdering af selektivitet og specificitet af en anticancer aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Ortopisk implantation af patientafledte kræftceller hos mus rekapitulerer avanceret kolorektal cancer

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...