Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par une subvention à Yong Yu de l’Université Johannes Kepler de Linz (BERM16108001).

1. Lignées cellulaires du LDGCB avec traitement au mafosfamide ou à la daunorubicine pour induire la sénescence cellulaire
REMARQUE: Le protocole fonctionne également pour les cellules cancéreuses adhérentes. Selon la taille de la cellule, ensemencez 1 à 2 × 105 cellules dans un puits d’une plaque de 6 puits et incubez la plaque dans un incubateur à 5% de CO2, 37 ° C pendant la nuit avant le traitement. Les étapes du protocole sont les mêmes q...

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	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

Cette méthode a examiné la capacité d’entrée de sénescence de quatre lignées cellulaires différentes de LDGCB lors d’un traitement de chimiothérapie, avec une imagerie en champ lumineux et une quantification basée sur la cytométrie en flux. Au niveau unicellulaire, nous avons détecté avec succès d’importantes populations sénescentes C12FDG+EdU-Ki67+ dans les cellules KARPAS422 et WSU-DLCL2 traitées, et dans une moindre mesure dans les cellules OCI-LY1, tand...

Une variété de stimuli peut déclencher la sénescence cellulaire, amenant les cellules à entrer dans un état d’arrêt stable du cycle cellulaire. Ces stimuli comprennent des changements de signalisation intrinsèques ou des stress extrinsèques. Les signaux intrinsèques comprennent le raccourcissement progressif des télomères, les changements dans la structure des télomères, la modification épigénétique, les troubles de la protéostase, le dysfonctionnement mitochondrial et l’activation des oncogènes. Les stress extrinsèques comprennent les signaux de dommages inflammatoires et/ ou tissulaires, les traitements radiologiques ou chimiques et la privation nutritionnelle 1,2,3,4. Parmi les types distincts de sénescence, les plus fréquemment observés et les mieux étudiés sont la sénescence réplicative, la sénescence induite par l’oncogène (OIS), la sénescence radio-induite et la sénescence induite par la thérapie (TIS). L’OIS est une réponse cellulaire aiguë aux dommages génotoxiques causés par le stress réplicatif généré par l’activation aberrante de l’oncogène et peut dans une certaine mesure empêcher la progression pathologique d’une lésion prénéoplasique à une tumeur à part entière. TiS se produit lorsque les cellules tumorales sont stressées par des médicaments chimiothérapeutiques oudes rayonnements ionisants 5,6.
La sénescence est considérée comme une épée à double tranchant en pathologie en raison de sa nature très dynamique. Il a été initialement décrit comme un mécanisme bénéfique de suppression de tumeur pour éliminer les cellules endommagées du pool circulant de cellules en division, préservant le fonctionnement normal des organes et inhibant la croissance tumorale 7,8,9. Cependant, de nouvelles preuves ont suggéré un côté sombre de la sénescence. Les cellules sénescentes sécrètent des cytokines pro-inflammatoires, connues sous le nom de phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP), conduisant à la fibrose et aux organes défectueux et favorisant l’initiation et la progression de la tumeur10. De plus, les cellules cancéreuses sénescentes subissent une reprogrammation épigénétique et d’expression génique parallèlement au remodelage de la chromatine et à l’activation d’une réponse soutenue aux dommages à l’ADN (DDR)11,12, acquérant de nouvelles propriétés de cellules souches cancéreuses 3. Bien que les tumeurs capables de sénescence répondent mieux à l’intervention thérapeutique que les tumeurs incapables de sénescence13, la persistance des cellules sénescentes peut entraîner un mauvais pronostic à long terme si elles ne sont pas efficacement identifiées et éliminées par les médicaments sénolytiques5. Quoi qu’il en soit, une méthode fiable pour évaluer la sénescence présente un intérêt clinique important, non seulement pour le pronostic du traitement thérapeutique, mais également pour le développement de nouvelles stratégies ciblant les cellules sénescentes.
Indépendamment des différents déclencheurs, les cellules sénescentes présentent certaines caractéristiques communes, notamment une morphologie élargie, aplatie et multinucléée avec de grandes vacuoles, des noyaux significativement dilatés, la formation d’hétérochromatine associée à la sénescence (SAHF) riche en H3K9me3 dans le noyau, l’accumulation persistante de foyers de marqueurs de dommages à l’ADN γH2AX, activé p53-p21CIP1 et Rb-p16INK4a les mécanismes de régulation du cycle cellulaire, l’arrêt stable du cycle cellulaire G1, l’induction massive de SASP et l’activité élevée de la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal)14. Étant donné qu’aucun marqueur unique n’est suffisant pour définir la sénescence, la coloration enzymatique pour l’activité SA-β-gal, qui est considérée comme l’étalon-or pour la détection de la sénescence, est généralement associée à une coloration immunohistochimique pour H3K9me3 et Ki67 pour détecter TIS15. Cependant, le SA-β-gal chimique à base de chromogène est difficile à quantifier. Ici, nous avons combiné la détection de SA-β-gal (fSA-β-gal) à base de fluorescence 5-dodécanoylaminofluorescéine-di-β-D-galactopyranoside (C12FDG) à base de fluorescence SA-β-gal) avec une coloration immunofluorescente pour l’ADN incorporé à γH2AX et EdU pour identifier les cellules sénescentesC12FDG + EdU-γH2AX + à l’aide du système de cytomètre en flux d’imagerie avancée, qui combine la vitesse, la sensibilité et les images unicellulaires détaillées avec des informations spatiales qui ne peuvent pas être fournies par la cytométrie en flux et la microscopie. Cette méthode permet la génération rapide d’images haute résolution permettant le positionnement et la quantification des signaux fluorescents dans les cellules, tout en autorisant l’analyse rapide de plusieurs échantillons en construisant des pipelines standard.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

