Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door een beurs aan Yong Yu van de Johannes Kepler Universiteit Linz (BERM16108001).

1. DLBCL-cellijnen met mafosfamide- of daunorubicinebehandeling om cellulaire senescentie te induceren
OPMERKING: Het protocol werkt ook voor adherente kankercellen. Afhankelijk van de celgrootte, zaad 1-2 × 105 cellen in één put van een 6-well plaat en incubeer de plaat in een 5% CO2, 37 ° C incubator 's nachts voor de behandeling. De protocolstappen zijn hetzelfde als voor suspensiecellen, maar met twee uitzonderingen. Eerst moeten cellen na stap 3.4 ...

<ol>
	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication.">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li><li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness.">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li><li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence.">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).</li><li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer.">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li><li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype:+one+in+vivo+reality,+two+possible+definitions.">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li><li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer+and+aging.">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li><li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development.">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li><li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+senescence:+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer.">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

Deze methode onderzocht het senescentie-enter vermogen van vier verschillende DLBCL-cellijnen bij chemotherapiebehandeling, met bright-field imaging en flowcytometrie-gebaseerde kwantificering. Op eencellig niveau hebben we met succes belangrijke C12FDG + EdU-Ki67 + senescente populaties gedetecteerd in behandelde KARPAS422- en WSU-DLCL2-cellen, en in mindere mate in OCI-LY1-cellen, terwijl de SU-DHL6-cellijn resistent was tegen de behandeling. Het verschil in senescentie-enter...

Een verscheidenheid aan stimuli kan cellulaire senescentie veroorzaken, waardoor cellen in een staat van stabiele celcyclusstilstand komen. Deze stimuli omvatten intrinsieke signaleringsveranderingen of extrinsieke spanningen. Intrinsieke signalen omvatten progressieve telomeerverkorting, veranderingen in de telomeerstructuur, epigenetische modificatie, proteostasestoornissen, mitochondriale disfunctie en activering van oncogenen. Extrinsieke stress omvat ontstekings- en/of weefselschadesignalen, straling of chemische behandeling en voedingsdeprivatie 1,2,3,4. Onder de verschillende soorten senescentie zijn de meest geziene en goed bestudeerde replicatieve senescentie, oncogen-geïnduceerde senescentie (OIS), door straling geïnduceerde senescentie en therapie-geïnduceerde senescentie (TIS). OIS is een acute cellulaire reactie op genotoxische schade veroorzaakt door replicerende stress gegenereerd door afwijkende oncogene activering en kan tot op zekere hoogte de pathologische progressie van een preneoplastische laesie naar een volledige tumor voorkomen. TIS treedt op wanneer tumorcellen worden belast door chemotherapeutische geneesmiddelen of ioniserende straling 5,6.
Senescentie wordt beschouwd als een tweesnijdend zwaard in de pathologie vanwege de zeer dynamische aard. Het werd aanvankelijk beschreven als een gunstig tumoronderdrukkend mechanisme om beschadigde cellen uit de circulerende pool van delende cellen te verwijderen, de normale functie van organen te beschermen en de tumorgroei te remmen 7,8,9. Opkomend bewijs suggereert echter een donkere kant van senescentie. Senescente cellen scheiden pro-inflammatoire cytokines af, bekend als senescentie-geassocieerd secretoir fenotype (SASP), wat leidt tot fibrose en slecht functionerende organen en tumorinitiatie en progressie bevordert10. Bovendien ondergaan senescente kankercellen epigenetische en genexpressie herprogrammering parallel met chromatineremodellering en activering van een aanhoudende DNA-schaderespons (DDR)11,12, waarbij nieuwe kankerstamceleigenschappen worden verworven3. Hoewel senescentie-capabele tumoren beter reageren op therapeutische interventie in vergelijking met senescentie-incapabeletumoren 13, kan de persistentie van senescente cellen leiden tot een slechte langetermijnprognose als ze niet effectief worden geïdentificeerd en geëlimineerd door senolytische geneesmiddelen5. Hoe dan ook, een betrouwbare methode om senescentie te beoordelen is van aanzienlijk klinisch belang, niet alleen voor de prognose van therapiebehandeling, maar ook voor de ontwikkeling van nieuwe strategieën gericht op senescente cellen.
Ongeacht verschillende triggers vertonen senescente cellen enkele gemeenschappelijke kenmerken, waaronder vergrote, afgeplatte, multinucleaire morfologie met grote vacuolen, aanzienlijk uitgebreide kernen, vorming van H3K9me3-rijke senescentie-geassocieerde heterochromatine (SAHF) in de kern, aanhoudende accumulatie van DNA-schademarker γH2AX foci, geactiveerd p53-p21CIP1 en Rb-p16INK4a celcyclus regulerende mechanismen, stabiele G1-celcyclusstilstand, massale inductie van SASP en verhoogde senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) activiteit14. Aangezien geen enkele marker voldoende is om senescentie te definiëren, wordt enzymatische kleuring voor SA-β-gal-activiteit, die wordt beschouwd als de gouden standaard voor senescentiedetectie, meestal gecombineerd met immunohistochemische kleuring voor H3K9me3 en Ki67 om TIS15 te detecteren. Chemische chromogene sa-β-gal is echter moeilijk te kwantificeren. Hier combineerden we 5-dodecanoylaminofluoresceïne-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) fluorescentie-gebaseerde SA-β-gal (fSA-β-gal) detectie met immunofluorescente kleuring voor γH2AX en EdU-geïncorporeerd DNA om C12FDG + EdU-γH2AX + senescente cellen te identificeren met behulp van het geavanceerde imaging flowcytometersysteem, dat de snelheid, gevoeligheid en gedetailleerde eencellige beelden combineert met ruimtelijke informatie die niet kan worden geleverd door flowcytometrie en microscopie. Deze methode maakt het mogelijk om snel beelden met een hoge resolutie te genereren, waardoor fluorescerende signalen in cellen kunnen worden gepositioneerd en gekwantificeerd, terwijl de snelle analyse van meerdere monsters mogelijk is door standaardpijpleidingen te bouwen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

