Name: simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium an Yong Yu von der Johannes Kepler Universität Linz (BERM16108001) unterstützt.

1. DLBCL-Zelllinien mit Mafosfamid oder Daunrubicin Behandlung zur Induktion der zellulären Seneszenz
HINWEIS: Das Protokoll funktioniert auch für adhärente Krebszellen. Je nach Zellgröße 1-2 × 10 5 Zellen in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte einspeisen und die Platte in einem5 % CO2, 37 °C Inkubator über Nacht vor der Behandlung inkubieren. Die Protokollschritte sind die gleichen wie für Suspensionszellen, jedoch mit zwei Ausnahmen. Zuerst müss...

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	<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essence+of+senescence.">The essence of senescence.</a> Genes and Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li><li>Di Micco, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogene-induced+senescence+is+a+DNA+damage+response+triggered+by+DNA+hyper-replication.">Oncogene-induced senescence is a DNA damage response triggered by DNA hyper-replication.</a> Nature. 444 (7119), 638-642 (2006).</li><li>Milanovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Senescence-associated+reprogramming+promotes+cancer+stemness.">Senescence-associated reprogramming promotes cancer stemness.</a> Nature. 553 (7686), 96-100 (2018).</li><li>Passos, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feedback+between+p21+and+reactive+oxygen+production+is+necessary+for+cell+senescence.">Feedback between p21 and reactive oxygen production is necessary for cell senescence.</a> Molecular Systems Biology. 6 (1), 347 (2010).</li><li>Lee, S., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+nature+of+senescence+in+cancer.">The dynamic nature of senescence in cancer.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 94-101 (2019).</li><li>Toussaint, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress-induced+premature+senescence+or+stress-induced+senescence-like+phenotype:+one+in+vivo+reality,+two+possible+definitions.">Stress-induced premature senescence or stress-induced senescence-like phenotype: one in vivo reality, two possible definitions.</a> The Scientific World Journal. 2, 230-247 (2002).</li><li>Collado, M., Blasco, M. A., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+cancer+and+aging.">Cellular senescence in cancer and aging.</a> Cell. 130 (2), 223-233 (2007).</li><li>Munoz-Espin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+cell+senescence+during+mammalian+embryonic+development.">Programmed cell senescence during mammalian embryonic development.</a> Cell. 155 (5), 1104-1118 (2013).</li><li>Faget, D. V., Ren, Q., Stewart, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unmasking+senescence:+context-dependent+effects+of+SASP+in+cancer.">Unmasking senescence: context-dependent effects of SASP in cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 19 (8), 439-453 (2019).</li><li>Childs, B. G., Durik, M., Baker, D. J., van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+aging+and+age-related+disease:+from+mechanisms+to+therapy.">Cellular senescence in aging and age-related disease: from mechanisms to therapy.</a> Nature Medicine. 21 (12), 1424-1435 (2015).</li><li>Chandra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+reorganization+of+the+nuclear+landscape+in+senescent+cells.">Global reorganization of the nuclear landscape in senescent cells.</a> Cell Rep. 10 (4), 471-483 (2015).</li><li>Rodier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+DNA+damage+signalling+triggers+senescence-associated+inflammatory+cytokine+secretion.">Persistent DNA damage signalling triggers senescence-associated inflammatory cytokine secretion.</a> Nature Cell Biology. 11 (8), 973-979 (2009).</li><li>Schleich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H3K9me3-mediated+epigenetic+regulation+of+senescence+in+mice+predicts+outcome+of+lymphoma+patients.">H3K9me3-mediated epigenetic regulation of senescence in mice predicts outcome of lymphoma patients.</a> Nature Communications. 11 (1), 3651 (2020).</li><li>Di Micco, R., Krizhanovsky, V., Baker, D., d'Adda di Fagagna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+senescence+in+ageing:+from+mechanisms+to+therapeutic+opportunities.">Cellular senescence in ageing: from mechanisms to therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (2), 75-95 (2021).</li><li>Fan, D. N., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+markers+of+therapy-induced+senescence+in+cancer+cells.">Detecting markers of therapy-induced senescence in cancer cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1534, 41-52 (2017).</li><li>Schmitt, C. A., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+and+chemoresistance+in+transgenic+cancer+models.">Apoptosis and chemoresistance in transgenic cancer models.</a> Journal of Molecular Medicine. 80 (3), 137-146 (2002).</li><li>Dorr, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+lethal+metabolic+targeting+of+cellular+senescence+in+cancer+therapy.">Synthetic lethal metabolic targeting of cellular senescence in cancer therapy.</a> Nature. 501 (7467), 421-425 (2013).</li><li>Fan, D. N. Y., Schmitt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotoxic+stress-induced+senescence.">Genotoxic stress-induced senescence.</a> Methods in Molecular Biology. 1896, 93-105 (2019).</li><li>Noppe, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+flow+cytometric+method+for+measuring+senescence+associated+beta-galactosidase+activity+in+human+fibroblasts.">Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts.</a> Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).</li><li>Biran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+identification+of+senescent+cells+in+aging+and+disease.">Quantitative identification of senescent cells in aging and disease.</a> Aging Cell. 16 (4), 661-671 (2017).</li><li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets.">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740 (2021).</li><li>Gonzalez-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Munoz-Espin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo.">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li></ol>