Les médicaments chimiothérapeutiques peuvent induire des dommages irréparables à l’ADN dans les cellules cancéreuses, conduisant à l’apoptose ou à la sénescence prématurée. Contrairement à la mort cellulaire apoptotique, la sénescence est une machinerie fondamentalement différente qui restreint la propagation des cellules cancéreuses. Des décennies d’études scientifiques ont révélé les effets pathologiques complexes des cellules cancéreuses sénescentes dans les tumeurs et les microenvironnements qui modulent les cellules cancéreuses et les cellules stromales. De nouvelles preuves suggèrent que la sénescence est un facteur pronostique puissant pendant le traitement du cancer, et donc une détection rapide et précise des cellules sénescentes dans les échantillons de cancer est essentielle. Cet article présente une méthode pour visualiser et détecter la sénescence induite par le traitement (TIS) dans les cellules cancéreuses. Les lignées cellulaires diffuses de lymphome à grandes cellules B (LDGCB) ont été traitées avec du mafosfamide (MAF) ou de la daunorubicine (DN) et examinées pour le marqueur de sénescence, la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal), le marqueur de synthèse de l’ADN 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) et le marqueur de dommages à l’ADN gamma-H2AX (γH2AX). L’imagerie par cytomètre en flux peut aider à générer des images unicellulaires à haute résolution en peu de temps pour visualiser et quantifier simultanément les trois marqueurs dans les cellules cancéreuses.

Une matrice de compensation a été générée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images en chargeant les données enregistrées d’échantillons de contrôle unicolores. Comme le montre la figure supplémentaire S1, un débordement de lumière non négligeable (valeur du coefficient ≥ 0,1) de l’EdU auC12FDG a été détecté avec une valeur de coefficient de diaphonie de 0,248, tandis que la diaphonie entre les autres canaux n’était pas significative. Quatre lignées cellulai...

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Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Nous présentons ici une méthode basée sur la cytométrie en flux pour la visualisation et la quantification de plusieurs marqueurs associés à la sénescence dans des cellules individuelles.