Chemotherapeutische geneesmiddelen kunnen onherstelbare DNA-schade in kankercellen veroorzaken, wat leidt tot apoptose of vroegtijdige senescentie. In tegenstelling tot apoptotische celdood is senescentie een fundamenteel andere machinerie die de voortplanting van kankercellen beperkt. Tientallen jaren van wetenschappelijke studies hebben de complexe pathologische effecten van senescente kankercellen in tumoren en micro-omgevingen onthuld die kankercellen en stromale cellen moduleren. Nieuw bewijs suggereert dat senescentie een krachtige prognostische factor is tijdens de behandeling van kanker, en daarom is snelle en nauwkeurige detectie van senescente cellen in kankermonsters essentieel. Dit artikel presenteert een methode om therapie-geïnduceerde senescentie (TIS) in kankercellen te visualiseren en te detecteren. Diffuse grote B-cellymfoom (DLBCL) cellijnen werden behandeld met mafosfamide (MAF) of daunorubicine (DN) en onderzocht op de senescentiemarker, senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal), de DNA-synthesemarker 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) en de DNA-schademarker gamma-H2AX (γH2AX). Flowcytometer beeldvorming kan helpen bij het genereren van hoge resolutie eencellige beelden in een korte periode van tijd om tegelijkertijd de drie markers in kankercellen te visualiseren en te kwantificeren.

Een compensatiematrix werd gegenereerd met behulp van beeldanalysesoftware door het laden van geregistreerde gegevens van eenkleurige controlemonsters. Zoals te zien is in aanvullende figuur S1, werd een niet-verwaarloosbare (coëfficiëntwaarde ≥ 0,1) lichtoverloop van EdU naar C12FDG gedetecteerd met een overspraakcoëfficiëntwaarde 0,248, terwijl de overspraak tussen andere kanalen niet significant was. Vier verschillende DLBCL-cellijnen werden behandeld met 5 μg / ml MAF of 20 ng / ml ...

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Hier presenteren we een op flowcytometrie gebaseerde methode voor visualisatie en kwantificering van meerdere senescentie-geassocieerde markers in enkele cellen.