Diese Methode untersuchte die Seneszenzeintrittsfähigkeit von vier verschiedenen DLBCL-Zelllinien unter Chemotherapie mit Hellfeldbildgebung und Durchflusszytometrie-basierter Quantifizierung. Auf Einzelzellebene konnten wir erfolgreich wichtige C 12 FDG+EdU-Ki67+ seneszente Populationen in behandelten KARPAS422- und WSU-DLCL2-Zellen und in geringerem Maße in OCI-LY1-Zellen nachweisen, während die SU-DHL6-Zelllinie resistent gegen die Behandlung war. Der Unterschied in der S...

Eine Vielzahl von Reizen kann zelluläre Seneszenz auslösen, wodurch Zellen in einen Zustand stabilen Zellzyklusstillstands eintreten. Zu diesen Reizen gehören intrinsische Signalveränderungen oder extrinsische Spannungen. Intrinsische Signale umfassen progressive Telomerverkürzung, Veränderungen der Telomerstruktur, epigenetische Modifikation, Proteostasestörungen, mitochondriale Dysfunktion und Aktivierung von Onkogenen. Extrinsische Belastungen umfassen entzündliche und/oder Gewebeschädigungssignale, Bestrahlung oder chemische Behandlung und Nahrungsentzug 1,2,3,4. Unter den verschiedenen Arten der Seneszenz sind die am häufigsten beobachteten und gut untersuchten replizierte Seneszenzenz, Onkogen-induzierte Seneszenz (OIS), strahleninduzierte Seneszenz und therapieinduzierte Seneszenz (TIS). OIS ist eine akute zelluläre Reaktion auf genotoxische Schäden, die durch replizierenden Stress verursacht werden, der durch aberrante Onkogenaktivierung erzeugt wird, und kann bis zu einem gewissen Grad das pathologische Fortschreiten von einer präneoplastischen Läsion zu einem ausgewachsenen Tumor verhindern. TIS tritt auf, wenn Tumorzellen durch Chemotherapeutika oder ionisierende Strahlung gestresstwerden 5,6.
Seneszenz gilt aufgrund ihrer hochdynamischen Natur als zweischneidiges Schwert in der Pathologie. Es wurde ursprünglich als ein nützlicher tumorunterdrückender Mechanismus beschrieben, um beschädigte Zellen aus dem zirkulierenden Pool von sich teilenden Zellen zu entfernen, die normale Funktion der Organe zu sichern und das Tumorwachstum zu hemmen 7,8,9. Neue Beweise deuten jedoch auf eine dunkle Seite der Seneszenz hin. Seneszente Zellen sezernieren proinflammatorische Zytokine, bekannt als Seneszenz-assoziierter sekretorischer Phänotyp (SASP), was zu Fibrose und fehlfunktionellen Organen führt und die Tumorentstehung und -progressionfördert 10. Darüber hinaus durchlaufen seneszente Krebszellen eine epigenetische und Genexpressions-Reprogrammierung parallel zur Chromatin-Remodellierung und Aktivierung einer anhaltenden DNA-Schadensantwort (DDR)11,12 und erwerben neue Krebs-Stammzell-Eigenschaften3. Obwohl seneszenzfähige Tumore im Vergleich zu seneszenzunfähigen Tumoren besser auf therapeutische Interventionen ansprechen13, kann die Persistenz seneszenter Zellen zu einer schlechten Langzeitprognose führen, wenn sie nicht effektiv identifiziert und durch senolytische Medikamente eliminiertwerden 5. In jedem Fall ist eine zuverlässige Methode zur Beurteilung der Seneszenz von erheblichem klinischem Interesse, nicht nur für die Prognose der Therapiebehandlung, sondern auch für die Entwicklung neuartiger Strategien für seneszente Zellen.
Unabhängig von verschiedenen Auslösern weisen seneszente Zellen einige gemeinsame Merkmale auf, darunter vergrößerte, abgeflachte, mehrkernige Morphologie mit großen Vakuolen, signifikant expandierte Kerne, Bildung von H3K9me3-reichem Seneszenz-assoziiertem Heterochromatin (SAHF) im Zellkern, persistierende Ansammlung von DNA-Schadensmarker-γH2AX-Herden, aktiviertes p53-p21CIP1 und Rb-p16INK4a Zellzyklus-Regulationsmechanismen, stabiler G1-Zellzyklus-Stillstand, massive Induktion von SASP und erhöhte Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Aktivität (SA-β-gal) 14. Da kein einzelner Marker ausreicht, um die Seneszenz zu definieren, wird die enzymatische Färbung für die SA-β-gal-Aktivität, die als Goldstandard für den Seneszenznachweis gilt, normalerweise mit einer immunhistochemischen Färbung für H3K9me3 und Ki67 kombiniert, um TIS15 nachzuweisen. Chemisch-chromogenes SA-β-gal ist jedoch schwer zu quantifizieren. Hier kombinierten wir 5-Dodecanoylaminofluorescein-di-β-D-Galactopyranosid (C 12 FDG) fluoreszenzbasierten SA-β-gal (fSA-β-gal)-Nachweis mit Immunfluoreszenzfärbung für γH2AX und EdU-inkorporierte DNA, um C12FDG+EdU-γH2AX+ seneszente Zellen mit dem fortschrittlichen bildgebenden Durchflusszytometersystem zu identifizieren, das die Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und detaillierte Einzelzellbilder mit räumlichen Informationen kombiniert, die durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie nicht bereitgestellt werden können. Diese Methode ermöglicht die schnelle Generierung von hochauflösenden Bildern, die die Positionierung und Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen innerhalb von Zellen ermöglichen, während die schnelle Analyse mehrerer Proben durch den Bau von Standardpipelines lizenziert wird.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>613407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>350509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&#946;-D-Galactopyranoside)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11590276</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroquin -diphosphat</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>C6628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleanser (Coulter Clenz)</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C10418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Daunorubicin</td>
			<td>Medchemexpress</td>
			<td>HY-13062A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Debubbler (70% Isopropanol)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>1.3704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis software (Amnis&#160;IDEAS&#160;6.3)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>CN-SW69-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and imaging software (Amnis&#160;ImageStreamX&#160;Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>100220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KARPAS</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mafosfamide cyclohexylamine</td>
			<td>Niomech</td>
			<td>D-17272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCI-LY1</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11473704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PETG (2-Phenylethyl-&#946;-D-thiogalactosid)&#160;</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>P4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>saponin</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheath</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedBead Kit for ImageStream</td>
			<td>Luminex</td>
			<td>400041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-DHL6</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WSU-DLCL2</td>
			<td>DSMZ</td>
			<td>ACC 575</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous imaging and flow-cytometry-based detection of multiple fluorescent senescence markers in therapy-induced senescent cancer cells