Imagerie simultanée et détection par cytométrie en flux de plusieurs marqueurs de sénescence fluorescents dans les cellules cancéreuses sénescentes induites par le traitement

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Cette méthode peut générer rapidement des images à haute résolution qui permettent une analyse de la distribution spatiale et une quantification des signaux fluorescents dans les cellules tout en permettant une analyse rapide de plusieurs échantillons. Les cellules sont mesurées à l’aide du système avancé de cytométrie en flux d’imagerie, combinant vitesse, sensibilité et images détaillées d’une cellule unique avec des informations spatiales produisant des données uniques qui ne peuvent pas être fournies par l’optométrie ou la microscopie des flux. Un conseil important est de fournir suffisamment de cellules pour établir les réglages de l’instrument et nous suspendons les cellules à haute densité pour les mesures.En dehors de cela, l’acquisition de données est simple et similaire à la cytométrie en flux conventionnelle. Générez d’abord les lignées cellulaires du LDGCB comme décrit dans le manuscrit. Ajoutez ensuite une solution d’EdU millimolaire de 10 millimolaires dans un rapport de 1 à 1000 dans la culture cellulaire DLBCL et incuber la plaque dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5% à 37 degrés Celsius pendant trois heures après avoir mélangé la plaque par bascule douce.Retirer la plaque après l’incubation et ajouter une solution de chloroquine de 100 millimolaires jusqu’à une concentration finale de 75 micromolaires. Mélanger en berçant doucement et incuber pendant 30 minutes. Ajouter ensuite 20 millimolaires de solutions de FDG C12 jusqu’à une concentration finale de 20 micromolaires.Après un mélange doux, incuber la plaque pendant une heure comme démontré précédemment. Ensuite, ajoutez 100 millimolaires de solution de 2-phényléthyl-bêta-d-thiogalactoside à un à 50 pour arrêter la coloration bêta-gal FSA. Et tournez doucement la plaque pour mélanger.Transférer les cellules dans des tubes centrifugés stériles de 15 millilitres et tourner à 100 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Une fois le surnageant jeté, lavez les cellules avec quatre millilitres de PBS et centrifugez à 100 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, re-suspendez les granulés cellulaires dans 500 microlitres à 4% de solution de fixation de paraformaldéhyde.Après 10 minutes d’incubation à température ambiante, centrifuger à 250 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et laver les cellules avec quatre millilitres de PBS deux fois et centrifuger à 100 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Après le lavage, jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 200 microlitres de tampon de perméabilisation à la saponine.Maintenant, transférez la suspension dans un nouveau tube de 1,5 millilitre et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Enduire les cellules à 250 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, re-suspendre les cellules dans 200 microlitres de solution d’anticorps primaires et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit, dans l’obscurité.Centrifuger les tubes à 250 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant et laver avec 100 microlitres de solution de lavage de saponine. Après avoir lavé les cellules deux fois, jetez le surnageant et remettez en suspension les granulés de cellule dans 500 microlitres de cocktail de détection EdU.Incuber à température ambiante pendant 30 minutes dans l’obscurité et centrifuger à 250 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Jeter le surnageant et laver avec un millilitre de solution de lavage de saponine. Répétez le lavage deux fois, jetez le surnageant et remettez en suspension les granulés de cellule dans 20 à 50 microlitres de PBS.Avant d’allumer l’instrument, videz la bouteille de liquide usagé et vérifiez les niveaux de SpeedBeads, de stérilisateur, de nettoyant, de débarboteur et de gaine de liquides suffisants. Après avoir allumé l’instrument et le logiciel d’imagerie, cliquez sur le bouton de démarrage pour initialiser la fluidique et l’étalonnage du système. Réglez le grossissement sur 40 fois et réglez la vitesse fluidique sur faible.Après avoir allumé les lasers, allumez un laser de 405 nanomètres pour mesurer EdU Pacific Blue, 488 nanomètres pour mesurer C12-FDG et 642 nanomètres pour mesurer Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Définissez le canal six pour le canal de dispersion, le canal un et le canal neuf pour le champ clair. Ensuite, commencez avec l’échantillon censé avoir la fluorescence la plus élevée pour mettre en place l’intensité des lasers et retournez doucement le tube d’échantillon pour mélanger.Après avoir ouvert le couvercle du tube, insérez le tube à échantillon sur la station d’accueil. Cliquez sur Charger pour démarrer et ouvrir un nuage de points. Ensuite, sélectionnez la zone Entités, le soulignement MO1 