Gelijktijdige beeldvorming en flowcytometrie-gebaseerde detectie van meerdere fluorescerende senescentiemarkers in therapie-geïnduceerde senescente kankercellen

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Deze methode kan snel beelden met een hoge resolutie genereren die een analyse van de ruimtelijke verdeling en kwantificering van fluorescerende signalen in cellen mogelijk maken, terwijl een snelle analyse van meerdere monsters mogelijk is. Cellen worden gemeten met behulp van het geavanceerde imaging flow cytometry-systeem, waarbij snelheid, gevoeligheid en gedetailleerde eencellige beelden worden gecombineerd met ruimtelijke informatie die unieke gegevens oplevert die niet kunnen worden geleverd door flowsoptometrie of microscopie. Een belangrijk advies is om voldoende cellen te leveren om de instrumentinstellingen vast te stellen en we hangen de cellen op de hoge dichtheid voor de metingen.Afgezien van deze data-acquisitie is eenvoudig en vergelijkbaar met conventionele flowcytometrie. Genereer eerst de DLBCL-cellijnen zoals beschreven in het manuscript. Voeg vervolgens 10 millimolaire EdU-oplossing toe in een verhouding van één tot 1000 in de DLBCL-celcultuur en incubeer de plaat in een 5% kooldioxide-incubator bij 37 graden Celsius gedurende drie uur na het mengen van de plaat door zacht schommelen.Haal de plaat er na incubatie uit en voeg 100 millimolaire chloroquine-oplossing toe aan een uiteindelijke concentratie van 75 micromolair. Meng door zachtjes te schommelen en incubeer gedurende 30 minuten. Voeg vervolgens 20 millimol C12 FDG-oplossingen toe aan een eindconcentratie van 20 micromolair.Na voorzichtig mengen, incubeer de plaat gedurende een uur zoals eerder aangetoond. Voeg vervolgens 100 millimolar 2-fenylethyl-bèta-d-thiogalactoside-oplossing toe aan één tot 50 om de FSA beta-gal-kleuring te stoppen. En draai de plaat voorzichtig om te mengen.Breng de cellen over in steriele centrifugebuizen van 15 milliliter en draai gedurende vijf minuten op 100 maal G bij vier graden Celsius. Zodra het supernatant is weggegooid, wast u de cellen met vier milliliter PBS en centrifugeert u gedurende vijf minuten op vier graden Celsius op 100 maal G. Vervolgens suspensie de celpellets opnieuw in 500 microliter bij 4% paraformaldehyde fixatie-oplossing.Na 10 minuten incubatie bij kamertemperatuur, centrifugeer op 250 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en was de cellen tweemaal met vier milliliter PBS en centrifugeer op 100 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi na het wassen het supernatant weg en suspensieer de celpellet opnieuw in 200 microliter saponinepermeabilisatiebuffer.Breng nu de suspensie over op een nieuwe buis van 1,5 milliliter en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Pelleteer de cellen op 250 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens suspensieer de cellen opnieuw in 200 microliter primaire antilichaamoplossing en incubeer ze 's nachts bij vier graden Celsius, in het donker.Centrifugeer de buizen op 250 maal G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Gooi het supernatant weg en was met 100 microliter saponinewasoplossing. Nadat u de cellen twee keer hebt gewassen, gooit u het supernatant weg en suspenseert u de celpellets opnieuw in 500 microliter EdU-detectiecocktail.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten in het donker en centrifugeer bij 250 maal G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en was met een milliliter saponine wasoplossing. Herhaal het wassen twee keer, gooi het supernatant weg en suspensieer de celpellets opnieuw in 20 tot 50 microliter PBS.Voordat u het instrument inschakelt, leegt u de fles met afvalvloeistof en controleert u de niveaus van SpeedBeads, sterilisator, reiniger, debubbler en omhulsel voldoende vloeistoffen. Nadat u het instrument en de beeldbewerkingssoftware hebt ingeschakeld, klikt u op de opstartknop om fluidics en systeemkalibratie te initialiseren. Stel de vergroting in op 40 keer en stel de vloeistofsnelheid in op laag.Nadat u de lasers hebt ingeschakeld, schakelt u een laser van 405 nanometer in om EdU Pacific Blue te meten, 488 nanometer om C12-FDG te meten en 642 nanometer om Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX te meten. Stel kanaal zes in voor het strooikanaal, kanaal één en kanaal negen voor het heldere veld. Begin vervolgens met het monster waarvan wordt verwacht dat het de hoogste fluorescentie heeft om de intensiteit van de lasers in te stellen en draai de monsterbuis