Chemotherapeutika können irreparable DNA-Schäden in Krebszellen induzieren, was zu Apoptose oder vorzeitiger Seneszenz führt. Im Gegensatz zum apoptotischen Zelltod ist die Seneszenz eine grundlegend andere Maschinerie, die die Ausbreitung von Krebszellen hemmt. Jahrzehntelange wissenschaftliche Studien haben die komplexen pathologischen Wirkungen von seneszenten Krebszellen in Tumoren und Mikroumgebungen aufgedeckt, die Krebszellen und Stromazellen modulieren. Neue Erkenntnisse deuten darauf hin, dass Seneszenz ein starker prognostischer Faktor während der Krebsbehandlung ist, und daher ist ein schneller und genauer Nachweis seneszenter Zellen in Krebsproben unerlässlich. Dieses Papier stellt eine Methode zur Visualisierung und zum Nachweis von therapieinduzierter Seneszenz (TIS) in Krebszellen vor. Diffuse großzellige B-Zell-Lymphom (DLBCL)-Zelllinien wurden mit Mafosfamid (MAF) oder Daunrubicin (DN) behandelt und auf den Seneszenzmarker, Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase (SA-β-gal), den DNA-Synthesemarker 5-Ethynyl-2′-Desoxyuridin (EdU) und den DNA-Schadensmarker gamma-H2AX (γH2AX) untersucht. Die Bildgebung von Durchflusszytometern kann dazu beitragen, in kurzer Zeit hochauflösende Einzelzellbilder zu erzeugen, um die drei Marker in Krebszellen gleichzeitig zu visualisieren und zu quantifizieren.

Eine Kompensationsmatrix wurde mit Hilfe von Bildanalysesoftware generiert, indem aufgezeichnete Daten von einfarbigen Kontrollproben geladen wurden. Wie in Ergänzender Abbildung S1 gezeigt, wurde ein nicht zu vernachlässigender Lichtüberlauf (Koeffizientenwert ≥ 0,1) von EdU auf C12FDG mit einem Übersprechkoeffizientenwert von 0,248 festgestellt, während das Übersprechen unter anderen Kanälen nicht signifikant war. Vier verschiedene DLBCL-Zelllinien wurden mit 5 μg/ml MAF oder 20 ng...

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Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