et le trait de soulignement MO1 pour les axes X et Y respectivement.Définissez une porte au-dessus du rapport hauteur / largeur de 0,5 pour exclure les doublets et les agrégats de cellules en dessous et sur le côté droit et la population SpeedBead sur le côté gauche. Maintenant, ouvrez Histogram Plot et sélectionnez le carré moyen de la racine du gradient d’entités du masque un et du canal un pour l’axe X. Choisissez la population singulet et définissez la porte à sélectionner pour les cellules ciblées.Ouvrez un tracé d’histogramme et sélectionnez les intensités maximales brutes de pixels pour les canaux deux, sept et 11 de l’axe X. Ajustez ensuite les puissances laser de 488 nanomètres, 405 nanomètres et 642 nanomètres pour les canaux deux, sept et 11 respectivement afin que chaque fluorochrome ait une valeur de pixel maximale brute comprise entre 100 et 4 000 pour éviter la sursaturation. Choisissez la population ciblée à enregistrer et cliquez sur Acquérir pour mesurer les échantillons de LDGCB avec des paramètres cohérents.Lorsque vous changez d’échantillon pour la mesure, cliquez sur retour pour récupérer le tube à échantillon. Appuyez sur Charger pour ignorer l’échantillon. Une fois tous les échantillons mesurés, éteignez le champ clair et diffusez le laser.Mesurez des échantillons de contrôle monochromes pour générer une matrice de compensation. Cliquez sur Arrêter pour fermer le système d’imagerie. Analysez les données dans le logiciel d’analyse d’images.Utilisez l’outil Spot Wizard du logiciel d’analyse d’images pour compter et quantifier automatiquement les foyers gamma nucléaires H2AX et les images de cellules vivantes. Sélectionnez deux populations de cellules, l’une avec un nombre élevé et l’autre avec un nombre de taches faible pour entraîner l’Assistant Spot à poursuivre l’analyse automatique du comptage des points. La méthode de cytométrie en flux dans les images unicellulaires a montré une augmentation de la population C12-FDG positive, EdU négative, gamma H2AX positive, sénescée et KARPAS422.Cellules WSU-DLCL2 et OCI-LY1, mais pas dans les cellules SU-DHL6. L’analyse basée sur l’imagerie a présenté un nombre significativement plus élevé de foyers gamma H2AX et KARPAS422, WSU-DLCL2 et OCI-LY1, mais pas dans les cellules SU-DHL6. Des résultats similaires ont été représentés par des données de fréquence et de quantification.L’ajout de saponine à la suspension cellulaire est crucial, sinon les anticorps ne peuvent pas atteindre les antigènes internes de la cellule et les détergents agressifs entraînent une perte du signal C12-FTG La cytométrie d’imagerie est optimale pour analyser les changements dans la localisation des marqueurs comme la translocation d’un facteur de transcription dans le noyau en réponse à certains stimuli. Une telle analyse peut également être réalisée avec notre protocole. Cette méthode permet de visualiser plusieurs marqueurs fluorescents au niveau d’une seule cellule, ce qui permet de détecter la présence, l’intensité et la localisation des signaux individuels.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Médicament à base de cytométrie en flux système de contrôle pour l’Identification de petites molécules qui favorisent la différenciation cellulaire des cellules souches de glioblastome

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multimodal bioluminescentes et émission positronique tomographie/Computational imagerie par tomographie des xénogreffes de moelle osseuse de myélome Multiple chez les souris NOG

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Détection d’activité de la protéase par Zymographie peptides fluorescents

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Détection de la progression des tumeurs pulmonaires chez les souris par imagerie par ultrasons

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Ciblage des cellules cancéreuses humaines xénograftées avec des nanoparticules de silice fluorescente fonctionnelles chez le poisson zèbre

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Imagerie d’immunofluorescence des dommages d’ADN et des foyers de réparation dans les cellules cancéreuses du côlon humain

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Sonde β-galactosidase associée à la sénescence fluorescente rouge lointain pour l’identification et l’enrichissement de cellules tumorales sénescentes par cytométrie en flux

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modélisation des métastases cérébrales par injection de cellules cancéreuses dans l’artère carotide interne

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Essai de liaison à une protéine de surface cellulaire basé sur la cytométrie en flux pour évaluer la sélectivité et la spécificité d’un aptamère anticancéreux

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

L’implantation orthotopique de cellules cancéreuses dérivées de patients chez la souris récapitule le cancer colorectal avancé

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...