voorzichtig om te mengen.Nadat u het deksel van de buis hebt geopend, plaatst u de monsterbuis op het dock. Klik op Laden om een scatter plot te starten en te openen. Selecteer vervolgens het gebied Functies, onderstreping MO1 en beeldverhouding onderstrepen MO1 voor respectievelijk de X- en Y-as.Stel een poort boven beeldverhouding van 0,5 in om doubletten en celaggregaten onder en aan de rechterkant en de SpeedBead-populatie aan de linkerkant uit te sluiten. Open nu Histogram Plot en selecteer het functieverloopwortelgemiddelde kwadraat van masker één en kanaal één voor de X-as. Kies de singletpopulatie en stel de poort in om te selecteren op gerichte cellen.Open een histogramplot en selecteer onbewerkte maximale pixelintensiteiten voor X-askanaal twee, zeven en 11. Pas vervolgens de laservermogens van 488 nanometer, 405 nanometer en 642 nanometer lasers aan voor respectievelijk kanaal twee, zeven en 11, zodat elke fluorochroom een ruwe maximale pixelwaarde tussen 100 en 4.000 heeft om oververzadiging te voorkomen. Kies de gerichte populatie die u wilt opnemen en klik op Verwerven om de DLBCL-monsters met consistente instellingen te meten.Wanneer u monsters verwisselt voor meting, klikt u op terug om de monsterbuis te herstellen. Druk op Laden om het monster te verwijderen. Nadat alle monsters zijn gemeten, schakelt u de bright-field en scatter laser uit.Meet monsters van één kleurcontrole om een compensatiematrix te genereren. Klik op Afsluiten om het beeldverwerkingssysteem te sluiten. Analyseer de gegevens in de beeldanalysesoftware.Gebruik de Spot Wizard-tool van de beeldanalysesoftware om automatisch nucleaire gamma H2AX-foci- en live cell-afbeeldingen te tellen en te kwantificeren. Selecteer twee celpopulaties, een met hoge en een met een lage spot count om de Spot Wizard te trainen voor verdere automatische spot count analyse. De flowcytometriemethode in eencellige beelden toonde een verhoogde C12-FDG-positieve, EdU-negatieve, gamma H2AX-positieve, gesenesceerde populatie en KARPAS422.WSU-DLCL2- en OCI-LY1-cellen, maar niet in SU-DHL6-cellen. De op beeldvorming gebaseerde analyse toonde significant hogere aantallen gamma H2AX-foci en KARPAS422, WSU-DLCL2 en OCI-LY1, maar niet in SU-DHL6-cellen. Vergelijkbare resultaten werden weergegeven door frequentie- en kwantificeringsgegevens.Het toevoegen van saponine aan de celsuspensie is cruciaal, anders kunnen de antilichamen de interne antigenen van de cel niet bereiken en agressieve detergentia leiden tot verlies van C12-FTG-signaal Beeldvormingscytometrie is optimaal voor het analyseren van veranderingen in markerlokalisatie zoals translocatie van een transcriptiefactor naar de kern als reactie op bepaalde stimuli. Een dergelijke analyse kan ook worden bereikt met ons protocol. Deze methode maakt het mogelijk om meerdere fluorescerende markers op een enkelcellig niveau te visualiseren, wat helpt bij het detecteren van de aanwezigheid, intensiteit en lokalisatie van de individuele signalen.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Stroom Cytometry gebaseerde Drug Screening systeem voor de identificatie van kleine moleculen die bevordering van celdifferentiatie van Glioblastoma stamcellen

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multimodale bioluminescente en positronisch-emissie tomografie/computationele Tomography Imaging van Multiple Myeloma beenmerg Xenografts in NOG muizen

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Opsporen van Protease-activiteit door fluorescerende Peptide Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Detectie van longtumorprogressie bij muizen door echografie

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunofluorescentie beeldvorming van DNA Schade en Reparatie Foci in human Colon Kankercellen

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Verrode fluorescentie-geassocieerde β-galactosidase-sonde voor identificatie en verrijking van senescente tumorcellen door flowcytometrie

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modellering van hersenmetastase door interne halsslagaderinjectie van kankercellen

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Een flowcytometrie-gebaseerde celoppervlakeiwitbindingstest voor het beoordelen van selectiviteit en specificiteit van een antikanker aptamer

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope implantatie van patiënt-afgeleide kankercellen bij muizen recapituleert gevorderde colorectale kanker

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...