Diese Methode kann schnell hochauflösende Bilder erzeugen, die eine Analyse der räumlichen Verteilung und Quantifizierung von Fluoreszenzsignalen innerhalb von Zellen ermöglichen und gleichzeitig eine schnelle Analyse mehrerer Proben ermöglichen. Die Zellen werden mit dem fortschrittlichen bildgebenden Durchflusszytometriesystem gemessen, das Geschwindigkeit, Empfindlichkeit und detaillierte Einzelzellbilder mit räumlichen Informationen kombiniert, die einzigartige Daten liefern, die durch Durchflussoptometrie oder Mikroskopie nicht bereitgestellt werden können. Ein wichtiger Rat ist, genügend Zellen zur Verfügung zu stellen, um die Geräteeinstellungen festzulegen, und wir suspendieren die Zellen bei der hohen Dichte für die Messungen.Abgesehen davon ist die Datenerfassung unkompliziert und ähnelt der herkömmlichen Durchflusszytometrie. Generieren Sie zunächst die DLBCL-Zelllinien wie im Manuskript beschrieben. Dann 10 Millimolar EdU-Lösung im Verhältnis eins zu 1000 in die DLBCL-Zellkultur geben und die Platte in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius für drei Stunden inkubieren, nachdem die Platte durch leichtes Schaukeln gemischt wurde.Nehmen Sie die Platte nach der Inkubation heraus und fügen Sie 100 Millimolar Chloroquinlösung zu einer Endkonzentration von 75 Mikromolaren hinzu. Durch Schaukeln vorsichtig mischen und 30 Minuten inkubieren. Dann fügen Sie 20 Millimolar C12 FDG-Lösungen zu einer Endkonzentration von 20 Mikromolaren hinzu.Nach dem vorsichtigen Mischen die Platte wie zuvor demonstriert eine Stunde lang inkubieren. Als nächstes fügen Sie 100 Millimolar 2-Phenylethyl-beta-d-thiogalactosid-Lösung bei eins zu 50 hinzu, um die FSA-Beta-Gal-Färbung zu stoppen. Und drehen Sie die Platte vorsichtig, um zu mischen.Die Zellen werden in 15 Milliliter sterile Zentrifugenröhrchen überführt und bei 100 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius gedreht. Sobald der Überstand verworfen ist, waschen Sie die Zellen mit vier Milliliter PBS und zentrifugieren Sie bei 100 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Dann suspendieren Sie die Zellpellets in 500 Mikrolitern bei 4% Paraformaldehyd-Fixierungslösung.Nach 10-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur bei 250 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal mit vier Milliliter PBS und zentrifugieren Sie bei 100 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach dem Waschen den Überstand verwerfen und das Zellpellet in 200 Mikrolitern Saponin-Permeabilisierungspuffer erneut suspendieren.Nun die Suspension in ein neues 1,5-Milliliter-Röhrchen geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Pelletieren Sie die Zellen bei 250 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Dann suspendieren Sie die Zellen in 200 Mikrolitern primärer Antikörperlösung und inkubieren Sie bei vier Grad Celsius über Nacht im Dunkeln.Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 250 mal G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie ihn mit 100 Mikrolitern Saponin-Waschlösung. Nach zweimaligem Waschen der Zellen den Überstand verwerfen und die Zellpellets in 500 Mikrolitern EdU-Detektionscocktail erneut suspendieren.Bei Raumtemperatur 30 Minuten im Dunkeln inkubieren und bei 250 mal G fünf Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren. Den Überstand entsorgen und mit einem Milliliter Saponin-Waschlösung waschen. Wiederholen Sie das Waschen zweimal, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellpellets in 20 bis 50 Mikrolitern PBS.Bevor Sie das Gerät einschalten, leeren Sie die Abfallflüssigkeitsflasche und überprüfen Sie den Füllstand von SpeedBeads, Sterilisator, Reiniger, Entstapler und Hülle ausreichend Flüssigkeiten. Nachdem Sie das Instrument und die Bildgebungssoftware eingeschaltet haben, klicken Sie auf die Startschaltfläche, um die Fluidik und die Systemkalibrierung zu initialisieren. Stellen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache und die Fluidgeschwindigkeit auf niedrig ein.Schalten Sie nach dem Einschalten der Laser einen 405-Nanometer-Laser ein, um EdU Pacific Blue zu messen, 488 Nanometer zur Messung von C12-FDG und 642 Nanometer zur Messung von Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX. Stellen Sie Kanal sechs für den Streukanal, Kanal eins und Kanal neun für das Hellfeld ein. Beginnen Sie dann mit der Probe, von der erwartet wird, dass sie die höchste Fluoreszenz aufweist, um die Intensität der Laser einzustellen, und drehen Sie das Probenröhrchen vorsichtig um, um es zu mischen.Nach dem Öffnen des Röhrchendeckels setzen Sie das Probenröhrchen in das Dock ein. Klicken Sie auf Laden, um ein Punktdiagramm zu starten und zu öffnen. Wählen Sie als Nächstes den Bereich Features, unterstreichen Sie MO1 und unterstreichen Sie das Seitenverhältnis MO1 für die X- bzw. Y-Achse.Legen Sie ein Gate über dem Seitenverhältnis von 0,5 fest, um Dubletten und Zellaggregate unterhalb und auf der rechten Seite und die SpeedBead-Population auf der linken Seite auszuschließen. Öffnen Sie nun Histogrammdiagramm und wählen Sie das Merkmalsverlaufs-Wurzelmittelquadrat von Maske eins und Kanal eins für die X-Achse aus. Wählen Sie die Singulettpopulation aus und legen Sie das Tor so fest, dass es für fokussierte Zellen ausgewählt wird.Öffnen Sie ein Histogrammdiagramm und wählen Sie rohe maximale Pixelintensitäten für die X-Achsenkanäle zwei, sieben und 11 aus. Stellen Sie dann die Laserleistungen von 488 Nanometern, 405 Nanometern und 642 Nanometern für Kanal zwei, sieben und 11 so ein, dass jedes Fluorochrom einen rohen maximalen Pixelwert zwischen 100 und 4.000 hat, um eine Übersättigung zu vermeiden. Wählen Sie die fokussierte Population aus, die aufgezeichnet werden soll, und klicken Sie auf Erfassen, um die DLBCL-Stichproben mit konsistenten Einstellungen zu messen.Wenn Sie die Proben für die Messung wechseln, klicken Sie auf Zurück, um das Probenröhrchen wiederherzustellen. Drücken Sie Load, um die Probe zu verwerfen. Nachdem alle Proben gemessen wurden, schalten Sie den Hellfeld- und Streulaser aus.Messen Sie einzelne Farbkontrollmuster, um eine Kompensationsmatrix zu erstellen. Klicken Sie auf Herunterfahren, um das Imaging-System zu schließen. Analysieren Sie die Daten in der Bildanalysesoftware.Verwenden Sie den Spot Wizard der Bildanalysesoftware, um nukleare Gamma-H2AX-Foci- und Lebendzellenbilder automatisch zu zählen und zu quantifizieren. Wählen Sie zwei Zellpopulationen aus, eine mit hoher und eine mit niedriger Punktzahl, um den Spot-Assistenten für die weitere automatische Spot-Count-Analyse zu trainieren. Die Durchflusszytometrie-Methode in Einzelzellbildern zeigte erhöhte C12-FDG-positive, EdU-negative, gamma-H2AX-positive, seneszierte Population und KARPAS422.WSU-DLCL2- und OCI-LY1-Zellen, jedoch nicht in SU-DHL6-Zellen. Die bildgebende Analyse zeigte signifikant höhere Zahlen von gamma-H2AX-Herden und KARPAS422, WSU-DLCL2 und OCI-LY1, jedoch nicht in SU-DHL6-Zellen. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Häufigkeits- und Quantifizierungsdaten dargestellt.Die Zugabe von Saponin zur Zellsuspension ist entscheidend, da die Antikörper sonst die zellinternen Antigene nicht erreichen können und aggressive Reinigungsmittel zum Verlust des C12-FTG-Signals führen Die bildgebende Zytometrie ist optimal für die Analyse von Veränderungen der Markerlokalisation wie der Translokation eines Transkriptionsfaktors in den Zellkern als Reaktion auf bestimmte Reize. Eine solche Analyse kann auch mit unserem Protokoll erreicht werden. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung mehrerer fluoreszierender Marker auf Einzelzellebene, wodurch das Vorhandensein, die Intensität und die Lokalisierung der einzelnen Signale erkannt werden können.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Flow Cytometry-based Drug Screening System for the Identification of Small Molecules That Promote Cellular Differentiation of Glioblastoma Stem Cells

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Glioblastoma (GBM) is the most common and most lethal primary brain tumor in adults, causing roughly 14,000 deaths each year in the U.S. alone. Median ...

Forschung

Krebsforschung

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multimodale Biolumineszenz und Positronic-Emissions-Tomographie/Computational Tomographie Bildgebung des multiplen Myeloms Knochenmark Xenotransplantate NOG Mäuse

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Detection of Lung Tumor Progression in Mice by Ultrasound Imaging

Nachweis der Lungentumorprogression bei Mäusen durch Ultraschall-Bildgebung

With ~1.6 million victims per year, lung cancer contributes tremendously to the worldwide burden of cancer. Lung cancer is partly driven by genetic ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

In Vivo Targeting von xenografierten menschlichen Krebszellen mit funktionalisierten fluoreszierenden Kieselsäure-Nanopartikeln in Zebrafischen

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Immunofluorescence Imaging of DNA Damage and Repair Foci in Human Colon Cancer Cells

Immunfluoreszenz Bildgebung von DNA-Schäden und Reparatur-Fozien in menschlichen Darmkrebszellen

The purpose of the manuscript is to provide a step-by-step protocol for performing immunofluorescence microscopy to study the radiation-induced DNA damage ...

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated ÃƒÅ½Ã‚Â²-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Modeling Brain Metastasis by Internal Carotid Artery Injection of Cancer Cells

Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von Krebszellen in die innere Halsschlagader

Brain metastasis is a cause of severe morbidity and mortality in cancer patients. Critical aspects of metastatic diseases, such as the complex neural ...

A Flow Cytometry-Based Cell Surface Protein Binding Assay for Assessing Selectivity and Specificity of an Anticancer Aptamer

Ein auf Durchflusszytometrie basierender Zelloberflächenproteinbindungsassay zur Beurteilung der Selektivität und Spezifität eines Antikrebs-Aptamers

A key challenge in developing an anticancer aptamer is to efficiently determine the selectivity and specificity of the developed aptamer to the target ...

Orthotopic Implantation of Patient-Derived Cancer Cells in Mice Recapitulates Advanced Colorectal Cancer

Orthotope Implantation von patienteneigenen Krebszellen in Mäusen rekapituliert fortgeschrittenen Darmkrebs

Over the last decade, more sophisticated preclinical colorectal cancer (CRC) models have been established using patient-derived cancer cells and 3D ...